miR-190通過調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子5促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生的機(jī)制

王運(yùn)九 孫健 李玲霞 郭金虎 張玨

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞癌;微核糖核酸-190;細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子5;增殖

肝細(xì)胞癌（HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因，占原發(fā)性肝癌的80%，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。隨著對(duì)HCC分子生物學(xué)研究的不斷深入，已鑒定出與該疾病有關(guān)的不同基因和途徑。為了更好地理解HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，亟待發(fā)現(xiàn)更精準(zhǔn)的預(yù)后標(biāo)志物及有效的治療策略。張春艷等（2016年）認(rèn)為作為一類非編碼單鏈RNA分子，微RNA（miR）與肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。miR-144的高表達(dá)可明顯抑制裸鼠肝癌形成[3]。近期研究表明，miR-190可以通過抑制ZEB2的表達(dá)來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[4]。然而，miR-190在HCC中的表達(dá)、潛在作用和機(jī)制仍不清楚。本研究探討miR-190通過調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子5（SOCS5）參與HCC發(fā)生與發(fā)展過程的關(guān)鍵作用與機(jī)制。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選取2019年5月至2019年12月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院接受手術(shù)切除且病理確診為HCC的患者84例，其中男58例、女26例，年齡（63±5）歲。收集HCC癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距腫瘤邊緣≥2cm）?；颊呔炇鹬橥鈺芯糠桨附?jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

二、細(xì)胞、動(dòng)物及主要試劑

SNU398和HepG2細(xì)胞均購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。24只雌性無胸腺裸鼠，4～6周齡，購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SOCS5、β-actin抗體購自Sigma公司;miR-190模擬物/抑制物和Dharmafect1購自Dharmacon公司;靶向SOCS5的psiCHECK-2載體購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑、miR定量試劑盒購自ThermoFisherScientific公司;Transwell小室購自Corning公司;Mgteigel基質(zhì)膠購自BD公司。

三、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

SNU398和HepG2細(xì)胞分別用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基于5%CO2、37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞達(dá)到每孔150000個(gè)細(xì)胞的密度時(shí)，根據(jù)說明書將miR-190模擬物/抑制物或SOCS5siRNA（siSOCS5）及各自的陰性對(duì)照（模擬物NC/抑制物NC或siNC）分別用Dharmafect1和Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。

四、細(xì)胞活力

根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）說明書測(cè)定細(xì)胞活力。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞按1×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入10μlCCK-8溶液，在37℃下孵育2h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)下細(xì)胞的吸光度。

五、Transwell侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)

取100μl基質(zhì)膠稀釋液鋪于Transwell小室上室，含胎牛血清的常規(guī)培養(yǎng)基加入下室，細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。擦去上室細(xì)胞與基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)無需鋪膠，其余操作同侵襲實(shí)驗(yàn)。

六、裸鼠異種移植腫瘤

于裸鼠腹側(cè)皮下接種1.5×106個(gè)用siNC或siSOCS5轉(zhuǎn)染的SNU398或HepG2細(xì)胞。對(duì)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)18d的監(jiān)測(cè)，并通過以下公式計(jì)算腫瘤體積：體積=（L×W2）/2，其中L為腫瘤的長(zhǎng)度，W為腫瘤的寬度。

七、RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）

采用TRIzol法提取HCC組織、癌旁組織、轉(zhuǎn)染后的SNU398或HepG2細(xì)胞中的總RNA。根據(jù)miR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后，使用7900HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（ThermoFisherScientific）進(jìn)行RT-PCR。miR-190以U6為內(nèi)參，SOCS5以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算結(jié)果。引物序列見表1。

八、蛋白免疫印跡法

利用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，并用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將10μg總蛋白上樣后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉2h后，加入SOCS5抗體（1∶1000）或β-actin抗體（1∶2000），4℃孵育過夜。TBST沖洗3次后，加入二抗，室溫孵育lh，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。

九、熒光素酶測(cè)定

構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn)SOCS5的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體（SOCS5-Wt和SOCS5-Mut），使用Lipofectamine3000將其與miR-190模擬物和陰性對(duì)照同時(shí)分別轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72h后，使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（上海吉馬生物制藥有限公司）連續(xù)測(cè)量螢火蟲-海腎熒光素酶的活性。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPadPrism8.0分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布定量資料以表示，定性資料以例表示。采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析癌組織和癌旁組織間的差異，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析體外定量數(shù)據(jù)，兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析轉(zhuǎn)染時(shí)間與分組間的差異，χ2檢驗(yàn)分析miR-190表達(dá)與臨床特征的關(guān)系。生存曲線采用Kaplan-Meier法，log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。α=0.05。

