石磊 謝紅炬 廖俊琳 方衛(wèi)婷 尹瀚

【摘要】脂肪組織已經(jīng)成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)中一個(gè)很有吸引力的細(xì)胞來源。但單純的脂肪填充，脂肪存活率不高，后期吸收快，導(dǎo)致填充很難具備理想的效果。脂肪干細(xì)胞膠（SVF-gel）以及富血小板血漿（PRP）的衍生物：脂肪源性干細(xì)胞（ADSCs）、血小板源性生長因子（PDGF ）、轉(zhuǎn)化生長因子-表皮生長因子（TGF-EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子（EGF）通過旁分泌和分化機(jī)制在組織移植時(shí)中表現(xiàn)出強(qiáng)大的再生潛力。故本文針對(duì)此方式在脂肪填充中的作用機(jī)制、以及可能出現(xiàn)的問題和應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】脂肪干細(xì)胞膠；富血小板血漿； 脂肪填充；脂肪源性干細(xì)胞

【中圖分類號(hào)】R62 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-5249（2021）08-0003-03

Application progress of SVF-gel combined with PRP injection in fat filling

Shi Lei Xie Hongju△ Liao Junlin Fang Weiting Yin Han

Department of Plastic Surgery， The First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421000，China

【Abstract】Adipose tissue has become an attractive cell source in tissue engineering and regenerative medicine. However， simple fat filling has a low fat survival rate and fast absorption in the later stage， which makes it difficult for the filling to have the desired effect. Derivatives of adipose stem cell gel （SVF-gel） and platelet rich plasma （PRP）： adipose-derived stem cells （ADSCs）， platelet-derived growth factor （PDGF）， transforming growth factor-epidermal growth factor （TGF-EGF）， blood Endothelial growth factor （VEGF） and epidermal growth factor （EGF） show strong regeneration potential during tissue transplantation through paracrine and differentiation mechanisms. Therefore， this article reviews the mechanism of action of this method in fat filling， as well as possible problems and application prospects.

【Key words】adipose stem cell glue； platelet rich plasma； fat filling； adipose-derived stem cells

脂肪移植在世界范圍內(nèi)被廣泛用于重建或美容目的，主要由于其豐富的來源，易于獲取，創(chuàng)傷性小的特點(diǎn)。脂肪移植根據(jù)需要的體積可以分為3類。“3類”分別是小體積脂肪移植（<100 mL）、中體積脂肪移植（100～200 mL）和大體積脂肪移植（>300 mL）。單純脂肪移植存活率低，脂肪易液化壞死或者形成結(jié)節(jié)囊腫。因此，脂肪移植術(shù)后不滿意的保留率導(dǎo)致了不可預(yù)測的結(jié)果，隨后的多次手術(shù)，甚至?xí)a(chǎn)生并發(fā)癥[1]。

目前，多種移植方法已被提出以提高面部脂肪移植的效果，其中脂肪來源干細(xì)胞（Adipose-derived Stem Cell Glue，ADSCs）的SVF-gel脂肪膠聯(lián)合PRP注射就是其中的具有代表性的方法，在整形外科領(lǐng)域中得到了十分有效的應(yīng)用 [2]。目前還沒有證據(jù)表明脂肪移植的最佳供體位置，但下腹和大腿內(nèi)側(cè)含有密度更高的脂肪來源干細(xì)胞[3]。此外，與腹腔分離的ADSCs相比，大腿分離的ADSCs具有更強(qiáng)的成脂和血管生成潛能，且過氧化物酶體增殖活化受體g2 （PPARg2）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）表達(dá)更高。對(duì)于脂肪填充而言，絕大多數(shù)是因?yàn)橄忍旖Y(jié)構(gòu)性的容量凹陷或者機(jī)體老化后脂肪的吸收和流失，單純的脂肪提取注射對(duì)于這兩種脂肪缺失都很難產(chǎn)生刺激脂肪再生的因子，因此，采取具有刺激組織再生功能的SVF以及PRP的聯(lián)合注射脂肪膠更能在短期時(shí)間提高填充脂肪的活性，從而提高脂肪的保留率[4]。

1 SVF-gel與PRP的作用和制備

1.1 SVF-gel的來源以及作用

脂肪干細(xì)胞膠（Adipose-derived Stem Cell Glue，SVFgel）是一種通過物理手段獲得的富含ADSCs、血管內(nèi)皮細(xì)胞（Vascular endothelial cell ，VECs）和天然脂肪細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的可注射的混合組織[5]。這些ADSCs通過成脂和血管分化在脂肪組織再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并表達(dá)血管生成、抗凋亡和抗氧化因子，從而刺激血管再生，并且在后期脂肪形成和組織重塑中也發(fā)揮著重要作用[6]。SVF-gel脂肪膠高濃縮的SVF成分以及高濃度的ADSCs和血管內(nèi)皮生長因子使得移植物再物理應(yīng)激和缺氧損傷中更易存活。

