促人胎結(jié)腸上皮細胞增殖的嬰兒源雙歧桿菌的分離篩選及生物學(xué)性質(zhì)

關(guān)嘉琦，梁勝男，陳慶學(xué)，趙麗娜，解慶剛，霍貴成，李柏良,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 164800）

人與動物的腸道環(huán)境營養(yǎng)豐富，由大量復(fù)雜的微生物聚集而成，其中包括大量益生菌。益生菌是通過定植在人體內(nèi)，改變宿主某一部位菌群組成的一類對宿主有益的活性微生物[1]。越來越多的研究表明，益生菌在動物早期腸道發(fā)育、免疫系統(tǒng)分化、上皮細胞增殖等腸道生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用[2]。例如王世杰等[3]通過動物實驗證實，早期應(yīng)用副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）N1115可促腸上皮細胞增殖分化，完善緊密連接結(jié)構(gòu)完整及腸道黏膜屏障作用。Resta-Lenert等[4]研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）可提高磷酸肌醇3激酶信號分子通路、ERK、p38、c-Jun氨基末端激酶活力，上調(diào)Occludin和ZO-1蛋白磷酸化表達量。

雙歧桿菌作為人體早期腸道發(fā)育的優(yōu)勢菌群，定植在結(jié)腸區(qū)域，是益生菌的重要組成部分。研究表明雙歧桿菌在人類健康中發(fā)揮著重要作用，具有防治便秘[5]、抑制腸道致病菌[6]、調(diào)節(jié)腸道平衡、降低膽固醇[7]、促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、延緩衰老[8]和增強機體免疫活性[9]等生理功能。腸道中定植的雙歧桿菌的種類和數(shù)量可一定程度上反映機體的健康功能[10-12]。

腸道是機體消化吸收能量等營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所，腸道發(fā)育對于維持機體健康具有重要意義。嬰兒出生時腸道發(fā)育尚未成熟，更容易出現(xiàn)感染、產(chǎn)后生長受限和壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病。產(chǎn)后早期是新生兒腸胃結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育的關(guān)鍵時期，當(dāng)腸道發(fā)育不良或受到外界損傷刺激后，可通過分子水平的相關(guān)機制刺激腸道上皮細胞增殖并對其實施調(diào)控。目前一些研究表明，某些雙歧桿菌的胞外蛋白、益生菌代謝產(chǎn)物丁酸及其鹽類[13]、益生菌細胞壁中肽聚糖的水解產(chǎn)物胞壁酰二肽[14]等可參與維持腸道良好形態(tài)、干預(yù)腸道細胞增殖分化、調(diào)節(jié)腸道上皮緊密連接蛋白的合成，從而促進腸道成熟、修復(fù)應(yīng)激損傷[15]。而近年來關(guān)于雙歧桿菌如何作用于腸細胞并干預(yù)其增殖未知，其作用機制研究尚不深入，具有促腸上皮細胞增殖功能的潛力雙歧桿菌有待開發(fā)，綜上，篩選出對人胎結(jié)腸上皮細胞具有促進增殖潛力的嬰兒源雙歧桿菌，對于腸道發(fā)育的生物功能的調(diào)控、對促進嬰幼兒早期腸道發(fā)育成熟以及臨床腸道損傷修復(fù)具有重要意義。

