嗅覺可視化技術(shù)對啤酒品質(zhì)的快速檢測

楊 梅，翟曉東，黃曉瑋，李 崎*，鄒小波,*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，青島啤酒股份有限公司，山東 青島 266100；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

啤酒是以麥芽、酒花、水為主要原料，并在酵母菌作用下進(jìn)行釀造而形成的一類飲料。啤酒按照釀造工藝可以分為2 種，分別為上發(fā)酵啤工藝和下發(fā)酵工藝[1]。上發(fā)酵工藝是指酵母在麥芽汁頂部發(fā)酵，特點是發(fā)酵溫度高、時間短，以此生產(chǎn)出來的啤酒一般稱為Ale啤酒。下發(fā)酵工藝是指酵母在麥芽汁底部發(fā)酵，特點是發(fā)酵溫度低、時間長，以此生產(chǎn)出來的啤酒一般被稱為Lager啤酒。另一種分類方式按照啤酒的色澤進(jìn)行分類，通常分為淡色啤酒、濃色啤酒、黑色啤酒。此外，還有使用乳酸菌進(jìn)行二次發(fā)酵的白?。徊捎脽o菌技術(shù)釀造的純生啤酒；加入果汁釀造而成的果啤等。這些生產(chǎn)原料以及釀造工藝的區(qū)別賦予啤酒不同的品質(zhì)，而品質(zhì)檢測是保障啤酒品質(zhì)的關(guān)鍵程序。

目前，啤酒品質(zhì)評價最直接的方法是人工感官評定法[2]，但感官評定容易受到嗅覺疲勞等客觀因素的影響。其次，在理化檢測方法中，較常用的方法有氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[3-4]和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[5-6]等。這些方法能夠準(zhǔn)確測定啤酒中的各種成分，但分析過程耗時長、步驟繁瑣。電子鼻系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)食品氣味成分的檢測，且具有快速、無損的優(yōu)點。電子鼻在酒類品質(zhì)檢測中的研究已有報道[7-8]，但是電子鼻系統(tǒng)采用的金屬氧化物傳感器價格相對昂貴。

嗅覺可視化技術(shù)可以利用可視化傳感器與待測氣體反應(yīng)前后的顏色變化對待測物進(jìn)行定性、定量分析[9]。其原理在于嗅覺可視化傳感器與待測分子之間可以通過范德華力、氫鍵等作用力，以及金屬鍵、極性鍵等較強化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生信號[10]。相比于GC-MS和HPLC，嗅覺可視化技術(shù)具有檢測速度快、成本低等優(yōu)勢。而相比于電子鼻系統(tǒng)，嗅覺可視化成像更加直觀、快速，同時降低了成本，因此更適合大批量檢測。目前，嗅覺可視化技術(shù)在多種食品品質(zhì)檢測中的可行性得到了驗證，包括肉品[11-12]、小麥[13]、紅茶[14]和蔬菜[15]等固態(tài)食品，以及香醋[16]、白酒[17]和咖啡[18]等液態(tài)食品。然而，嗅覺可視化技術(shù)在啤酒品質(zhì)檢測中的研究仍較少[19]。

由于啤酒中含有各種酯、高級醇、醛、有機酸和硫化物等揮發(fā)性化合物[20-21]，而不同的啤酒揮發(fā)性成分具有一定的差異，因此這些揮發(fā)性物質(zhì)可作為其特異性識別分子。青島啤酒是我國最早的啤酒品牌之一，暢銷國內(nèi)外，深受消費者的好評。利用嗅覺可視化技術(shù)對青島啤酒品質(zhì)的快速、無損檢測目前鮮見報道。因此，本研究擬利用嗅覺可視化傳感器對不同種類的青島啤酒進(jìn)行定性區(qū)分以及關(guān)鍵品質(zhì)指標(biāo)的定量預(yù)測，為實現(xiàn)啤酒品質(zhì)的快速、無損檢測提供一種有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

同批次的純生、1903、奧古特、白啤、黑啤、皮爾森、IPA、Strong共8 種啤酒樣品，每種啤酒20 瓶、每瓶330 mL 青島啤酒有限公司。

氯苯、乙醇、鄰苯二胺、鹽酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（≥99.7%）、卟啉、卟啉化合物美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司；BS-224S分析天平 德國Sartorius儀器設(shè)備制造有限公司；Cary100紫外-可見光光度計 美國Agilent科技公司；CC-4603-01毛細(xì)管 亞速旺（上海）商貿(mào)有限公司；KQ-100KDE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；嗅覺可視化檢測系統(tǒng)由本實驗室自主搭建。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

所有啤酒以未開封狀態(tài)，置于4 ℃的冰箱中密封冷藏保存。啤酒、苦味和色度等參數(shù)由青島啤酒公司提供，如表1所示。

表1 8 種不同類型的青島啤酒樣品Table 1 Information of eight Tsingtao beer samples examined in this study