SVF-gel的制備：大腿或者腹壁等部位用含0.001%腎上腺素的腫脹液浸潤。用內(nèi)徑2.5 mm的套管進(jìn)行抽脂。抽脂液放入離心機(jī)，以1200 G的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)3 min。離心后，將中層脂肪移植物保留（Coleman 脂肪）。再通過以10 ml/s的速度在兩個(gè)常規(guī)的一次性注射器之間以內(nèi)徑1.4 mm的雙側(cè)潤滑鎖接頭連接，以1 min的速度進(jìn)行機(jī)械乳化。將乳化后的Coleman 脂肪在封閉腔內(nèi)通過500 mm可移動(dòng)網(wǎng)過濾，并以2000 G離心3 min，油層下的粘性物質(zhì)即為SVF-gel。

1.2 PRP的來源以及作用

富血小板血漿（platelet-rich plasma ，PRP）是一種基于血小板愈合特性的自體生物療法，目前治療歷史已有25年。PRP含有周顆粒，活化后可釋放多種生長因子，如血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-表皮生長因子（Transforming growth factorepidermal growth factor，TGF-EGF）、VEGF、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等。近年來，PRP治療范圍已從骨再生、創(chuàng)面愈合、肌肉骨骼損傷愈合擴(kuò)展到提高脂肪移植物存活率[7]。近年來發(fā)現(xiàn)PRP的應(yīng)用相較于干細(xì)胞、外用生長因子等更實(shí)用、安全。

PRP的制備：對(duì)于抽取的靜脈血采用二次離心法，首次離心采取實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)130 G/5 min，獲得初次提純的懸濁液，再次采400 G/15 min，去除上清液（PPP），收集濃縮的PRP，混合激活劑10 %CaCl2，裝入27 G注射針頭的1 mL注射器中待用。

2 SVF-gel聯(lián)合PRP注射在脂肪填充的作用機(jī)制

2.1 促進(jìn)脂肪組織再生

脂肪移植物至少包含兩組細(xì)胞：成熟脂肪細(xì)胞和基質(zhì)血管部分?；|(zhì)血管部分是一個(gè)異質(zhì)細(xì)胞群，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞、白細(xì)胞、肥大細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞和多功能脂肪來源干細(xì)胞（ADSCs）。成熟脂肪細(xì)胞對(duì)缺血環(huán)境敏感，它們?nèi)菀滓夯劳龌蛉シ只?。如果建立了足夠的血管供?yīng)，去分化的脂肪細(xì)胞可以重新分化為成熟的脂肪細(xì)胞[8]。前脂肪細(xì)胞和ADSCs的增殖和分化也與脂肪移植物的存活有關(guān)。手術(shù)植入后，脂肪移植物最初是通過血漿中的營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散而存活的。而SVF-gel是通過提純離心處理后的中小顆粒的脂肪團(tuán)混合物，因此，相較于未經(jīng)過處理的大脂肪團(tuán)，小顆粒的SVF-gel更易存活，因?yàn)楦〉囊浦参锉砻娣e體積比會(huì)導(dǎo)致更大的面積與血管床的接觸。隨后，通常在移植后48小時(shí)就出現(xiàn)的新生血管將開始為脂肪移植物提供營養(yǎng)。大的脂肪移植物表現(xiàn)出更高的液化、壞死和囊腫形成，特別是在脂肪團(tuán)中心部，由于較差的營養(yǎng)從血漿擴(kuò)散和不充分的新生血管形成到中部更易形成液化或者結(jié)節(jié)。

此外加入激活劑CaCl2會(huì)導(dǎo)致PRP內(nèi)的凝血酶原形成自體凝血酶，并最終形成疏松的纖維蛋白基質(zhì)，從而纏住生長因子，導(dǎo)致生長因子在7天內(nèi)緩慢分泌。這種方法在臨床上應(yīng)用最多的是PRP脂肪移植。PRP對(duì)脂肪移植物的存活和保留有積極的影響，因?yàn)樗梢愿纳艫DSCs的增殖和分化，減少炎癥，并改善血管生成[9]。

體外研究表明，PRP增強(qiáng)了ADSC的增殖和分泌功能，從而改善了脂肪移植物的保留。并且PRP和ADSCs在嚙齒動(dòng)物中聯(lián)合使用時(shí)具有協(xié)同作用，聯(lián)合使用比單獨(dú)使用時(shí)具有更好的保留效果[10]。

2.2 促進(jìn)再血管化

ADSC已被證明可以促進(jìn)體內(nèi)新生血管形成和組織再生。脂肪組織是體內(nèi)干細(xì)胞濃度最高的組織之一，每克脂肪約有5X103個(gè)ADSCs[11]。在傷口愈合方面，ADSCs可能通過可溶性介質(zhì)旁分泌促進(jìn)抗炎和促血管生成功能，SVF還含有造血細(xì)胞系細(xì)胞、成熟內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和白細(xì)胞，它們都在傷口愈合中發(fā)揮作用[12]。