本實驗以嬰兒糞便中分離出的15 株雙歧桿菌為研究對象，對其促進CCD841 CoN細胞增殖的性質(zhì)進行研究，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）的方法篩選出促增殖效果最好的雙歧桿菌，并對篩選出的菌株進行形態(tài)學(xué)特征、生長特性、環(huán)境耐受性、黏附性、安全性等生物學(xué)性質(zhì)的評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胎結(jié)腸上皮CCD841 CoN細胞由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)孟祥晨教授贈送；mMRS培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基中添加0.05%L-半胱氨酸鹽酸鹽） 北京Biotopped公司；血平板培養(yǎng)基鄭州人福博賽生物技術(shù)有限公司；胎牛血清 加拿大Wisent公司；高糖DMEM培養(yǎng)基 美國HyClone公司；胰蛋白酶 美國Sigma公司；0.25%青霉素-鏈霉素雙抗和胰蛋白酶-EDTA 美國Gibco公司；與細胞培養(yǎng)相關(guān)產(chǎn)品 無錫耐思公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）大連Meilune公司；0.22 μm濾膜 美國Millipore公司；青霉素等藥敏試紙 杭州濱和微生物試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）、戊二醛、無水乙醇、叔丁醇 天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Heal Force型細胞培養(yǎng)箱 力康醫(yī)療生物科技控股有限公司；DU800紫外-可見分光光度計 美國Beckman公司；DMLB型光學(xué)顯微鏡 德國徠卡顯微鏡與系統(tǒng)公司；680型酶標(biāo)儀 美國Biorad公司；LDZF-50KB-II立式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；CJ-2D超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司；DHP-927型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；JY-92-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；3-15臺式冷凍高速離心機 美國Sigma公司；YDS-10液氮生物容器 成都金鳳液氮容器有限公司；DW-86L626超低溫冰箱 青島海爾集團；DELTA 320 pH計 美國Mettler-Toledo公司；SU8010電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

將細胞凍存管于37 ℃水浴鍋內(nèi)快速融化；在超凈臺中將凍存液迅速轉(zhuǎn)移至加有3 mL完全高糖DMEM培養(yǎng)基的15 mL無菌離心管中，1 000 r/min離心5 min，去上清液；用5 mL高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細胞后轉(zhuǎn)移至50 mL細胞培養(yǎng)瓶中；于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)；隔天更換新鮮培養(yǎng)基。待細胞貼壁生長為單層且培養(yǎng)瓶底部80%左右被細胞覆蓋時，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次，加1 mL胰蛋白酶消化30 s，加入1 mL高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。將消化下來的細胞轉(zhuǎn)移至15 mL無菌離心管，離心后棄上清液，加入2～3 mL新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，混勻后分瓶，并補加4 mL新鮮培養(yǎng)基，于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)。

1.3.2 雙歧桿菌分離培養(yǎng)與鑒定

采集黑龍江哈爾濱地區(qū)14 名母乳喂養(yǎng)健康嬰兒的糞便樣品。取新鮮糞便樣品置于加有預(yù)還原液（L-半胱氨酸鹽酸鹽3 g/L，大豆蛋白胨2 g/L，121 ℃滅菌15 min）的無菌取樣管中，將糞便樣品用稀釋液10 倍梯度稀釋，在10-6、10-7稀釋度下分別取100 μL涂布于mMRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h后，選取光滑、凸起、邊緣水潤的白色或乳白色菌落鏡檢。將呈V、Y或兩端鈍圓的桿狀形態(tài)菌落劃線于mMRS培養(yǎng)基中，在嚴格厭氧條件下37 ℃培養(yǎng)72 h，選取革蘭氏染色為陽性的菌落，重復(fù)劃線純化，直至獲得鏡檢為純菌株為止。挑取菌落接種于mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h以活化，經(jīng)相同方法傳代2 次，其中第3次的培養(yǎng)時間為16 h，活化所獲得菌液可通過梯度稀釋法進行平板計數(shù)，確定穩(wěn)定期的活菌數(shù)。

細菌基因組DNA的提取、16S rDNA基因片段擴增反應(yīng)的上下游引物、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增反應(yīng)總體系以及擴增條件參照張秋雪等[16]的方法。最后將擴增后得到的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，若擴增產(chǎn)物長度為1 500 bp左右且無雜帶，再將其送至測序公司進行雙向測序。將得到的16 S測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心進行BLAST比對，確定目的基因的歸屬。運用Mega 7.0軟件并采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 供試樣品的制備

參照陳漪汶等[17]的方法，略作修改，具體方法如下：

活菌懸液：取培養(yǎng)16 h的培養(yǎng)液，10 000 r/min離心15 min，PBS洗滌菌體3 次。用PBS重懸菌體，調(diào)整雙歧桿菌的菌數(shù)至107CFU/mL。

