LncRNA UCA1通過調(diào)節(jié)miR-206/PTP1B軸影響宮頸癌細胞增殖 遷移及侵襲*

馮艷 孫延霞 賀晶 李紅霞

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，陜西 延安 716000)

宮頸癌是全世界女性第四位常見癌癥，雖然宮頸篩查降低了宮頸癌的發(fā)病率和死亡率，但據(jù)統(tǒng)計，2018年全球?qū)m頸癌新增病例約為569847例，死亡人數(shù)為311365人[1]。90%以上的宮頸癌死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家。發(fā)達國家中美國和東南亞地區(qū)2018年仍有13240和62356例新增宮頸癌病例[1-2]。宮頸癌疾病形勢依然嚴(yán)峻，因此，闡明宮頸癌發(fā)病機制對宮頸癌的治療具有十分重要的意義。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是長度大于200個堿基的長鏈非編碼序列[3]，其通過染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與調(diào)控基因表達，在多種癌癥的發(fā)生和疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。據(jù)報道，lncRNAs的異常表達與宮頸癌預(yù)后相關(guān)[5]。LncRNA尿路上皮癌胚抗原1(LncRNA urothelialcarcinomaassociated1，LncRNA UCA1) 可作為內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)調(diào)控基因表達[6]。除此以外，還作為致癌基因，與人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。miRNA通過調(diào)控腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥、凋亡、血管生成和代謝，參與腫瘤的生長和進展[8]。研究表明，LncRNA UCA1通過miR-206 / CLOCK軸促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生長和侵襲[9]。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)是一種參與生長因子信號傳導(dǎo)的非受體型致癌啟動子[10]。證據(jù)顯示，miR-206通過下調(diào)蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[11]。本研究探討LncRNA UCA1通過miR-206/PTP1B軸對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為宮頸癌致病機制的探究和治療提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 人原代正常宮頸上皮細胞(NCEC)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；宮頸癌細胞系Siha、CaSki、Hela、ME180、C33A和HEK-293T細胞系購自中國科學(xué)院細胞庫(上海)；si-LncRNA UCA1(si- UCA1)、si-PTP1B、LncRNA陰性對照(si-NC)、miRNA陰性對照(miR-NC)、miR-206 mimic(miR-206)、miR-206 inhibitor(anti-miR-206)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所；PTP1B和GAPDH抗體購自英國Abcam公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TAKARA公司；ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；流式細胞儀購自美國BD公司；酶標(biāo)儀購自美國賽默飛公司；蛋白電泳儀購自美國伯樂。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、分組 本實驗在延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進行，NCEC、Siha、CaSki、Hela、ME180、C33A和HEK-293T細胞均用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待C33A細胞(或HEK-293T細胞)密度達到80%～90%時，0.25%胰酶消化細胞，隨后細胞按4×105個/孔密度接種于6孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，將細胞隨機分為對照組、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-UCA1組(轉(zhuǎn)染si-UCA1)、si-PTP1B組(轉(zhuǎn)染si-PTP1B)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-206組(轉(zhuǎn)染miR-206)、anti-miR-206組(轉(zhuǎn)染anti-miR-206)、miR-NC+si-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC 和si-NC)、miR-206+si-NC組(轉(zhuǎn)染miR-206和si-NC)、anti-miR-206+si-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-206和si-NC)、anti-miR-206+si-UCA1組(轉(zhuǎn)染anti-miR-206和si-UCA1)、miR-NC+si-PTP1B組(轉(zhuǎn)染miR-NC和si-PTP1B)、anti-miR-206+si-PTP1B組(轉(zhuǎn)染anti-miR-206和si-PTP1B)，按照Lipofectamine2000說明書進行si-UCA1、si-PTP1B、si-NC、miR-NC、miR-206和anti-miR-206的轉(zhuǎn)染，終濃度均為50nM，對照組不進行轉(zhuǎn)染操作。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48h后，進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8 C33A細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后， DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，向96孔板中加入100μL細胞懸液(5×103個/孔)。37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μL CCK-8，37℃、5%CO2條件下孵育3h。酶標(biāo)儀測定各孔在450nm處的光密度(OD)值。