此外，體外培養(yǎng)的ADSCs也被證明能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)，這表明它在傷口愈合的血管生成階段具有潛在的重要作用。ADSCs也被證明有分化成內(nèi)皮細(xì)胞的潛力，進(jìn)而形成毛細(xì)血管，這是血管生成的關(guān)鍵一步。體外研究表明，當(dāng)PRP和ADSCs聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)，血管網(wǎng)的生長增加。對(duì)小鼠的研究也表明，與PRP聯(lián)合移植的脂肪增加了脂肪組織的新血管生成。PRP已被證明可以促進(jìn)ADSCs分化為成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞，它們?cè)趥谟线^程中是至關(guān)重要的細(xì)胞[13]。PRP還能促進(jìn)成纖維細(xì)胞向創(chuàng)傷部位遷移，與PRP培養(yǎng)的ADSCs表達(dá)MMP-1和MMP-2等參與組織重塑的基因，提示對(duì)創(chuàng)面愈合以及血管再生有益[14]。

2.3 提高移植物耐受性

Siegel[15]等研究表明，保留在纖維蛋白凝塊中的ADSCs顯示VEGF和FGF的分泌持續(xù)升高，同時(shí)ADSCs對(duì)VEGF的免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，提示纖維蛋白凝塊與干細(xì)胞之間存在協(xié)同作用。PRP還含有細(xì)胞粘附分子纖連蛋白，它們幫助固定纖維蛋白中的生長因子，并幫助纖維蛋白支架作為上皮遷移的基質(zhì)。當(dāng)ADSCs在體外含有黏附分子和PRP中發(fā)現(xiàn)的生長因子的支架上生長時(shí)，它們顯示出角質(zhì)形成細(xì)胞分化增加，這表明對(duì)傷口愈合的益處增強(qiáng)。在體外也顯示，當(dāng)與ADSCs共同培養(yǎng)時(shí)，大部分血小板在10天內(nèi)仍保持活性，這表明一種可能增強(qiáng)愈合潛力的雙邊促生存關(guān)系[16]。

2.4 提高抗炎能力

PRP具有抗炎特性，可以減少炎癥和腫脹，從而促進(jìn)脂肪移植物的存活。 PRP中肝細(xì)胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）和腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）濃度的增加可能通過下調(diào)促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-kB發(fā)揮重要的抗炎作用，提高共同培養(yǎng)細(xì)胞的存活率。與PRP共培養(yǎng)的ADSCs分泌較低的趨化因子濃度，而PRP也加強(qiáng)了ADSCs中強(qiáng)促炎基因IL-1B的下調(diào)，兩者均提示具有抗炎作用。用PRP培養(yǎng)的ADSCs也顯示出增強(qiáng)的吞噬能力，這表明在炎癥愈合階段發(fā)揮作用[17]。PRP通過下調(diào)細(xì)胞死亡介質(zhì)mRNA蛋白和抑制促凋亡基因來減少前脂肪細(xì)胞的凋亡，以及上調(diào)ADSCs的成脂基因表達(dá)，從而提高移植后脂肪的存活能力。

3 目前面臨的問題和前景

目前對(duì)于SVF-gel以及PRP對(duì)脂肪填充的存活率的提高基本達(dá)成了共識(shí)，但是依然面臨很多亟待解決的問題：具體如下。

（1）PRP的離心速度問題，特別是對(duì)于第二次離心速度存在爭議，目前可以肯定在200 G～1000 G之間調(diào)整轉(zhuǎn)數(shù)，但是對(duì)于PRP提取活性的最佳轉(zhuǎn)數(shù)仍然存在較大疑問。

（2）SVF-gel的提純需要經(jīng)過脂肪組織的洗滌、膠原酶消化、離心分離SVF的過程，這個(gè)過程耗時(shí)較久，流程相對(duì)復(fù)雜，也并沒有實(shí)現(xiàn)國際的標(biāo)準(zhǔn)化。

（3）對(duì)于SVF-gel以及PRP的保存以及運(yùn)輸缺乏安全有效的實(shí)施手段，對(duì)于短時(shí)間的保存可以達(dá)到預(yù)期活性，很難實(shí)現(xiàn)較長時(shí)間的保存功能。

（4）對(duì)于下頦、鼻背部等需要支撐性結(jié)構(gòu)的填充時(shí)，單純的SVF-gel注射后期往往效果不佳，并不是容量問題，而是支撐力不夠，如何利用好SVF-gel、prp的同時(shí)，對(duì)于脂肪組織中的脂肪基質(zhì)復(fù)合體（AMC）應(yīng)該靈活運(yùn)用起來，從而增加組織的支撐力。未來對(duì)于SVF-gel聯(lián)合PRP注射的存活率的判定將更加精準(zhǔn)，應(yīng)用方向也將逐漸拓展到面部、胸部、私密等眾多其他領(lǐng)域。

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