活菌上清液：取培養(yǎng)16 h的培養(yǎng)液，用雙蒸水調(diào)整雙歧桿菌濃度至107CFU/mL，10 000 r/min離心15 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾上清液，即為發(fā)酵上清液。

活菌裂解液：取培養(yǎng)16 h的培養(yǎng)液，10 000 r/min離心15 min，PBS洗滌菌體3 次，用無菌水調(diào)整雙歧桿菌濃度至107CFU/mL，冰浴中超聲裂解細胞（工作功率300 W、工作時間2 s、間隔3 s、持續(xù)15 min），顯微鏡下觀察無完整菌體，破碎液于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液，即為活菌裂解液。

滅活菌懸液：取培養(yǎng)16 h的培養(yǎng)液，65 ℃水浴30 min，10 000 r/min離心15 min，PBS洗滌菌體后離心，重復(fù)3 次。用PBS重懸菌體，調(diào)整雙歧桿菌濃度至107CFU/mL。取滅活菌懸液100 μL涂布于mMRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，無菌生長即證明滅活菌懸液制備成功。

滅活菌上清液：取培養(yǎng)16 h的培養(yǎng)液，65 ℃水浴30 min，即得雙歧桿菌滅活上清液。用雙蒸水將調(diào)整乳酸菌濃度至107CFU/mL，10 000 r/min離心15 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾上清液，即為滅活雙歧桿菌發(fā)酵上清液。取滅活上清液100 μL涂布于mMRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，無菌生長即證明滅活菌上清液制備成功。

滅活菌裂解液：取培養(yǎng)16 h的培養(yǎng)液，65 ℃水浴30 min，10 000 r/min離心15 min，收集菌體，并用磷酸緩沖液（pH 7.4）洗滌3 次后，用無菌水調(diào)整雙歧桿菌濃度，在冰浴中超聲破碎細胞（工作功率300 W、工作時間2 s、間隔3 s、持續(xù)15 min），顯微鏡下觀察無完整菌體，破碎液于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液，即為胞內(nèi)提取物。取滅活菌裂解液100 μL涂布于mMRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，無菌生長即證明滅活菌裂解液制備成功。

1.3.4 CCK-8法檢測雙歧桿菌對CCD841 CoN細胞的增殖促進作用

參照趙桉等[18]的方法，略作修改。當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細胞貼壁生長為單層且培養(yǎng)瓶底部80%左右被細胞覆蓋時，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3 次，用胰蛋白酶消化30 s后吹勻，l 000 r/min離心5 min，棄上清液，用含雙抗DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為105個/mL，每孔100 μL細胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板，5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃靜置過夜，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3 次，加入200 μL不含雙抗的高糖DMEM菌懸液。同時設(shè)置空白對照組，每組設(shè)置5 個重復(fù)孔。將15 株菌的活菌懸液、滅活菌懸液、活菌上清液、滅活菌上清液、活菌裂解液及滅活菌裂解液與CCD841 CoN細胞共作24 h，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3 次，每孔加110 μL混合液（100 μL無雙抗DMEM培養(yǎng)液+10 μL CCK-8），孵育1 h后酶標(biāo)儀測波長450 nm處光密度（OD）。增殖率和增殖活性百分比按式（1）、（2）計算：

1.3.5 PCA

對分離得到的15 株嬰兒源雙歧桿菌進行促CCD841 CoN細胞增殖評價實驗，分別以上述雙歧桿菌的活菌與滅活菌的菌懸液、上清液及裂解液對CCD841 CoN細胞的增殖率作為指標(biāo)進行PCA，以期篩選出性能最優(yōu)的益生菌。

1.3.6 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定

參照焦雯姝[19]的方法，略作修改。菌株活化后以2%的接種量接種于mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，每2 h取1 次培養(yǎng)液，測其OD600nm和pH值。

1.3.7 形態(tài)學(xué)特征

1.3.7.1 菌落菌體形態(tài)觀察

將活化后性能優(yōu)良的雙歧桿菌菌株涂布于mMRS固體培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)48 h，取出并觀察菌落形態(tài)；選取一個較大菌落，挑取其中的1/2菌落，進行革蘭氏染色、油鏡觀察菌體形態(tài)。