1.2.3 普通PCR 收集NCEC 、Siha、CaSki、Hela、ME180和C33A細胞，Trizol法提取樣品中的總RNA，分光光度計測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)2×PCR Master Mix說明書所示，配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94℃、3 min；94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、40 s，35個循環(huán)；72℃、5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物序列表，見表1。

1.2.4 qRT-PCR 收集轉(zhuǎn)染后的C33A細胞，Trizol法提取樣品中的總RNA，分光光度計測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行RT-PCR。反應(yīng)條件：95℃、30s；95℃、5s，58℃、30s，40個循環(huán)；95℃、15s；58℃、30s；95℃、15s。miR-206以U6為內(nèi)參，UCA1以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-206和UCA1的表達。所需引物序列,見表1。

表1 qRT-PCR所需引物序列

1.2.5 Western blot 收集轉(zhuǎn)染后的C33A細胞，RIPA裂解液裂解細胞，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。取30μg蛋白進行SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉室溫封閉3h，PTP1B抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶2000)4℃過夜孵育，PBST清洗后，HRP標(biāo)記二抗(1∶2000)室溫孵育1h。 ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶并拍照。

1.2.6 流式細胞術(shù) 收集轉(zhuǎn)染后的C33A細胞，PBS清洗細胞后，Binding Buffer重懸細胞，隨后加入Annexin V-FITC室溫避光孵育15min，加入PI室溫避光孵育5min，1h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.2.7 Transwell 遷移實驗：上腔室加入100μL C33A細胞懸液(5×104個細胞)，下腔室加入500μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、 5%CO2條件下培養(yǎng)24h。5%戊二醛4℃條件下固定，0.1%結(jié)晶紫室溫染色30min，顯微鏡下觀察。侵襲實驗：Matrigel用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋(稀釋比例1∶5)。取100μL稀釋液加入各上腔室中，37℃孵育至凝固。隨后上腔室加入100μL C33A細胞懸液(5×104個細胞)，下腔室加入500μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、 5%CO2條件下培養(yǎng)24h。5%戊二醛4℃條件下固定，0.1%結(jié)晶紫室溫染色30min，顯微鏡下觀察。

1.2.8 熒光素酶報告實驗 針對UCA1 3′-UTR端和PTP1B 3′-UTR端序列構(gòu)建野生型(WT)和突變型(MUT)報告基因質(zhì)粒。參照1.2.1步驟，將UCA1-WT和UCA1-MUT(或PTP1B-WT和PTP1B-MUT)分別與miR-NC、miR-206共同轉(zhuǎn)染至HEK-293T細胞中，48h后檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)UCA1抑制宮頸癌細胞增殖并促進細胞凋亡 普通PCR檢測發(fā)現(xiàn)，NCEC、Siha、CaSki、Hela、ME180和C33A細胞UCA1基因擴增片段均為單一條帶，大小與預(yù)期相符，可進行下一步的qRT-PCR實驗；對照組、si-NC組和si-UCA1組UCA1基因擴增片段均為單一條帶，大小與預(yù)期相符，可進行下一步的qRT-PCR實驗(見圖1A、圖1B)。qRT-PCR、CCK-8和流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，與NCEC相比，Siha、CaSki、Hela、ME180和C33A細胞UCA1表達均顯著升高(P<0.01)(見圖1A)，其中C33A差異最明顯，因此選擇C33A細胞系進行后續(xù)實驗；與si-NC組相比，si-UCA1組細胞UCA1表達和細胞活力顯著降低(P<0.01)(見圖1B、圖1C)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，見圖1D。

