劉文佳,劉宗凱,初曉蘇,劉寨東

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250035；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250035)

肺癌是臨床發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響患者的身心健康，并給患者家庭及社會造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。2014年的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國新發(fā)肺癌病例78.1萬，且同期病死率達(dá)80%[2]。肺癌患者初期往往沒有特異性臨床癥狀，57%的肺癌患者就診時(shí)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最常見的靶組織是骨骼，常引起病理性骨破壞、骨折、疼痛等[4]。因此，探究肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中存在的作用機(jī)制具有重要意義。

從近年研究報(bào)道來看，中藥在治療腫瘤方面的效果較好，多項(xiàng)研究證實(shí)中藥能夠有效影響腫瘤細(xì)胞的生長增殖、凋亡、侵襲及遷移[5]。中藥山慈菇具有清熱解毒、化痰散結(jié)功效，現(xiàn)代藥理學(xué)證明山慈菇具有多種生物堿，有較強(qiáng)的抗癌活性[6]。有研究在統(tǒng)計(jì)1374次惡性腫瘤病案中發(fā)現(xiàn)，使用頻次最高的是山慈菇，其使用頻率為77.29 %[7]。王不留行具有活血消腫功效，與山慈菇同用表現(xiàn)出對多種腫瘤的抑制作用[8]。

中藥往往是多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用而發(fā)揮療效，因此其機(jī)理較難詮釋，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性、動(dòng)態(tài)性與中醫(yī)整體觀念吻合，因此近年有不少學(xué)者利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對中醫(yī)藥進(jìn)行研究。本次通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)方法探討山慈菇-王不留行這一藥對在肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中的分子作用機(jī)制，以期為本病的治療提供新的思路與方法。

1 資料與方法

1.1 疾病靶基因預(yù)測 以“肺癌”“骨轉(zhuǎn)移瘤”作為關(guān)鍵詞，采用疾病基因數(shù)據(jù)庫(Database of gene-disease associations，Dis Ge NET)、人類基因數(shù)據(jù)庫(Human gene database，Gene Cards)，人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(Online mendelian inheritance in man，OMIM)，綜合型藥物數(shù)據(jù)庫(Drug bank online，Drug Bank)以及治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(Therapeutic target database，TTD)對疾病已知靶基因進(jìn)行檢索與篩選，合并各數(shù)據(jù)庫的疾病靶基因，獲得已明確的疾病靶點(diǎn)。

1.2 山慈菇-王不留行有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology databaseand analysis platform，TCMSP)以山慈菇、王不留行為關(guān)鍵詞檢索其化學(xué)成分，并以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug likeness，DL)≥0.18作為活性化合物的篩選條件，將具有較高活性的化合物篩選出來，將所得到的活性成分通過有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(Pub Chem)獲得相對應(yīng)的SMILES及2D結(jié)構(gòu)。將所得結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction及Drug Bank數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，相似性閾值取為0.85，并把人類基因型作為篩查條件。導(dǎo)入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Unitprot)進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建中藥-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 山慈菇-王不留行干預(yù)肺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)鍵靶基因篩選 將所篩選的山慈菇-王不留行潛在靶基因與肺癌及骨轉(zhuǎn)移瘤靶基因交叉映射，得出山慈菇-王不留行干預(yù)肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中的映射靶基因，借助String構(gòu)建出關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)信息，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度(Degree)值的大小進(jìn)行篩選，得到核心靶基因，所獲取的核心靶基因則是直接或間接調(diào)控肺癌骨轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵靶點(diǎn)，也就是山慈菇-王不留行干預(yù)肺癌骨轉(zhuǎn)移過程的分子作用機(jī)制。

1.4 生物通路及富集分析 將篩選出的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入基因功能注釋數(shù)據(jù)庫(Database for annotation,visualization and integrated discovery，DAVID)，進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析以及基因本體(Gene ontology，GO)生物過程的富集分析。以P≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別將篩選出的前20個(gè)GO條目與KEGG條目借助Omic Share云平臺繪制富集分析氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 疾病靶基因預(yù)測 以“l(fā)ung cancer”“metastatic tumor of bone”作為關(guān)鍵詞，通過Dis Ge NET、Gene Cards、OMIM、Drug Bank以及TTD數(shù)據(jù)庫對疾病已知靶基因進(jìn)行檢索與篩選，整合后共獲得肺癌相關(guān)靶基因1097個(gè)，骨轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)靶基因569個(gè)。