1.3.7.2 掃描電鏡觀察菌體形態(tài)

參照楊靖鵬等[20]的方法，略作修改。將雙歧桿菌菌液以1 200 r/min離心2 min，將菌泥轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中預(yù)冷的2.5%戊二醛固定，4 ℃過夜。用0.1 mol PBS（pH 6.8或pH 7.2）漂洗10 min×3 次；梯度脫水：50%乙醇脫水10 min，70%乙醇脫水10 min，90%乙醇脫水10 min，100%乙醇脫水10 min×3 次；置換：100%乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）溶液，純叔丁醇各1 次，各15 min。干燥：將樣品置于-20 ℃冰箱30 min，凍干4 h。離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍一層100～150 ?金屬膜。冷場發(fā)射掃描電鏡，電壓1.0 kV，放大倍率15 000～30 000。

1.3.8 耐受性評價

參照蒙月月等[21]的方法，略作修改。使用0.1 mol/L的HCl溶液對mMRS液體培養(yǎng)基的pH值進行調(diào)整，使培養(yǎng)基的pH值為4、5、6。使用牛膽鹽對mMRS液體培養(yǎng)基的膽鹽濃度進行調(diào)整，使培養(yǎng)基的膽鹽質(zhì)量濃度為0.03、0.3、0.5 g/100 mL。菌株活化后以2%的接種量分別接種于經(jīng)過處理的液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，并于0、1、2、3 h取樣，采用平板計數(shù)法對活菌數(shù)進行測定，計算菌株的存活率并分析其耐酸能力。存活率按式（3）計算：

1.3.9 黏附性評價

參照岳瑩雪等[22]的方法，略作修改。

將CCD841 CoN細胞按照2×105個/孔的濃度接種至12 孔板中，37 ℃條件下于CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)至長成單層細胞后，進行黏附實驗。PBS清洗孔板2 次，加入1 mL菌體懸液（108CFU/mL）（V0），每個樣品重復(fù)3 孔，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育2 h。孵育后PBS清洗孔板2 次，洗去未黏附細菌。加胰酶消化30 s后加1 mL含血清高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化。收集孔內(nèi)溶液并分別進行梯度稀釋，采用平板菌落計數(shù)法檢測培養(yǎng)后菌株的活菌數(shù)（V1）。黏附率按式（4）計算：

1.3.10 抗生素抗性實驗

參照高文文等[23]的方法，略作修改。

將待測菌株以2%的接種量接種于mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h后，吸取100 μL菌懸液涂布于mMRS固體培養(yǎng)基上，干燥后分別鑷取各種藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.3.11 溶血實驗

超凈臺中在血平板培養(yǎng)基上劃線，同時以金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為陽性對照，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察有無溶血圈出現(xiàn)[24]。菌落周圍的瓊脂出現(xiàn)綠色，則α-溶血；菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則β-溶血；否則為γ-溶血，即不溶血。

1.3.12 不同條件下K2-21-4對CCD841 CoN細胞增殖活性的影響

將 103、 104、 105、 106、 107、 108CFU/mLBifidobacterium longumK2-21-4的活菌懸液、滅活菌懸液分別與CCD 841 CoN細胞共作24、48 h，細胞增殖活性百分比、增殖率測定方法見1.3.4節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 嬰兒源雙歧桿菌的分離鑒定

選取14 份健康嬰兒的新鮮糞便進行梯度稀釋以及涂布平板，隨機挑取若干株單菌落，純化后進行16S測序，選取16S rDNA同源性99%以上的模式菌株序列，對分離得到的雙歧桿菌菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由16S rDNA同源性分析結(jié)果可知，有13 株菌（K4-4、K6-1、K4-3、K3-4、K24-1、K2-21-4、K13-4、H5-6、B13-2、K6-3、I2-2-3、K2-21-2、K2-21-3）均與B.longumATCC 15707 16S rDNA親緣關(guān)系接近，判定為長雙歧桿菌長亞種；1 株菌（I2-2-1）與B.pseudocatenulatumNWAFU0003 16S rDNA親緣關(guān)系最近，判定為假小鏈雙歧桿菌；1 株菌（E7-1）與B.dentiumBRDF5 16S rDNA親緣關(guān)系最近，判定為齒雙歧桿菌。

