沈載蕓， 曹成全*， 王向積， 劉方慶， 楊香宇

(1. 樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山614004； 2. 山東省青島市城陽區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 山東青島266109)

魚蛉亞科Chauliodinae隸屬于廣翅目Megaloptera齒齡科Corydalidae，在齒蛉科中，魚蛉亞科較齒蛉亞科Corydalinae的屬級分化更明顯(劉星月，2008)，該亞科世界己知15屬130余種，世界性分布，呈現(xiàn)明顯的間斷分布格局(劉星月，2008；楊定，劉星月，2010)。斑魚蛉屬Neochauliodes是魚蛉亞科中最大的屬，世界已知38種及2亞種，分布廣泛，從遠(yuǎn)東一直延伸到東南亞(劉星月，2008；王付彬，2010；楊定，劉星月，2010)，其中，《中國動物志昆蟲綱(第五十一卷廣翅目)》(楊定，劉星月，2010)中的東方斑魚蛉Neochauliodesorientalis和越南斑魚蛉Neochauliodestonkinensis為同物異名。

在中國乃至世界的廣翅目昆蟲分類研究中，成蟲的分類學(xué)研究較為完善(劉星月，2008；楊定，劉星月，2010)，但其余蟲態(tài)的分類研究卻很薄弱。世界上多個現(xiàn)存廣翅目幼蟲形態(tài)特征已被描述，包括：馬達(dá)魚蛉屬Madachauliodes(Paulian，1951)、魚蛉屬Chauliodes和黑魚蛉屬Nigronia(Cuyler，1958，1965)、帝魚蛉屬Dysmicohermes、新魚蛉屬Neohermes和山魚蛉屬Orohermes(Evans，1972)、原泥蛉屬Protosialis(Flint，1973)、麗魚蛉屬Chloronia(Penny & Flint，1982)、寬頭齒蛉屬Platyneuromus(Contreras-Ramos & Harris，1998)、異魚蛉屬Apochauliodes、始魚蛉屬Archichauliodes、原魚蛉屬Protochauliodes、澳泥蛉屬Austrosialis和細(xì)泥蛉屬Stenosialis(Theischinger，2000)、星齒蛉屬Protohermes、斑魚蛉屬、準(zhǔn)魚蛉屬Parachauliodes、日泥蛉屬Nipponosialis和泥蛉屬Sialis(Hayashi，2005)、新齒蛉屬Corydalus(Azevêdo & Hamada，2006，2007)、寬魚蛉屬Platychauliodes和梯魚蛉屬Taeniochauliodes(Liuetal.，2011，2013)、纖泥蛉屬Leptosialis(Priceetal.，2012)、巨齒蛉屬Acanthacorydalis(Cao & Liu，2013)和齒蛉屬Neoneuromus(Caoetal.，2016，2018)等，斑魚蛉屬的小碎斑魚蛉N.sparsus(王付彬，2011)和臺灣斑魚蛉N.formosanus(Sang & Yeon，2015)的形態(tài)也被描述過。

僅有少數(shù)屬的蛹形態(tài)特征被描述過：星齒蛉屬和斑魚蛉屬(王付彬，2011)、巨齒蛉屬和齒蛉屬(Cao & Liu，2013; Caoetal.，2016，2018)。

本文利用分子數(shù)據(jù)和成蟲形態(tài)特征雙重證據(jù)對雙齒斑魚蛉Neochauliodesbicuspidatus和越南斑魚蛉的末齡幼蟲和蛹進行了分類鑒定，并對其形態(tài)特征進行了詳細(xì)描述。

1 材料與方法

1.1 試蟲采集及處理

試驗所用末齡幼蟲于2019年3月和2020年3月采自四川省涼山彝族自治州會理縣南閣鄉(xiāng)涼橋村(102°17′42″E，26°36′58″N，海拔1 900 m)，2種斑魚蛉生活在一起而常被同時采集到，均采集于山林一條流速緩慢的小河溝中，常居于石頭下，在無石頭區(qū)域的厚積腐葉下也采集到少量。

每個種類采集50～100只，將采集回的活蟲按照相關(guān)技術(shù)進行養(yǎng)殖(曹成全等，2018a，2018b)，將試蟲養(yǎng)至蛹和成蟲。

1.2 幼蟲和蛹的形態(tài)學(xué)研究

將處理干凈的鮮活完整幼蟲和蛹置于有蓋的培養(yǎng)皿中，0 ℃保存1 d以上冷凍休眠，取出置于空氣中0.5 h左右，使其肢體自然伸展，調(diào)整標(biāo)本姿勢，在LY-WN-YH全自由度超景深系統(tǒng)(成都勵揚精密機電有限公司)下拍攝,并用校準(zhǔn)的卡尺測量數(shù)據(jù)，體長從唇基到腹部末端測量，頭部長度從唇基到頭后測量(0.01 cm)。將拍攝好的試蟲進行標(biāo)注，并用Photoshop CS6處理。

