唐文文 陳垣

摘要：以黨參廢棄物莖葉為試驗材料，在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗，優(yōu)化雙酶協(xié)同超聲波提取黨參莖葉總黃酮的最佳提取工藝，采用清除DPPH自由基、ABTS自由基和 FRAP法評價黨參莖葉總黃酮的抗氧化活性。結(jié)果表明，利用雙酶協(xié)同超聲法提取黨參莖葉總黃酮的最佳條件為：液料比40 mL ∶1 g，乙醇體積分數(shù)70%，雙酶（纖維素酶 ∶果膠酶=1 ∶1）用量0.45 mg/mL，酶解時間60 min，超聲時間42 min，此條件下，總黃酮提取率為6.511%。DPPH自由基、ABTS自由基和FRAP總還原力的分析結(jié)果表明，黨參莖葉總黃酮具有較高的抗氧化活性，在濃度為100 μg/mL時，對DPPH自由基清除率達到91.74%;在濃度達到500 μg/mL時，對ABTS自由基的清除率為94.82%，非常接近維生素C;黨參莖葉總黃酮的總還原力為28.22 mg/g。本研究確定出黨參莖葉總黃酮具有抗氧化活性，可為黨參資源的充分利用提供數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞：黨參莖葉;總黃酮;提取工藝;雙酶協(xié)同超聲法;響應(yīng)面;抗氧化

中圖分類號： R284? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0171-07

收稿日期：2021-06-30

基金項目：國家重點研發(fā)專項（編號：2018YFC1706301）;甘肅省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中藥材產(chǎn)業(yè)體系首席專家項目（編號：GARS-ZYC-1）。

作者簡介：唐文文（1986—），女，河南許昌人，碩士，副教授，主要從事藥用植物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：412251544@qq.com。

通信作者：陳 垣，博士，教授，主要從事藥用植物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：chenyuan@gsau.edu.cn。

黨參[Codonopsis pilosula? （Franch.） Nannf.]為桔?？贫嗄晟荼局参?，始載于《本草從新》，是傳統(tǒng)的補中益氣類中藥材，也是藥食兩用大宗中藥材[1-2]?！吨袊幍洹芬?guī)定黨參的藥用部位為根[3]，在主產(chǎn)區(qū)為方便采挖根部，需先割掉其地上部分，在種植區(qū)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，黨參生長期內(nèi)其地上部分的生物量遠大于根部，為促進根部生長，會在生長中期對其進行“打尖割蔓”，其地上部分莖葉多數(shù)被棄于田間路旁。隨著人們健康意識的提高，黨參需求量倍增，近年來黨參年均種植面積均在3.3萬hm2以上，大量的黨參莖葉被丟棄，浪費資源的同時又造成產(chǎn)地環(huán)境污染。有學者對黨參地上部分的化學成分進行研究，但大多集中在多糖和皂苷上[4-6]，對其黃酮類化合物的研究較少，黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒、保肝、抗癌、抗炎等藥理活性[7]，并且植物源黃酮類化合物具天然低毒的特點，在開發(fā)高效安全的天然藥物、護膚品、保健品等方面具有廣闊前景。目前尚未見對黨參地上部分莖葉黃酮類提取工藝和生物活性的研究，因此本試驗采用雙酶法協(xié)同超聲波提取黨參地上部分莖葉的總黃酮，再通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并測定其抗氧化活性，為黨參資源的充分合理利用及其非藥用部位的藥理活性研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、儀器與試劑

試驗用黨參莖葉，于2020年9月中旬采于甘肅省渭源縣，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學陳垣教授鑒定為桔梗科植物黨參[Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.]地上部分莖葉，將地上部分莖、葉分離，去雜質(zhì)，45 ℃烘干，備用。