圖1 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建雙歧桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Bifidobacterium based on 16S rDNA gene sequences

2.2 具有促進CCD841 CoN細胞增殖的雙歧桿菌篩選

2.2.1 雙歧桿菌菌懸液對CCD841 CoN細胞增殖的影響

增殖活性百分比可用于表示與細胞正常增殖的差異，當(dāng)增殖活性百分比大于1時，表示對于細胞增殖具有促進作用，反之，則有抑制作用。由圖2可知，B.longumK2-21-4活菌懸液對于CCD841 CoN細胞的促增殖作用效果最佳，增殖活性百分比為160.67%，此外B.longumK4-3、B.pseudocatenulatumI2-22-1、B.longumK2-21-2、K6-3、B13-2、K24-1、K3-4、K2-21-3活菌懸液也對CCD841 CoN細胞增殖有促進作用，增殖率分別為40.84%、33.24%、27.78%、25.58%、22.74%、10.85%、4.99%、1.97%。

圖2 各菌株活菌懸液、滅活菌懸液對CCD841 CoN細胞的增殖促進作用Fig.2 Promoting effect of live and inactivated cell suspensions of each isolate on CCD841 CoN cells

15 株雙歧桿菌的滅活菌懸液處理CCD841 CoN細胞后的細胞增殖活性百分比為90.16%～119.68%，峰值較活菌懸液處理組（160.67%）低。15 株雙歧桿菌中有9 株菌的滅活菌懸液對CCD841 CoN細胞有促進作用，增殖活性百分比分別為B.longumK2-21-4（119.53%）、K13-4（119.68%）、H5-6（118.22%）、K24-1（109.09%）、K6-1（104.02%）、K4-4（103.92%）、K4-3（103.51%）、K2-21-2（101.86%）、I2-2-3（101.81%）。

2.2.2 雙歧桿菌上清液對CCD841 CoN細胞增殖的影響

由圖3可知，B.dentiumE7-1（132.02%）、B.longumK6-3（129.69%）、K2-21-2（128.21%）、K2-21-4（126.52%）活菌上清液對于CCD841 CoN細胞具有顯著促增殖作用（P＜0.05），此外B.longumK2-21-3、K13-4、K24-1、K4-4活菌上清液也對CCD841 CoN細胞增殖有促進作用，增殖率分別為20.65%、10.12%、8.43%、1.22%。

圖3 各菌株活菌上清液、滅活上清液對CCD841 CoN細胞的增殖促進作用Fig.3 Promoting effect of culture supernatants of live and inactivated cells of each isolate on CCD841 CoN cells

15 株雙歧桿菌的滅活菌上清液處理CCD841 CoN細胞后的細胞增殖活性百分比為100.98%～117.12%，均表現(xiàn)為促進作用，其中B.longumK2-21-4增殖率為17.12%，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。

2.2.3 雙歧桿菌裂解液對CCD841 CoN細胞增殖的影響

由圖4可知，B.longumK2-21-3活菌裂解液對于CCD841 CoN細胞的促增殖作用效果最佳，增殖活性百分比為118.47%。此外B.longumK6-1（114.74%）、K13-4（111.93%）、I2-2-3（110.61%）、B.pseudocatenulatumI2-22-1（110.48%）、K2-21-2（105.39%）、K6-3（103.20%）、K3-4（100.79%）、K4-4（100.61%）活菌裂解液也對CCD841 CoN細胞增殖有促進作用。

圖4 各菌株活菌裂解液、滅活裂解液對CCD841 CoN細胞的增殖促進作用Fig.4 Promoting effect of live and inactivated cell lysates of each isolate on CCD841 CoN cells