結(jié)果

一、miR-190是HCC中潛在的癌基因

與來自同一HCC患者的癌旁組織相比，HCC癌組織中miR-190水平上調(diào)（t=6.849，P<0.001，圖1A）。將84例HCC組織以miR-190的中位表達(dá)水平分為高表達(dá)組（>中位數(shù)，40例）和低表達(dá)組（≤中位數(shù)，44例），分析miR-190的表達(dá)量與HCC患者臨床特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR-190的表達(dá)量與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（P均<0.05），見表2。

miR的高水平與HCC患者的預(yù)后不良有關(guān)（HR=0.656，95%CI0.352～0.933，P=0.027，圖1B）。miR-190的過表達(dá)提高SNU398和HepG2細(xì)胞的體外增殖能力（t=4.465，P<0.001;t=2.824，P=0.005，圖1C）。

二、下調(diào)miR-190的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞侵襲及遷移能力

下調(diào)miR-190處理SNU398和HepG2肝癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-190的表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲（t=13.120，P<0.001;t=7.398，P=0.002）及遷移能力（t=5.587，P=0.005;t=4.082，P=0.015），見圖2。

三、miR-190直接靶向SOCS5

借助生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫StarBase3.0對(duì)miR-190的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SOCS5可能是miR190的潛在靶點(diǎn)（圖3A）。為了驗(yàn)證該假設(shè)，我們通過RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)了miR-190對(duì)SOCS5轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的影響。結(jié)果顯示，miR-190的過表達(dá)導(dǎo)致SNU398和HepG2細(xì)胞中SOCS5mRNA（t=3.212，P=0.033;t=3.597，P=0.023，圖3B）和蛋白（t=2.895，P=0.044;t=2.813，P=0.048，圖3D）表達(dá)減少，而抑制miR-190導(dǎo)致SOCS5mRNA（t=8.249，P=0.001;t=3.865，P=0.018，圖3C）和蛋白表達(dá)（t=3.098，P=0.036;t=8.835，P=0.001，圖3E）的增加。

當(dāng)miR-190與SOCS5-Wt共同轉(zhuǎn)染到SNU398細(xì)胞中時(shí)，熒光素酶活性下降（t=5.983，P=0.004），SOCS53UTR結(jié)構(gòu)中的點(diǎn)突變可消除這種效應(yīng)（t=0.676，P=0.536，圖3F）。在HepG2細(xì)胞中也獲得了類似的結(jié)果（圖3G）。

四、SOCS5是HCC的腫瘤抑制因子

靶向siRNA可有效下調(diào)SNU398和HepG2細(xì)胞中的SOCS5水平（t=3.342，P=0.028;t=9.887，P=0.001，圖4A）。

在體外，兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析顯示SNU398和HepG2細(xì)胞的增殖隨時(shí)間變化呈上升趨勢(shì)（F時(shí)間=277.7和233.3，P均<0.001，圖4B），siSOCS5組增殖能力高于siNC組（F組間=36.6和34.2，P均<0.001），分組與時(shí)間有交互效應(yīng)（F=15.4和9.656，P均<0.001）。此外，轉(zhuǎn)染siSOCS5的細(xì)胞遷移（t=2.946，P=0.042;t=7.258，P=0.002）和侵襲能力（t=2.876，P=0.045;t=8.764，P=0.001）均增強(qiáng)（圖4C）。我們?cè)诋惙N移植腫瘤模型中進(jìn)一步評(píng)估了SOCS5基因敲除對(duì)HCC細(xì)胞腫瘤發(fā)展過程中的作用。與陰性對(duì)照相比，SOCS5基因敲除導(dǎo)致SNU398和HepG2細(xì)胞的異種移植腫瘤體積（t=2.829，P=0.047）和質(zhì)量（t=7.635，P=0.002）增加（圖4D）。