1.3 試蟲物種鑒定

1.3.1 成蟲形態(tài)學(xué)鑒定將試蟲養(yǎng)殖至成蟲后，按照楊定和劉星月(2010)中的方法進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2 幼蟲和蛹的分子鑒定DNA提?。杭羧颖拘馗共考∪?，取完后用消毒后的小剪刀剪碎，再采用基因組DNA試劑盒(北京天根生物科技)提取總的基因組DNA。

PCR擴增以及測序：COⅠ序列通用引物為C1-J-2183(5’-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3’)和TL2-N-3014 (5’-TCCATTGCACTAATCTGCCAT-ATTA-3’)(張杰，2017)。PCR反應(yīng)體系為 25 μL，包括2×ES TaqMasterMix(cye) 12.5 μL，引物各1.0 μL(0.4 μmol)，ddH2O 8.5 μL，樣品2 μL。擴增程序為94 ℃ 1 min；94 ℃ 0.1 min，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1 min，20個循環(huán)；94 ℃ 0.5 min，45 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1 min，20個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ ∞，1個循環(huán)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR產(chǎn)物送生工生物技術(shù)(上海)公司成都生工測序部進行純化和雙向測序。

數(shù)據(jù)處理：測序后先在GenBank上對比，然后再上傳獲得GenBank登錄號；同時，將所得序列與其他物種建立系統(tǒng)聚類樹以比較遺傳距離：外類群和其他內(nèi)類群的DNA序列下載自GenBank，包括櫛角魚蛉Chauliodespectinicornis(KR148304.1)、污翅斑魚蛉N.fraternus(KF785799.1)、緣點斑魚蛉N.bowringi(JQ351950.1)、圓端斑魚蛉N.rotundatus(KF771894.1)、散斑魚蛉N.punctatolosus(JX110703.1)和碎斑魚蛉N.parasparsus(AQU14296.1)，利用DNAman程序打開序列，與峰圖軟件(Chromas)對齊以及與BioEdit進行序列比對，檢查變異序列并剪掉不必要的序列，然后保存為.pir文件，再將此文件導(dǎo)入DanSP 5.0中，生成.nex單倍型文件。再使用Primer，與從GenBank上獲得的COⅠ序列重新命名，在PAUP 4.10中運行NJ 樹，設(shè)置重復(fù)1 000代，得到的樹文件(.tre)通過FigTree 1.4.4進行可視化和樹的美化，同時利用bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗各分支的支持率，物種兩兩之間的遺傳距離通過MEGA 6.0(Tamuraetal.，2013)中的P-distance遺傳距離方法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 試蟲物種鑒定

試蟲養(yǎng)殖至成蟲后，通過形態(tài)鑒定，確定為雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉。2種試蟲的幼蟲和蛹的COⅠ序列GenBank登錄號分別為：MW560981和MW560982。

7種斑魚蛉的COⅠ種間遺傳差異為0.089～0.210(表1)，雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉與斑魚蛉屬其他物種的種間遺傳距離范圍分別為0.111～0.190和0.099～0.176。在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中，雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉分別形成了單獨的分支(圖1)，支持率為63.1%，與碎斑魚蛉聚在一起形成姐妹群，支持率為55.2%，污翅斑魚蛉和圓端斑魚蛉聚集在一起，支持率為99.9%。

表1 基于COⅠ序列數(shù)據(jù)的斑魚蛉屬部分物種之間的遺傳距離Table 1 Genetic distance between some species of the genus Neochauliodes based on COⅠ sequence data

2.2 幼蟲形態(tài)描述

2.2.1 雙齒斑魚蛉末齡幼蟲體長5.10 cm±0.01 cm，體寬0.75 cm±0.05 cm(n=10)(表2)，身體較為粗壯，頭和前胸背板為黑色或黑棕色且基本無花紋，通體呈棕色或棕褐色(圖2：A、B)。

表2 雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉末齡幼蟲形態(tài)測量Table 2 Morphometric information of the final-instar larvae of Neochauliodes bicuspidatus and N. tonkinensis

頭部：長0.55 cm±0.05 cm，寬0.55 cm±0.15 cm。上唇圓形，淡黃色，中部具有2個暗褐色斑紋和幾根剛毛。上顎黑色且光滑，骨化明顯。外顎葉黃白相間且上面被毛，下顎棕色。觸角長0.21 cm±0.01 cm，4節(jié)，棕色，第2節(jié)最長，第2節(jié)約是第4節(jié)的1.80倍，觸角的近似比例為4∶9∶3∶5。頭部腹面無明顯的花紋，多凹點(圖2：C)。