15 株雙歧桿菌的滅活菌懸液處理CCD841 CoN細胞后的細胞增殖活性百分比為70.23%～135.44%，峰值較活菌裂解液處理組高（118.47%）。此外，15 株雙歧桿菌中還有7 株菌的滅活菌裂解液對CCD841 CoN細胞有促進增殖作用，分別為B.pseudocatenulatumI2-22-1（135.44%）、B.longumK6-3（134.86%）、K6-1（130.67%）、K24-1（114.32%）、B13-2（102.64%）、K4-3（100.58%）、K2-21-2（100.41%）。

2.3 PCA結(jié)果

如圖5A所示，PC1和PC2共占總變量的51.373%，PC1解釋為活菌懸液、滅活菌上清液、活菌裂解液。PC2解釋為滅活菌懸液、活菌裂解液。根據(jù)圖5B和表1可以看出，K2-21-4的綜合得分最高，為2.18，其次為K21-4、H5-6得分分別為0.79、0.76，I2-2-3的綜合得分最低。該結(jié)果表明B.longumK2-21-4是15 株益生菌中具有促腸上皮細胞增殖性能且效果最好的益生菌。

圖5 因子載荷圖（A）和因子得分圖（B）Fig.5 PCA loading (A) and score plots (B)

表1 各菌株因子得分Table 1 Scores of first principal components for each strain

2.4 長雙歧桿菌K2-24-1生物學(xué)性質(zhì)

2.4.1 生長曲線、產(chǎn)酸曲線的測定

如圖6所示，B.longumK2-21-4在0～8 h為生長遲滯期，8～20 h后進入對數(shù)生長期，OD600nm值由0.1迅速提高至1.8，此時K2-21-4的生長速度較快。20 h后進入穩(wěn)定期，OD600nm值基本不變，最終穩(wěn)定在1.8左右。長雙歧桿菌在發(fā)酵過程中，因其產(chǎn)生大量乙酸、乳酸和少量甲酸等脂肪酸而使pH值有所降低，從而抑制腸道中有害菌和致病菌的生長。處于對數(shù)生長期與遲滯期的菌株相比，其生長更加旺盛，故pH值由5.5到pH 4.4降低較快。而穩(wěn)定期的菌株生長逐漸穩(wěn)定，代謝產(chǎn)物含量無顯著提升，從而導(dǎo)致pH值也緩慢降低，最終穩(wěn)定在pH 4.3左右。

圖6 長雙歧桿菌K2-21-4的生長曲線和pH值曲線Fig.6 Growth curve of B.longum K2-21-4 and pH variations during its culture

2.4.2 菌落形態(tài)與菌體形態(tài)觀察

分離株B.longumK2-21-4在mMRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)如圖7A所示，為規(guī)則圓形凸起，邊緣整齊、直徑1～3 mm，不透明、乳白色、表面濕潤光滑、挑起后成拉絲狀。如圖7B所示，菌體成短桿狀，單個或成對出現(xiàn)，革蘭氏染色陽性。如圖7C所示，菌體成短桿狀，與光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果一致。

圖7 長雙歧桿菌K2-21-4菌落形態(tài)（A）、菌體形態(tài)（B）及掃描電鏡觀察菌體形態(tài)（C）Fig.7 Colony morphology (A), cell morphology (B) and scanning electron microscopic observation (C) of B.longum K2-21-4

2.4.3 耐受性評價

如圖8A所示，長雙歧桿菌在pH 6、5、4的mMRS培養(yǎng)基中孵育3 h后，K2-21-4的存活率顯著降低（P＜0.05），說明B.longumK2-21-4對pH 4、5、6的耐受能力較差，且酸性越強對長雙歧桿菌的脅迫越大。

圖8 長雙歧桿菌K2-21-4的酸耐受曲線（A）及膽鹽耐受曲線（B）Fig.8 Acid tolerance curve (A) and bile salt tolerance curve (B) of B.longum K2-21-4

如圖8B所示，B.longumK2-21-4存活率隨膽鹽質(zhì)量分數(shù)升高而快速降低。當(dāng)膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.03%時，3 h后其存活率為93.70%，而其他質(zhì)量分數(shù)下，3 h后菌株存活率均為0%。結(jié)果表明B.longumK2-21-4對質(zhì)量分數(shù)0.03%膽鹽有較好的耐受能力，但對質(zhì)量分數(shù)0.3%、0.5%膽鹽無耐受能力。