圖1 下調(diào)UCA1抑制宮頸癌細胞增殖并促進凋亡

2.2 下調(diào)UCA1抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲 Transwell實驗結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-UCA1組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 下調(diào)UCA1抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲

2.3 miR-206與UCA1的相互調(diào)控作用 普通PCR檢測發(fā)現(xiàn)，NCEC、Siha、CaSki、Hela、ME180和C33A細胞miR-206基因擴增片段均為單一條帶，大小與預(yù)期相符，可進行下一步的qRT-PCR實驗；si-NC組和si-UCA1組UCA1和miR-206基因擴增片段均為單一條帶，大小與預(yù)期相符，可進行下一步的qRT-PCR實驗。qRT-PCR、熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，與NCEC相比，Siha、CaSki、Hela、ME180和C33A細胞miR-206表達均顯著降低(P<0.05)；與si-NC組相比，si-UCA1組細胞UCA1表達顯著降低(P<0.01)，miR-206表達顯著升高(P<0.01)；miR-206與UCA1的結(jié)合位點(見圖3E)；與miR-NC組相比，miR-206可顯著降低UCA1-WT熒光素酶活性(P<0.01)，而對UCA1-MUT熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)。見圖3。

圖3 miR-206與UCA1的相互調(diào)控作用

2.4 UCA1通過miR-206促進宮頸癌細胞增殖并抑制細胞凋亡 普通PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-NC組、miR-206組和anti-miR-206組miR-206基因擴增片段均為單一條帶，大小與預(yù)期相符，可進行下一步的qRT-PCR實驗。qRT-PCR、CCK-8和流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-206組細胞miR-206表達顯著升高(P<0.01)，anti-miR-206組則顯著降低(P<0.05)；與miR-NC+si-NC組相比，miR-206+si-NC組細胞活力顯著降低(P<0.05))，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，anti-miR-206+si-NC組細胞活力顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-206+si-NC組相比，anti-miR-206+si-UCA1組細胞活力顯著降低(P<0.01)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)。見圖4。

圖4 UCA1通過miR-206促進宮頸癌細胞增殖并抑制細胞凋亡

2.5 UCA1通過miR-206促進宮頸癌細胞遷移和侵襲 Transwell實驗結(jié)果顯示，與miR-NC+si-NC組相比，miR-206+si-NC組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05)，anti-miR-206+si-NC組細胞遷移和侵襲能力顯著升高(P<0.01)；與anti-miR-206+si-NC組相比，anti-miR-206+si- UCA1組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01)，見圖5。

圖5 UCA1通過miR-206促進宮頸癌細胞遷移和侵襲

2.6 miR-206靶向調(diào)控PTP1B miR-206與PTP1B的結(jié)合位點(見圖6A)。由qRT-PCR和Western blot實驗結(jié)果可知，與miR-NC組相比，miR-206組細胞PTP1B-WT熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而PTP1B-MUT熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)；與miR-NC組相比，miR-206組細胞PTP1B蛋白表達顯著降低(P<0.01)，anti-miR-206組PTP1B蛋白表達顯著升高(P<0.01)。見圖6。

圖6 miR-206靶向調(diào)控PTP1B

2.7 miR-206靶向PTP1B抑制宮頸癌細胞增殖并促進細胞凋亡 Western blot、CCK-8和流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-PTP1B組細胞PTP1B蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與miR-NC+si-NC組相比，anti-miR-206+si-NC組細胞活力顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，miR-NC+si-PTP1B組細胞活力顯著降低(P<0.01)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與anti-miR-206+si-NC組相比，anti-miR-206+si-PTP1B組細胞活力顯著降低(P<0.01)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖7。

圖7 miR-206靶向PTP1B抑制宮頸癌細胞增殖并促進細胞凋亡

2.8 miR-206通過靶向PTP1B抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲 Transwell實驗結(jié)果顯示，與miR-NC+si-NC組相比，anti-miR-206+si-NC組細胞遷移和侵襲能力顯著升高(P<0.05)， miR-NC+si-PTP1B組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-206+si-NC組相比，anti-miR-206+si-PTP1B組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05)，見圖8。