2.2 山慈菇-王不留行有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測 以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索到山慈菇-王不留行活性成分6個(gè)，其中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇具有較高自由度，見表1。根據(jù)SMILES及2D結(jié)構(gòu)預(yù)測出作用靶點(diǎn)116個(gè)，利用Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建其中藥-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。

表1 山慈菇-王不留行活性成分

圖1 中藥-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 山慈菇-王不留行干預(yù)肺癌骨轉(zhuǎn)移關(guān)鍵靶基因篩選 將所篩選的山慈菇-王不留行潛在116個(gè)靶基因與獲取的疾病靶基因交叉映射，發(fā)現(xiàn)山慈菇-王不留行對肺癌骨轉(zhuǎn)移的靶基因映射率為2.8%、映射出關(guān)鍵靶點(diǎn)35個(gè)，作為山慈菇-王不留行干預(yù)肺癌骨轉(zhuǎn)移的直接或間接作用靶標(biāo)基因，占據(jù)該藥對作用靶點(diǎn)的30.2%左右。將這35個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建映射靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)信息見表2，35個(gè)節(jié)點(diǎn)在0.4中置信度下有347條相互作用關(guān)系。根據(jù)Degree≥20進(jìn)行篩選，得到核心靶點(diǎn)15個(gè)，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建核心靶點(diǎn)圖(圖2)。

圖2 核心靶點(diǎn)圖

表2 山慈菇-王不留行對肺癌骨轉(zhuǎn)移映射的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.4 生物通路及富集分析 對“2.3”獲得的15個(gè)核心靶點(diǎn)采用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物過程和KEGG信號通路分析，得到生物過程147條、信號通路66條；以P≤0.05、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，取前20條以氣泡圖的形式展現(xiàn)出來(圖3、4)。生物通路下靶基因見表3。

圖3 前20條通路的GO生物過程氣泡圖

圖4 前20條通路的KEGG分析氣泡圖

表3 生物通路下的靶基因

3 討 論

中醫(yī)學(xué)將腫瘤歸為“癥瘕”“乳巖”等范疇，其病機(jī)多為氣滯、痰凝、血瘀[9]。劉偉勝教授提出“正虛邪實(shí)，癌毒為患”的觀點(diǎn)，認(rèn)為正氣虧虛是肺癌發(fā)生的基礎(chǔ)，而癌毒是致病的直接因素[10]。肺癌病程較長，常導(dǎo)致患者正氣虧損、元?dú)馑?、傷津成毒、四散流溢。肺癌晚期患者多因腎氣衰微，無以生髓養(yǎng)骨、骨失所養(yǎng)，則邪毒流竄于骨發(fā)生轉(zhuǎn)移。癌毒瘀滯于骨，則痰瘀搏結(jié)、積聚成毒瘤，形成骨質(zhì)破壞，而疼痛則是痰瘀阻滯所致。中醫(yī)藥在肺癌骨轉(zhuǎn)移的治療中，具有延長患者生存期、改善生存質(zhì)量等優(yōu)勢[11]。

經(jīng)本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，山慈菇-王不留行中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇具有較高自由度，這可能是抑制肺癌骨轉(zhuǎn)移的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能通過抑制Snail介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制原位A549異種移植模型中非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的遷移/侵襲和骨轉(zhuǎn)移，并延長存活時(shí)間[12]。有研究表明β-谷甾醇能夠抑制肺癌A549細(xì)胞的生長,通過調(diào)控其細(xì)胞周期引起細(xì)胞凋亡[13]。β-谷甾醇、豆甾醇均是植物甾醇的重要組成部分，植物固醇通過多種作用機(jī)制(包括抑制致癌物的產(chǎn)生、癌細(xì)胞的生長、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡等)發(fā)揮抗癌作用[14]。另外，MnSOD能夠誘導(dǎo)FoxM1表達(dá)并促進(jìn)肺癌的侵襲遷移性，研究表明異牡荊黃素能夠下調(diào)MnSOD、FoxM1的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的這種遷移能力[15]。對217例肺癌患者測序發(fā)現(xiàn)，TP53調(diào)節(jié)的基因與細(xì)胞遷移有關(guān)，推測是肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因[16]。另有研究表明TP53可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞分泌A1AT，進(jìn)一步誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)化，以驅(qū)動(dòng)肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。此外，P53通過上調(diào)CXCL5表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，選擇性除去P53后則該能力下降[18]。同時(shí)TP54對骨骼具有較強(qiáng)親和力，能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞成熟而發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[19]。相關(guān)肺癌細(xì)胞研究表明EGFR可以抑制OPG、上調(diào)RANKL刺激破骨細(xì)胞發(fā)生溶骨性骨轉(zhuǎn)移，而抑制EGFR時(shí)這種骨吸收能力減弱[20]。此外，還有研究表明EGFR能夠誘導(dǎo)VEGFA促進(jìn)腫瘤血管生成，誘導(dǎo)肺癌骨轉(zhuǎn)移過程[21]。VEGFA通過調(diào)控血管生成與通透性，增加肺癌侵襲轉(zhuǎn)移作用，miR-1被認(rèn)為是重要抑癌基因，研究表明miR-1可以下調(diào)VEGFA活性,抑制肺癌干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[22]。當(dāng)C-jun被激活時(shí)會上調(diào)其蛋白表達(dá),C-jun蛋白磷酸化能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[23]。C-jun蛋白在多種腫瘤中呈高表達(dá)，參與腫瘤的形成和進(jìn)展,還可促進(jìn)肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[24]。MAPK廣泛存在于細(xì)胞中參與細(xì)胞內(nèi)外信息傳導(dǎo),調(diào)控細(xì)胞有絲分裂及炎癥反應(yīng)等，MAPK1是其下游靶標(biāo)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)[25]。此外，MAPK1也高表達(dá)于各種腫瘤中，研究表明通過下調(diào)MAPK1可以減弱非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力，并抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[26]。