胸部：前胸寬0.70 cm±0.01 cm，長0.60 cm±0.01 cm，中后胸長寬基本一致。前胸背板黑色或黑棕色，光滑，兩側(cè)具細(xì)長剛毛，前胸背板腹面前緣有4道黃色豎線，中上部有1個半月牙形紅棕色骨化片；中后胸背板具有較復(fù)雜且左右對稱的黑色花紋。足棕色，每個足末端各有2個小爪子，足兩側(cè)密被剛毛，每只足腹面的前側(cè)毛少于后側(cè)毛且長毛和短毛間隔排列(圖2：D、E、F)。

腹部：長3.12 cm±0.10 cm，10節(jié)，腹節(jié)寬度呈遞減趨勢，與相應(yīng)呼吸鰓比例近似為 1.14∶1.15∶1.15∶0.94∶0.88∶0.97∶0.69∶0.56(表3)。蟲體表面密被短鈍剛毛，每一腹節(jié)有明顯的居中橫狀無毛區(qū)；腹面比背面顏色鮮艷，每一腹節(jié)都有“∵”形(圖2：G，圖3：A、B、C)的大黃斑點，因體色、體型的差異，顏色和大小存在細(xì)微不同。斑點中央具1個短粗黑斑，腹節(jié)中部長短不一的橫狀無毛區(qū)與下方斑點組成類似“T”型的區(qū)域，但兩者并未直接相連(圖2：G)。腹節(jié)左右兩側(cè)有對稱的3、4條短線無毛區(qū)。第8腹節(jié)后緣有1對呼吸管，呼吸管長0.20 mm±0.03 mm，第10腹節(jié)尾端兩側(cè)各有1對骨化的鉤子(圖2：H)，其基部棕黃色，頂端棕黑色。第6腹節(jié)的寬度和氣管鰓長度變化明顯。背面棕色，表面斑點可能被覆蓋(圖3：D)，少數(shù)為棕褐色，表面具有細(xì)碎黃色斑點(圖3：E、F)。

表3 雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉末齡幼蟲腹節(jié)及對應(yīng)氣管鰓測量Table 3 Morphometric information of the abdominal sections and tracheal gills of the final-instar larvae of Neochauliodes bicuspidatus and N. tonkinensis

2.2.2 越南斑魚蛉末齡幼蟲越南斑魚蛉末齡幼蟲與雙齒斑魚蛉末齡幼蟲整體較相似(圖4:A、B)，前者除整體體色略淡外，其他不同之處如下：

體長5.15 cm±0.15 cm，體寬0.59 cm±0.01 cm(n=10)，身體較為纖細(xì)，額部具有明顯“∵”形淡黃色單眼(圖4：C)，前胸背板具有復(fù)雜花紋(圖4：D)，光滑，身體附有密集、大小不等的黃色斑點，腹面斑紋存在變異。

頭部：長0.48 cm±0.03 cm，寬0.45 cm±0.05 cm，頭部紅棕色或棕黑色，額部有可見的“∵”形淡黃色單眼(圖4：C)。觸角長0.20 cm±0.01 cm，4節(jié)，棕色，第2節(jié)和第4節(jié)最長，第2節(jié)約是第4節(jié)的1.50倍，觸角的近似比例為3∶9∶2∶6。

胸部：前胸背板長0.53 cm±0.03 cm，寬0.45 cm±0.05 cm，紅棕色或棕黑色，具有復(fù)雜花紋(圖4：D)，兩側(cè)具有細(xì)長纖毛，中后胸長寬幾乎相等，近方形，具有復(fù)雜對稱的花紋(圖4：E)，足端的2個小鉤及跗節(jié)部分上的毛明顯少于雙齒斑魚蛉(圖4:F、G)。

腹部：長度3.50 cm±0.01 cm，灰褐色或棕色，腹節(jié)寬度先略增后減少，呼吸鰓明顯修長，尤其第6～8節(jié)，每個腹節(jié)與對應(yīng)呼吸鰓的長度比例關(guān)系為0.93∶0.89∶0.89∶0.94∶0.79∶0.71∶0.56∶0.34(表3)。背面具有密集、大小不等的黃色斑點(圖4：H)，且每一腹節(jié)前后各有1對由細(xì)碎小斑點聚集成的較大黃色斑點(圖4：H)和明顯的橫線和斜線(圖4：H)。腹面每節(jié)兩側(cè)有2條彎曲的線條(圖4：I)。腹部第8節(jié)后緣有1對呼吸管(圖4：J)，呼吸管長0.18 cm±0.05 cm。