圖8 miR-206通過靶向PTP1B抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲

3 討論

宮頸癌是影響女性人群的最常見的惡性腫瘤之一，給女性的健康帶來了嚴(yán)重的威脅[12]。在過去的三十年中，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已大大降低。 然而，宮頸癌仍然是全世界女性中第四位最常見的惡性腫瘤，因此，探究宮頸癌致病機制及尋找新的治療靶點是宮頸癌治療的當(dāng)務(wù)之急。

近年來，越來越多的證據(jù)表明lncRNAs在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用[13]。目前，有證據(jù)表明lncRNAs在癌細胞多種進程中起著關(guān)鍵作用，如細胞增殖、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和轉(zhuǎn)移等[14]。研究表明，lncRNA MEG3通過miR-23 a/APAF1軸抑制喉癌細胞增殖并促進凋亡[15]。lncRNA UCA1通過海綿化抗腫瘤的miRNA促進胃癌的增殖、遷移、免疫逃逸并抑制細胞凋亡[16]。UCA1是一種重要的致癌lncRNA，是人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒H家族成員之一[17]。研究表明， UCA1在胚胎組織中廣泛表達，而在大多數(shù)正常成人組織(除了心臟和脾臟)中不表達[18]。UCA1在多種癌癥中異常上調(diào)并發(fā)揮致癌作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌細胞中UCA1的表達上調(diào)，而敲低 UCA1可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲并促進凋亡，該研究結(jié)果表明，UCA1在宮頸癌細胞中發(fā)揮著促腫瘤的作用。越來越多證據(jù)表明，lncRNA通過海綿化miRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[15-16]。miR-206是miRNA家族成員之一。已有研究證明，miR-206作為腫瘤抑制因子調(diào)控不同腫瘤細胞的生物學(xué)特性[21-22]。UCA1通過抑制miR-206表達促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲[10]。本研究結(jié)果顯示，miR-206在宮頸癌細胞中表達下調(diào)，過表達miR-206可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲并促進凋亡，而敲低miR-206則促進宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲并抑制凋亡。進一步實驗結(jié)果顯示，敲低 UCA1可逆轉(zhuǎn)anti-miR-206對宮頸癌細胞的作用。該研究結(jié)果表明，UCA1通過抑制miR-206表達促進宮頸癌細胞的生物學(xué)進展，在宮頸癌中發(fā)揮著促腫瘤的作用。

PTP1B是一種典型性非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，在代謝信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，在不同癌癥中發(fā)揮抑癌或促癌作用[23]。研究表明，PTP1B以JNK依賴性機制促進卵巢癌細胞的惡性進展[24]，miR-338-3p通過靶向PTP1B在胃癌中發(fā)揮抑癌作用[25]。PTP1B在胰腺腫瘤中高表達，并且與腫瘤轉(zhuǎn)移和分期呈正相關(guān)。下調(diào)PTP1B會顯著抑制胰腺癌細胞的生長、遷移和集落形成，抑制胰腺癌的進展[26]。miR-206通過下調(diào)PTP1B，抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[11]。本研究結(jié)果顯示，敲低PTP1B后，可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲并促進凋亡，miR-206靶向調(diào)控PTP1B，敲低PTP1B可明顯逆轉(zhuǎn)anti-miR-206對宮頸癌細胞的作用。該研究結(jié)果表明，PTP1B在宮頸癌中發(fā)揮著促腫瘤的作用，miR-206通過靶向PTP1B，抑制宮頸癌細胞的生物學(xué)進展。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，LncRNA UCA1通過調(diào)節(jié)miR-206 / PTP1B軸促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果為進一步闡釋宮頸癌細胞的發(fā)病機制及開發(fā)新的治療方法提供了理論依據(jù)。