有報道顯示益生菌只有在達到一定數(shù)量才可發(fā)揮益生功能，而B.longumK2-21-4對于酸脅迫、膽鹽脅迫耐受性不高，因此將B.longumK2-21-4作為潛在功能性益生菌開發(fā)時，需對其進行進一步包埋或其他方式處理，保證其在腸道中的存活率。

2.4.4 黏附性評價

為更好評價B.longumK2-21-4的黏附性，實驗以15 株雙歧桿菌及商業(yè)菌株Lactobacillus animalisBB12為對照，研究雙歧桿菌對CCD841 CoN細胞的黏附能力，結(jié)果如圖9所示。實驗中B.longumK2-21-4的黏附能力顯著高于其他菌株，黏附率達6.6%，僅次于商業(yè)菌株Lactobacillus animalisBB12黏附性（7.5%）。其余高黏附性菌株的黏附率依次為B.pseudocatenulatumH5-6＞B.longumB13-2＞B.pseudocatenulatumI2-22-1＞B.dentiumE7-1＞B.dentiumK4-4，分別為5.85%、3%、2.33%、2.30%和2.16%，其他菌株黏附率較低均不足1%。B.longumK2-21-4的高黏附性或與其在掃描電子顯微鏡觀察下菌體表面具有菌毛的顯微結(jié)構(gòu)有關(guān)，這可以從一定程度上解釋該菌株具有較好促CCD841 CoN細胞增殖效果的原因。同時，15 株雙歧桿菌對細胞的黏附能力存在菌種差異性的同時也存在菌株差異性，這與占萌等[25]研究結(jié)果相符。Maldonadogómez等[26]的結(jié)果也證明長雙歧桿菌具有良好定植性并表現(xiàn)出菌株特異性。

圖9 15 株雙歧桿菌對CCD841 CoN細胞的黏附率Fig.9 Adhesion rates of 15 isolates to CCD841 CoN cells

2.4.5 抗生素抗性實驗

檢測B.longumK2-21-4對12 種抗生素的敏感性，并將金黃色葡萄球菌S.aureusATCC 25923作為質(zhì)控菌株，質(zhì)控范圍依據(jù)NCCLS藥敏實驗標(biāo)準執(zhí)行。如圖10所示，該菌對鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星具有抗性，對青霉素、紅霉素、羅紅霉素中度敏感，對阿莫西林、萬古霉素、四環(huán)素、利福平、氯霉素敏感。有文獻報道干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌以及植物乳桿菌等乳酸菌天然對糖肽類抗生素如萬古霉素具有普遍耐受性，而K2-21-4則對萬古霉素表現(xiàn)出敏感[27]。表2結(jié)果表明，B.longumK2-21-4對喹諾酮類、氨基糖苷類部分抗生素耐受，這可能是由于雙歧桿菌產(chǎn)生分解氨基糖苷類的酶，從而使其對此類抗生素耐受，與相關(guān)文獻[27]報道的此類抗生素對革蘭氏陽性菌效果普遍較差一致。劉奮[28]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌對青霉素、氯霉素、氧氟沙星等藥物仍普遍敏感，這一結(jié)果與實驗菌株K2-21-4相似。石晶紅[27]研究發(fā)現(xiàn)實驗菌株對特定抗生素是否敏感，是菌株本身的特性。

圖10 長雙歧桿菌K2-21-4對抗生素的抗性Fig.10 Resistance of B.longum K2-21-4 to several antibiotics

表2 長雙歧桿菌K2-21-4對抗生素的抗性Table 2 Resistance of B.longum K2-21-4 to several antibiotics mm

2.4.6 溶血實驗

某些益生菌可能具有潛在的溶血性，從而引起敗血癥[29]。通過在含有動物或人血的培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物觀察有溶血活性引起的物理變化是評估溶血性的常用方法[30]。由圖11可知，陽性對照Staphylococcus aureusATCC 25923菌落周圍可見明顯透明圈，即致病性較強的β-溶血，而B.longumK2-21-4菌落周圍未溶血，菌落外圍無顏色變化，不具有溶血性。