UV-1801紫外可見分光光度計，購自北京瑞麗分析儀器公司;SB5200DTD 超聲波清洗機，購自寧波新芝生物科技股份有限公司;CP214電子天平，購自奧豪斯儀器（上海）有限公司;New Human Power型超純水儀，購自韓國Human公司;蕓香苷（批號為B20771，純度≥98%），購自上海源葉生物科技有限公司;DPPH、ABTS，購自Sigma試劑公司;纖維素酶、果膠酶均為食品級，購自南寧龐博生物有限公司;乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黨參莖葉總黃酮的提取 精確稱取黨參莖葉（莖 ∶葉=1 ∶1）粉末2.0 g，過四號篩，置于具塞三角瓶中，按不同液料比加入不同濃度的乙醇水溶液，密塞搖勻，調(diào)節(jié)溶液pH值為4.5，按照纖維素酶 ∶果膠酶=1 ∶1的比例加入不同量的雙酶，放入 40 ℃ 水浴鍋中保溫酶解反應(yīng)一定時間，取出，50 ℃、250 W超聲一定時間，搖勻，4 000 r/min離心10 min，精確量取上清液5 mL，定容至10 mL容量瓶中，得黨參莖葉總黃酮提取液。

1.2.2 黨參莖葉總黃酮含量的測定? 參考陳蓬鳳等的方法[8]，以蕓香苷為對照品，繪制標準曲線，以吸光度D為縱坐標，蕓香苷濃度C為橫坐標，得線性回歸方程為D=10.003C+0.000 7（r2=0.999 3），蕓香苷對照品質(zhì)量濃度的線性范圍為0.015～0.75 mg/mL。按照下式計算黨參莖葉總黃酮提取率（x）。

x=（C1×V×n）/m×100%。

式中：C1為標準曲線中計算出的總黃酮濃度，mg/mL;V為提取液體積，mL;n為稀釋倍數(shù);m為取樣量，g。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計 精確稱取黨參莖葉粉末2.0 g，其他提取條件保持一致，分別固定液料比 40 mL ∶1 g、乙醇體積分數(shù)40%，超聲時間40 min、雙酶（維素酶 ∶果膠酶=1 ∶1）用量0.4 mg/mL、酶解時間60 min等因素中的4個，考察其余各因素對黨參莖葉總黃酮提取率的影響。試驗設(shè)計見表1。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計 在“1.2.3”節(jié)單因素試驗的基礎(chǔ)上，對單因素試驗結(jié)果進行分析后，選取對總黃酮提取率影響較大的因素為獨立變量，以黨參莖葉總黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗。

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 將DPPH配制成濃度為0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，參考Dong等的測定方法[9]，將黨參莖葉總黃酮配成不同濃度的溶液，分別取所配溶液各2 mL，均加入 2.0 mL DPPH乙醇溶液，快速混勻，于室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度，以乙醇為空白對照，以維生素C為陽性對照。樣品對DPPH自由基清除率用下述方程計算：

y=[D0-（Ds-Ds0）]/D0×100%。

式中：y為DPPH自由基清除率，%;D0為空白組的吸光度;Ds為不同樣品吸光度;Ds0為樣品自身吸光度。

1.2.5.2 ABTS自由基清除能力測定 參考de Souza等的方法[10]，將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和5 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合搖勻，室溫中避光靜置12 h，使用前，用乙醇稀釋至吸光度為0.70±0.02 （734 nm 波長下）的ABTS+工作液，取不同濃度的樣品溶液50 μL加入2 mL ABTS+工作液，充分混合，室溫避光反應(yīng)6 min，于734 nm處測吸光度，以乙醇為空白對照，以維生素C為陽性對照。樣品對ABTS自由基清除率用下述方程計算：

T=（1-Ds/D0） ×100%。

式中：T為ABTS自由基清除率，%;D0為空白組的吸光度;Ds為不同樣品吸光度。

1.2.5.3 FRAP總還原力的測定 參考Jin等的方法[11]，取濃度為0.2 mg/mL的黨參莖葉總黃酮溶液0.5 mL于10 mL具塞比色管中，加入4 mL FRAP工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配），充分混勻，37 ℃水浴30 min后，593 nm 處測定反應(yīng)液的吸光度。以不同濃度的VC系列溶液繪制標準曲線（y=6.823x+0.040 5， r2=0.997 6），以1 g樣品中VC相當含量表示樣品的總還原能力（mg/g）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析，Excel 2010和SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

