付維明 哈爾濱海關(guān)（黑龍江，哈爾濱，150010）

焦 丹 黑河海關(guān)（黑龍江，黑河，164300）

丁淑麗 鞠文東 徐 寧 耿 聰 程 成黑龍江國際旅行衛(wèi)生保健中心（哈爾濱海關(guān)口岸門診部） （黑龍江，哈爾濱，150001）

黃 洋 黑龍江省森工總醫(yī)院（黑龍江，哈爾濱，150001）

在黑龍江省北部，緊靠黑龍江南岸，遜克縣城區(qū)以東12.5km 處的中俄邊境線上，有一個富有傳奇色彩的村落——邊疆俄羅斯民族村，是國家民委批準(zhǔn)的首個俄羅斯民族村。 國家對少數(shù)民族的健康十分重視，同時，邊疆俄羅斯民族村又是旅游熱點地區(qū)，前來旅游參觀的全國各地的游客絡(luò)繹不絕。 因此，掌握該地區(qū)的蜱攜帶病原情況，對保證俄羅斯民族村的村民健康及蜱傳疾病的防控，有著重要的政治意義和醫(yī)學(xué)意義，

1 材料與方法

1.1 蜱類樣本的采集

2017 年4-6 月間，在遜克縣奇克鎮(zhèn)邊疆俄羅斯民族村（黑龍江省遜克縣奇克鎮(zhèn)東）境內(nèi)針闊混交林中以布旗法捕獲活蜱，并記錄捕捉日期、生境及其生物學(xué)特征。

1.2 DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

將蜱在液氮下研磨至粉末狀，采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒 （由天根試劑公司生產(chǎn)） 提取DNA，具體操作按照說明書進(jìn)行。 以DNA 為模板，利用斑點熱群立克次體 （SFGR）3 種不同目的基因的特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表1），經(jīng)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收與純化，送到吉林庫美生物公司測序。 所測序列與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)上序列進(jìn)行同源行比較，用Mega6 軟件中的Algnment 進(jìn)行同源性（distance）和進(jìn)化樹分析（phylogeny）。本研究采用的參考毒株序列均取自GenBank。

表1 文中所用引物

2 結(jié)果

2.1 蜱類監(jiān)測結(jié)果

本次調(diào)查共捕獲蜱類418 只，經(jīng)分類鑒定分屬于硬蜱屬（Ixodes）的全溝硬蜱（Ixodes persuleatus）和血蜱屬（Haemaphysalis）的嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna）。 其中全溝硬蜱286 只，嗜群血蜱132 只。

2.2 SFGR 檢測結(jié)果

在所有蜱中共檢出SFGR 核酸陽性樣本93 例，感染率為22.25%（93/418）。 其中在全溝硬蜱中檢測陽性樣本62 例，感染率為21.68%（62/286）， 嗜群血蜱中檢測到陽性樣本31 例， 感染率為23.48%（31/132）。

2.3 SFGR 序列對比結(jié)果

經(jīng)SFGR 3 種不同目的基因測序?qū)Ρ龋?確定所有樣本均屬于同一種SFGR， 且為日本立克次體（Rickettsia japonica）， 所測序列均已上傳至NCBI，所測得17kDa 基因（MH385342）與Rickettsia japonica（AP017572.1、AP017582.1） 等相似度達(dá)99.07%，所測得gltA 基因（MH385343）與Rickettsia japonica（AY743327.1、KX987343.1）等相似度達(dá)100%，所測得ompA 基因 （MH385342） 與Rickettsia japonica（DQ909072.1）相似度達(dá)99.61%。 所測序列與Gen-Bank 中序列進(jìn)行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1-3。

圖1 基于斑點熱群立克次體17kDa 基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 基于斑點熱群立克次體gltA 基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

日本斑點熱（JSF）屬于SFGR 傳染性疾病，是以蜱類為傳播媒介的急性熱性發(fā)疹性疾病。 1984 年，JSF 首次發(fā)現(xiàn)于日本的德島地區(qū)［4］，Rickettsia japonica 作為SFGR 的一員，是JSF 的特異性病原體。 在日本的西南部和中部以及韓國均出現(xiàn)過已被確診的JSF 患者［5］，患者多伴有發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大及斑疹性皮疹等典型的臨床癥狀。

圖3 基于斑點熱群立克次體ompA 基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

蜱是Rickettsia japonica 主要的儲存與傳播宿主， 在日本，R.japonica 至少可以在8 種蜱中分離到，包括臺灣革蜱（Dermacentor taiwanensis）、豪豬血蜱（Haemaphysalis hystericis）、具角血蜱（H.cornigera），褐黃血蜱（H.ava）、長角血蜱（H.longicornis），臺灣血蜱（H.fromosensis）、大刺血蜱（H.megaspinosa）和卵形硬蜱（Ixodes ovatus）［6］；在韓國，研究者同樣在長角血蜱中分離到了Rickettsia japonica［7］；在泰國東北地區(qū)，一種人類致病SFGF 與Rickettsia japonica 存在密切相關(guān)聯(lián)系（同時在泰國北部地區(qū)的豪豬血蜱（Haemaphysalis hystericis）中同樣檢測到了該病原體）。在日本，Rickettsia japonica 經(jīng)常可以在臺灣革蜱 （Dermacentor taiwanensis） 和豪豬血蜱（Haemaphysalis hystericis）未飽血的幼蟲中分離到［8-9］。 通過本研究，我們可以看出，Rickettsia japonica 同樣可以在嗜群血蜱及全溝硬蜱中檢測到。

在本研究中，研究者利用SFGR 17kDa、gltA 和ompA 基因?qū)Ψ蛛x的SFGR 進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3 種基因均與Rickettsia japonica 相似度達(dá)99%以上，確定為Rickettsia japonica， 感染率可達(dá)到22.25%（93/418），可以明顯看出Rickettsia japonica 為該地區(qū)存在的主要病原體，而且Rickettsia japonica 在全溝硬蜱和嗜群血蜱中的感染率分別為21.68%和23.48%， 說明該種SFGR 在該地區(qū)蜱種上的分布也較為平均，差異不大。 研究者在以往對黑龍江地區(qū)SFGR 的 調(diào) 查 中 發(fā) 現(xiàn)［10］，黑 龍 江 主 要 存 在 的 是3 種SFGR，分別是勞氏立克次體（R.raoultii）、新塔拉塞維奇立克次體（Candidatus R.tarasevichiae）和黑龍江立克次體（R.heilongiangii），勞氏立克次體處于一個更為優(yōu)勢的地位， 而且在有的地區(qū)感染率還非常高， Rickettsia japonica 的檢出對黑龍江蜱攜帶SFGR 的研究提供了新的提示。

總之，本次檢測結(jié)果顯示，Rickettsia japonica 體存在于黑龍江，雖然還沒有人感染該立克次體的報道，但很明顯，該地區(qū)的Rickettsia japonica 在蜱中的感染率較高，應(yīng)對該地區(qū)的野生動物及常住人群進(jìn)行血清學(xué)檢測， 以便更為清楚地了解Rickettsia japonica 在該地區(qū)的流行情況。