TNF-α作為一種重要促炎因子，其表達(dá)增加能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。TNF-α一方面誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，另一方面通過調(diào)控相關(guān)因子促進(jìn)破骨細(xì)胞活化。當(dāng)肺癌細(xì)胞播散至骨微環(huán)境時(shí)會與骨襯細(xì)胞結(jié)合進(jìn)入休眠期，而破骨細(xì)胞能夠去除骨襯細(xì)胞重新激活腫瘤細(xì)胞，形成轉(zhuǎn)移灶。此外OPG作為非典型的TNF受體之一,同樣在肺癌骨轉(zhuǎn)移中具有重要作用，OPG/RANKL/RANK軸在惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移研究中具有重要地位。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性免疫性疾病，有數(shù)據(jù)表明其合并肺癌的概率較高[27]，原因在于其相關(guān)免疫抑制治療會引起TNF等促炎因子的表達(dá)，增加肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。有關(guān)實(shí)驗(yàn)通過小鼠模型證明了免疫抑制劑能夠減弱NK細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移[28]。蛋白聚糖分布于細(xì)胞內(nèi)外及細(xì)胞膜表面，具有多種生物功能，部分蛋白聚糖硫酸化程度降低可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間粘連降低。多配體蛋白聚糖是其中一種，通過細(xì)胞內(nèi)外信息交換誘導(dǎo)細(xì)胞生長、分化、黏附及遷移，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)合成的多配體蛋白聚糖2在腫瘤血管生成及侵襲遷移方面具有重要作用[29-30]。NOD樣受體通路在免疫功能調(diào)節(jié)中的作用，已有研究證明其參與肺部的炎癥損傷[31]，其中晚期高表達(dá)的NOD1、NOD2能夠影響體內(nèi)炎癥水平，產(chǎn)生大量炎癥因子，誘導(dǎo)腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。此外NOD1還可以激活下游MAPK及NF-κB信號通路,調(diào)控體內(nèi)炎癥免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖等過程，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥因子調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞干預(yù)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。所以，山慈菇-王不留行可能通過TNF通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通路、癌癥中蛋白聚糖通路、NOD樣受體通路調(diào)節(jié)體內(nèi)微環(huán)境水平調(diào)控肺癌骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程。

肺癌骨轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜過程，腫瘤細(xì)胞脫落隨血液循環(huán)定植于骨組織并進(jìn)入休眠，破骨細(xì)胞等通過相互作用重新激活腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而增殖轉(zhuǎn)移。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)山慈菇-王不留行通過活性成分-靶點(diǎn)-通路作用于不同方面調(diào)控這一過程，一方面通過抑制體內(nèi)血管生成構(gòu)建及炎癥因子的釋放，改善體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，抑制腫瘤的生長發(fā)育；另一方面干預(yù)破骨細(xì)胞等骨骼微環(huán)境下調(diào)對轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的激活能力，使其保持休眠狀態(tài)。當(dāng)然腫瘤細(xì)胞激活也與自身?xiàng)l件有關(guān)，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究探索。