如圖1-A所示，在液料比為10～40 mL ∶1 g范圍內(nèi)時，隨著液料比增加，總黃酮的提取率逐漸升高，主要是由于伴隨著溶劑比例的提高，增大了黨參莖葉粉末與提取溶劑的接觸面積，促進黃酮類化合物的溶出，當液料比達到40 mL ∶1 g時，提取率達到最大;繼續(xù)增大液料比，提取率略微下降，可能是由于溶劑比例過大會增加提取過程中的損耗。因此本試驗選擇40 mL ∶1 g為最佳液料比。

如圖1-B所示，乙醇體積分數(shù)在40%～70%范圍內(nèi)時，隨著體積分數(shù)增加，總黃酮提取率逐漸增大，當乙醇體積分數(shù)達到70%時，提取率達到最大值;繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)，提取率下降?？赡苁怯捎邳h參莖葉中所含黃酮類化合物既有游離黃酮又有可溶于水的黃酮苷類物質(zhì)，且游離黃酮占比較大，乙醇體積分數(shù)過低造成游離黃酮苷元不能充分溶出，體積分數(shù)過高又會影響極性較大的黃酮苷類物質(zhì)溶出。因此本研究選擇60%、70%、80%進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

如圖1-C所示，超聲時間對黨參莖葉總黃酮的提取率影響較大，超聲提取時間在40 min內(nèi)時，隨著時間的延長，總黃酮提取率增加，在40 min時提取率達到最大;此時繼續(xù)增加超聲提取時間，不僅未使提取率進一步提高，反而有所降低。可能因為超聲時間過短，植物細胞壁不能被充分破壞，阻礙了有效成分的溶出;而超聲時間過長，一部分黃酮類物質(zhì)在超聲波的空化作用及機械效應(yīng)下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。因此，本研究選擇30、40、50 min進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

如圖1-D所示，雙酶用量對的提取率影響較大，未加酶處理的總黃酮提取率遠低于加酶處理，可能由于黨參莖稈中纖維素類和果膠類含量較多，影響活性成分的溶出，纖維素酶和果膠酶能夠分解植物細胞壁中的纖維素和果膠，從而加快破壞細胞壁的速度。在雙酶用量為0.4 mg/mL時，黨參莖葉總黃酮提取率最高，因此本研究選擇酶用量0.3、0.4、0.5 mg/mL進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

如圖1-E所示，當酶解時間在60 min之內(nèi)時，總黃酮提取率隨酶解時間延長而升高，并且升高較快，60 min 以后提取率趨于平緩。酶解時間過短，纖維素酶和果膠酶不能充分破壞原料的細胞壁，隨著酶解時間延長，纖維素和果膠已被降解完全，過長的酶促反應(yīng)時間可能還會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，從節(jié)約時間和保證純度考慮，確定酶解反應(yīng)時間為60 min。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定液料比為40 mL ∶1 g、酶解時間為60 min條件下，選取乙醇體積分數(shù)（A）、超聲時間（B）、雙酶用量（C）等3個因素為變量，以黨參莖葉總黃酮提取率（x）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計見表2，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表3。使用 Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次響應(yīng)面回歸分析，得到如下多元二次回歸方程：

x=6.55+0.20A+0.057B+0.087C-0.046AB-0.050AC+0.000 5BC-0.57A2-0.13B2-0.073C2。

由表4可知，該模型顯著性檢驗的P值<0.000 1，表明該模型具有統(tǒng)計學意義。失擬項的P值為0.321 1>0.05，調(diào)整系數(shù)R2adj=0.985 1，變異系數(shù)CV為0.69%，說明回歸模型擬合較好，能較準確反映3個因素對黨參莖葉總黃酮提取率的影響。從F值可以看出各因素對黨參莖葉總黃酮提取率的影響大小：乙醇體積分數(shù)>雙酶用量>超聲時間。

2.2.2 方差和交互作用分析 從表4方差來源中A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2和C2的P值分別為<0.000 1、0.007 0、0.000 7、<0.000 1、0.000 4、0.010 2，表明A、B、C等3個因素對黨參莖葉總黃酮提取率有極顯著影響（P<0.01），且乙醇體積分數(shù)的影響最大，這在圖2各因素兩兩交互作用的3D響應(yīng)面圖曲線坡度陡峭程度上得到了驗證，乙醇體積分數(shù)的曲面最為陡峭;另外乙醇體積分數(shù)和雙酶用量、乙醇體積分數(shù)和超聲時間均有一定的交互作用，而超聲時間和雙酶用量的等高線為圓形，3D響應(yīng)面幾乎無曲度，說明二者幾乎無交互作用。