圖11 金黃色葡萄球菌ATCC 25923（A）和長雙歧桿菌K2-21-4（B）溶血活性Fig.11 Hemolysin activities of S.aureus ATCC 25923 (A) and B.longum K2-21-4 (B)

2.4.7 長雙歧桿菌K2-21-4濃度和處理時間對CCD841 CoN細胞增殖活性的影響

為進一步確定B.longumK2-21-4對CCD841 CoN細胞增殖促進作用的最佳條件，研究不同活性狀態(tài)、添加濃度和培養(yǎng)時間下B.longumK2-21-4對CCD841 CoN細胞的增殖促進作用。由圖12可知，當(dāng)活菌與細胞共作24 h時，細胞增殖活性百分比呈現(xiàn)出一定的濃度依賴，當(dāng)活菌濃度達到107CFU/mL時，對細胞的增殖促進作用顯著提高（P＜0.05），與108CFU/mL活菌無顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)活菌與細胞共作48 h時，細胞增殖活性百分比普遍低于同劑量活菌共作24 h的效果，當(dāng)活菌濃度達到107CFU/mL時，對細胞的增殖促進作用最好，而108CFU/mL時則顯著降低（P＜0.05）。滅活菌與細胞共處理24 h后，滅活菌劑量達107CFU/mL時，細胞增殖活性百分比顯著提升，與108CFU/mL滅活菌組差異不顯著（P＞0.05）。滅活菌與細胞共處理48 h后，細胞增殖活性百分比普遍低于同劑量活菌共作24 h的效果，其中108CFU/mL滅活菌組對細胞增殖表現(xiàn)出顯著抑制作用。

圖12 菌濃度及處理時間對CCD841 CoN細胞增殖的影響Fig.12 Promoting effect of live and inactivated cells of B.longum K2-21-4 at different concentrations on the proliferation of CCD841 CoN cells ater co-culture for different durations

添加107CFU/mL長雙歧桿菌K2-21-4活菌與細胞共作24 h的細胞增殖促進作用，顯著高于其他濃度活菌與細胞共作24、48 h（P＜0.05），在此條件下，細胞增殖率可達60.67%，是活菌懸液對細胞增殖促進作用的最佳條件。添加107CFU/mL長雙歧桿菌K2-21-4滅活菌與細胞共作24 h的細胞增殖促進作用，顯著高于其他濃度滅活菌與細胞共作24、48 h（P＜0.05），此時細胞增殖率可達20.09%，是滅活菌懸液對細胞增殖促進作用的最佳條件。

3 結(jié) 論

本實驗從健康嬰兒新鮮糞便中分離得到15 株雙歧桿菌（經(jīng)16S同源性比對為13 株長雙歧桿菌、1 株假小鏈雙歧桿菌、1 株齒雙歧桿菌），以此作為研究對象，以雙歧桿菌活菌及滅活菌的菌懸液、發(fā)酵上清液及裂解液對人胎結(jié)腸細胞CCD841 CoN細胞增殖的促進作用為篩選指標(biāo)，篩選出對結(jié)腸上皮細胞具有促進增殖效果的益生菌。結(jié)果顯示，一些雙歧桿菌活菌懸液、菌體細胞破碎液及菌體發(fā)酵上清液具有一定促進效果，且不同菌株實驗效果不同。PCA結(jié)果表明B.longumK2-21-4的得分最高，故對其生物學(xué)性狀進一步分析。結(jié)果顯示K2-21-4具有良好黏附性，但對酸、膽鹽耐受能力較差，抗生素抗性實驗結(jié)果表明菌株K2-21-4對阿莫西林、萬古霉素、四環(huán)素、氯霉素及利福平具有耐藥性，107CFU/mL長雙歧桿菌K2-21-4活菌與細胞共作24 h的細胞增殖促進作用最佳。以上研究結(jié)果表明B.longumK2-21-4具有潛在的應(yīng)用價值。