討論

Xue等（2016年）研究顯示，HCC是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，分子異質(zhì)性的存在和生物標(biāo)志物的缺失可導(dǎo)致晚期患者預(yù)后不良，從而影響癌癥的治療效果。因此，尋找預(yù)后標(biāo)志物及新的分子靶點(diǎn)是該疾病面臨的主要挑戰(zhàn)之一。miR在腫瘤分類和預(yù)后方面發(fā)揮重要作用，其異常的表達(dá)可作為肝癌的標(biāo)志。近年來，大量研究在肝癌中發(fā)現(xiàn)了與肝癌風(fēng)險(xiǎn)增加、腫瘤發(fā)生發(fā)展、晚期和血管浸潤(rùn)相關(guān)的miR信號(hào)，并將miR作為治療靶標(biāo)[1，3]。

有研究顯示在侵襲性神經(jīng)母細(xì)胞瘤和前列腺癌中miR-190表達(dá)減少，而在快速生長(zhǎng)的腫瘤中其過度表達(dá)會(huì)抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，miR-190還調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[5]。相反，Jia等（2016年）研究顯示miR-190在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。這提示miR-190可能在不同的腫瘤環(huán)境和腫瘤發(fā)展的不同階段發(fā)揮不同的作用。而關(guān)于miR-190在肝癌中的作用的研究目前較少，如Hung等（2014年）發(fā)現(xiàn)miR-190b的上調(diào)對(duì)誘導(dǎo)人HCC胰島素抵抗的IGF-1降低起作用。本研究首先發(fā)現(xiàn)miR-190在HCC腫瘤中上調(diào)，且miR-190高表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后有關(guān)，提示其可能在HCC發(fā)展過程中起促進(jìn)作用。此外，我們檢測(cè)了miR-190過表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-190過表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖，而下調(diào)miR-190抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力，表明miR-190通過促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等來發(fā)揮其促癌作用。這些結(jié)果與在胃癌中的觀察結(jié)果相一致。

當(dāng)miR-190過表達(dá)時(shí)，SOCS5在HCC細(xì)胞系中下調(diào)，由此我們推測(cè)SOCS5是miR-190的潛在靶點(diǎn)。SOCS5在人類癌癥中的作用已被研究，在前列腺癌和肝癌中已經(jīng)檢測(cè)到SOCS5的下調(diào)[6]。據(jù)報(bào)道，抑制miR-18a-5p促進(jìn)SOCS5而誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡[7]。隨后，我們使用熒光素酶檢測(cè)法證明了它確實(shí)是miR-190的靶點(diǎn)，同時(shí)，miR-190還能調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄和蛋白水平。有趣的是，SOCS基因是JAK/STAT通路中負(fù)反饋回路的一部分[8]。眾所周知，JAK/STAT途徑可激活細(xì)胞的增殖、遷移、分化、凋亡以及抑制劑的失調(diào)，導(dǎo)致包括肝癌在內(nèi)的人類疾病[9]。Yuan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a靶向SOCS-1，并通過JAK/STAT信號(hào)通路抑制膿毒癥大鼠的肝細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)了板藍(lán)根多糖通過激活JAK/STAT信號(hào)通路來發(fā)揮對(duì)HBV的體外抗病毒作用?？紤]到目前SOCS5與肝癌的相關(guān)研究較少，我們進(jìn)行了額外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證SOCS5在肝癌中的作用，結(jié)果證明了SOCS5在體內(nèi)和體外都可作為HCC的腫瘤抑制因子。以上結(jié)果表明，在HCC中，由miR-190介導(dǎo)的SOCS5下調(diào)將導(dǎo)致JAK/STAT通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。有研究報(bào)道m(xù)iR-885-5p上調(diào)通過靶向抑制SOCS5促進(jìn)大腸癌細(xì)胞增殖和遷移，我們的研究結(jié)果與其一致[12]。

綜上所述，我們驗(yàn)證了細(xì)胞因子家族抑制因子之一的SOCS5作為miR-190在肝癌中的真實(shí)靶點(diǎn)，并證明了SOCS5在肝癌中的抑瘤作用。此外，我們強(qiáng)調(diào)了miR190的抑制作用在恢復(fù)SOCS5水平方面的潛在用途，從而降低肝癌細(xì)胞的致瘤特性。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了miR-190在肝癌研究中的重要性，不僅是作為潛在的生物標(biāo)志物，而且有可能成為待開發(fā)潛在藥物的新的分子靶標(biāo)。