2.2.3 最優(yōu)提取條件的確定及驗證 根據(jù)響應(yīng)面分析得到最優(yōu)提取條件為：乙醇體積分數(shù)71.38%，

超聲時間41.93 min，雙酶用量0.45 mg/mL，此條件下黨參莖葉總黃酮的提取率理論值可達6.597%?？紤]到實際可操作性，最佳提取條件優(yōu)化為：液料比40 mL ∶1 g，乙醇體積分數(shù)70%，雙酶用量 0.45 mg/mL，酶解時間60 min，超聲時間42 min，得到實際提取率為6.511%，與理論值相差0.086百分點。說明此模型預(yù)測較好且穩(wěn)定，可用于黨參莖葉中總黃酮的提取。

2.3 黨參莖葉總黃酮抗氧化能力評價

自由基對人體正常細胞的攻擊與摧毀，是引起人類衰老和患病的主要原因，抗氧化劑通過清除自由基在保證人體健康中起著至關(guān)重要的作用。黃酮類化合物除了直接捕捉或絡(luò)合自由基外，還可通過激活機體的抗氧化系統(tǒng)來發(fā)揮抗氧化作用[12]，從而減少機體的氧化損傷。本研究采用清除DPPH自由基、ABTS自由基和FRAP法評價黨參莖葉總黃酮的抗氧化活性。

如圖3和圖4所示，黨參莖葉總黃酮有較強的DPPH自由基清除能力， 在濃度為10～80 μg/mL時，清除率隨著濃度的升高而快速增大;在濃度為100 μg/mL時，清除率達到91.74%，略低于VC。黨參莖葉總黃酮對ABTS自由基的清除能力與DPPH走勢相似，在50～400 μg/mL范圍內(nèi)，清除率增大較快;在濃度達到500 μg/mL時，對ABTS清除率為94.82%，非常接近VC。

黨參莖葉總黃酮清除DPPH、ABTS的半抑制濃度（IC50）以及FRAP總還原力分析結(jié)果見表5，IC50越小，清除自由基能力越強。由表5可知，ABTS自由基的IC50為DPPH自由基的近7倍，說明黨參莖葉總黃酮對DPPH自由基具有更強的清除能力。鐵離子的總還原力用來確定各樣品是否具有潛在的抗氧化活性。用維生素C建立的標準曲線進行換算，以 1 g 樣品中維生素C相當含量表示其抗氧化能力，如表5所示，黨參莖葉總黃酮的總還原力為28.22 mg/g。以上DPPH自由基、ABTS自由基和總還原力測定結(jié)果表明，黨參莖葉具有較強的抗氧化活性。另外本研究還表明，黨參莖葉總黃酮對DPPH自由基、ABTS自由基清除力與FRAP總還原力存在一定的差異性，可能與其成分含量和組成不同以及不同的抗氧化體系考察的抗氧化活性的不同方面有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究采用雙酶協(xié)同超聲法對黨參莖葉總黃酮進行提取，集合了超聲波和酶2種提取方法的優(yōu)點，通過超聲波的振動使細胞壁軟化破碎，纖維素酶和果膠酶的加入能夠分解那些阻止有效成分溶出的纖維和果膠，使黃酮類成分更易溶出[13-14]。通過單因素和Box-Behnken響應(yīng)面試驗，確定黨參莖葉總黃酮的最佳提取條件為：液料比40 mL ∶1 g，乙醇體積分數(shù)70%，雙酶用量0.45 mg/mL，酶解時間 60 min，超聲時間42 min，得到實際提取率為6.511%，與理論值的相差0.086百分點，說明此模型預(yù)測較好且穩(wěn)定，可用于黨參莖葉中總黃酮的提取;通過清除DPPH自由基、ABTS自由基和FRAP法的抗氧化結(jié)果明確了黨參莖葉總黃酮有較強的抗氧化活性。有研究表明，黨參莖葉的毒性小，安全使用范圍大[15]，因此黨參莖葉一方面可以作為提取天然抗氧化劑的原料，另一方面可用于食品保健品、護膚品的開發(fā)提取原料以及作為飼料添加劑使用。

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