腹部腹面斑紋存在一定的變異，經(jīng)統(tǒng)計共有2種斑型(n=20)：Ⅰ型約25%，Ⅱ型約60%，約15%的個體兼具2種斑型。Ⅰ型斑紋a、b兩者近似平行(圖5：A、B)，ⅠA型斑紋的a、b、c部分大小近似相等，比ⅠB型斑紋的相應(yīng)部分略寬且d區(qū)域較窄；Ⅱ型斑紋a、b兩者成分開趨勢(圖5：C、D)，ⅡA型斑紋的c部分比ⅡB型斑紋的寬。

2.3 蛹形態(tài)描述

2.3.1 雙齒斑魚蛉蛹形態(tài)描述在自然狀態(tài)下，蛹呈“C”形彎曲，體色根據(jù)時間而變化：剛化蛹1 d時頭部、觸角、胸背板及2對翅芽嫩黃色，腹部黑褐色，3～4 d時體色幾乎變?yōu)楹谏?圖6：A、B、C)，直至快羽化時體色會再加深。頭部較短粗，近與前胸等寬，頭頂近三角形，有一些長的剛毛；觸角絲狀，彎曲到頭部的腹面。復(fù)眼卵球形，突出。唇短于頭部，大顎與末齡幼蟲相似，前半部分黑色，后半部分棕紅色，有黑色斑點(圖6：B、D)。前胸長度稍短于寬度，中胸和后胸較為健壯，有黑色無規(guī)則的斑點，表面被附有較多細(xì)毛；2對翅芽健碩；腹部飽滿粗壯，腹面可見類似其末齡幼蟲的斑紋，腹部第9節(jié)背腹面具有細(xì)長密集的毛(圖6：E、F)，生殖器發(fā)育完全。

2.3.2 越南斑魚蛉蛹形態(tài)描述越南斑魚蛉蛹與雙齒斑魚蛉蛹整體較相似，后者除整體體色略深、體色變化較快外，其他不同之處如下：

前額凹陷明顯；復(fù)眼卵球形，棕褐色；大顎棕色，與其末齡幼蟲相似；腹部腹面有較清晰的斑紋，且每個腹節(jié)兩側(cè)的下角處有黑點狀斑紋，背面有明顯、細(xì)碎、大小不一的黃色斑塊(圖7：A、B、E)；生殖器發(fā)育健全，腹面飽滿、光滑無毛(圖7：F、G、H)。

根據(jù)發(fā)育時間，蛹期體色從嫩黃色(圖7：C)到金黃色(圖7：A、B)再到黑色(圖7：D)，翅芽變化尤其明顯。

3 結(jié)論

雙齒斑魚蛉末齡幼蟲除了體色上略有差異，總體特征相對穩(wěn)定，而越南斑魚蛉末齡幼蟲種內(nèi)形態(tài)特征差異較大。兩者之間較為穩(wěn)定的形態(tài)特征差異見表4。

表4 2種斑魚蛉末齡幼蟲形態(tài)差異Table 4 Morphological difference of the larvae of two species of Neochauliodes

2種蛹的形態(tài)特征總體上差異不大，具體差異為：前者蛹體色較深，隨時間體色變化大，后者即便是羽化前1～2 d也只是2對翅芽顏色加深近黑色，頭、觸角及胸背板部分變棕黑色；前者的腹部第9節(jié)背腹面有密集纖長的剛毛，而后者相同部位光滑，幾乎無毛。

形態(tài)上的差異性狀對于2種斑魚蛉幼蟲和蛹的鑒別具有一定的參考價值，但幼蟲的花紋和體色變異較大，不易作為穩(wěn)定的鑒別特征，且蛹的體色會隨時間而不斷改變。

4 討論

本研究形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉與其他物種存在明顯的差異；系統(tǒng)發(fā)育分析也表明，雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉在系統(tǒng)發(fā)育樹中分別形成了2個單獨的分支，因此認(rèn)為兩者很可能為2個獨立的物種；然而，由于樣本獲取難度大，雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉樣本較少，本研究中分子生物學(xué)數(shù)據(jù)較為單薄，不排除后期研究中在獲取更多樣本后，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)果不一致的情況，即雙齒斑魚蛉種群和越南斑魚蛉種群聚在一起，形成一個大的分支，表明兩者形態(tài)學(xué)的差異是由于個體變異導(dǎo)致。例如，雙齒斑魚蛉末齡幼蟲的足和一些呼吸鰓末端具有黑色斑點，是因受傷導(dǎo)致，或者受環(huán)境尤其是水質(zhì)的影響。因此，在后期研究中將進一步補充更多的樣本，對現(xiàn)有結(jié)果進行驗證，以明確雙齒斑魚蛉和越南斑魚蛉的分類和系統(tǒng)發(fā)育地位。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉星月教授協(xié)助鑒定物種并對論文撰寫提出寶貴意見，感謝沈華瑞、何緒康、沈載富等在標(biāo)本采集和養(yǎng)殖過程中的協(xié)助和支持。