1.3.2 嗅覺可視化傳感器的制備

選取具有較強響應(yīng)信號的9 種卟啉類化合物以及7 種酸堿指示劑，制備成4×4的嗅覺可視化傳感器陣列。

將聚四氟乙烯薄膜裁剪成3 cm×3 cm的正方形基底材料備用。卟啉以及卟啉類化合物分別溶解于氯苯中，酸堿指示劑溶解于無水乙醇中。2 種溶液的濃度均為0.05 mol/L，超聲振蕩50 min后，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｊ褂?00 mm×0.3 mm的毛細(xì)管作為微量取樣器。將金屬卟啉溶液以及10～16的傳感器材料（依次為中性紅、亞甲基藍(lán)、溴酚藍(lán)、溴甲酚綠、溴甲酚紫、甲基紅、百里酚藍(lán)）分別滴1 滴樣在聚四氟乙烯薄膜上，形成4×4的傳感器陣列，制作完成的傳感器陣列置于通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干，風(fēng)干完成后迅速置于黑暗、且充滿氮氣的密封環(huán)境中保存。制作的嗅覺可視化傳感器陣列如圖1所示。

圖1 嗅覺可視化傳感器陣列Fig.1 Image of the olfactory visualization sensor array

1.3.3 啤酒質(zhì)量指標(biāo)的測定

根據(jù)GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中方法對啤酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)（容量法）、原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)（密度瓶法）和雙乙酰質(zhì)量濃度進(jìn)行測定。

1.3.4 響應(yīng)信號的采集與提取

嗅覺可視化傳感器的實驗裝置與數(shù)據(jù)采集均參考文獻(xiàn)[22]方法。分別對8 種啤酒進(jìn)行15 次平行測試，獲取嗅覺可視化傳感器與啤酒樣本揮發(fā)性成分發(fā)生反應(yīng)前后的圖像。通過Matlab2018軟件提取傳感器陣列上每個傳感器區(qū)域的紅（R）、綠（G）、藍(lán)（B）平均值。傳感器反應(yīng)前后的R、G、B均值的差值取絕對值作為傳感器的響應(yīng)信號，分別按照式（1）～（3）[23]計算。

式中：ΔR、ΔG和ΔB分別為傳感器反應(yīng)前后R、G、B均值的差值絕對值；Ra、Ga和Ba分別為傳感器反應(yīng)前的R、G、B均值；Rb、Gb和Bb分別為傳感器反應(yīng)后的R、G、B均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒質(zhì)量指標(biāo)分析

表2顯示了8 種青島啤酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)、原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)和雙乙酰質(zhì)量濃度。由于Strong啤酒的高原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)和高發(fā)酵度，其3 種質(zhì)量指標(biāo)均最高，而純生啤酒的3 種質(zhì)量指標(biāo)含量均最低。其中，Strong啤酒乙醇體積分?jǐn)?shù)（9.0%）約為純生啤酒（3.1%）的3 倍；其他6 種啤酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)較為接近，處于4.1%～5.8%之間。兩者的原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)也相差較大，Strong啤酒原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)（21.0%）約為純生啤酒（8.1%）的2.6 倍。其他6 種啤酒的原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于10.4%～15.8%之間。由于啤酒的原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)很大程度上決定了啤酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)，因此原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)與乙醇體積分?jǐn)?shù)的測量結(jié)果較為類似。其中，黑啤原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較高，可能是因為黑啤中加入了焦糖，使測得的啤酒真正濃度的值較高，從而引起測得的原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的值較高。Strong啤酒雙乙酰質(zhì)量濃度（0.11 mg/L）約為純生啤酒（0.03 mg/L）的4 倍，其他6 種啤酒的雙乙酰質(zhì)量濃度處于0.04～0.10 mg/L之間。

表2 8 種不同啤酒的質(zhì)量指標(biāo)Table 2 Quality indicators of eight kinds of beer

2.2 嗅覺可視化傳感器對不同種類啤酒的判別分析

2.2.1 不同啤酒的傳感器響應(yīng)特征

由圖2可知，不同色素與不同的啤酒樣品反應(yīng)后呈現(xiàn)出不同程度的顏色變化，其中，Strong啤酒的傳感器陣列顏色變化值與其他7 種呈現(xiàn)出明顯的不同，這與其質(zhì)量指標(biāo)含量均最高的特征一致。

圖2 嗅覺可視化傳感器與不同種類啤酒反應(yīng)后的RGB差值圖像Fig.2 RGB difference images of the olfactory visualization sensor array in response to different beer samples

2.2.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）每個嗅覺可視化傳感器陣列有16 個傳感色素點，而每個色素點擁有ΔR、ΔG和ΔB這3 個顏色變量，因此每個嗅覺可視化陣列的變量個數(shù)為48。PCA通過正交變換對可能存在相關(guān)性的變量轉(zhuǎn)換為線性不相關(guān)的變量，在對變量進(jìn)行降維的同時，也盡可能多地保留了原始變量特征[24]。圖3為嗅覺可視化傳感器前3 個PC投影圖?？梢园l(fā)現(xiàn)8 種不同種類的啤酒基本能被清晰地區(qū)分開。前3 個PC

方差貢獻(xiàn)率的之和為66.60%。但是奧古特、純生和1903

牌啤酒在圖3中的離散程度相對于其他樣品較低?？赡苁且驗檫@3 種啤酒均為Lager啤酒，只是在配方、酵母品種和制作工藝上略有差別。此外，IPA牌啤酒和黑啤的點陣與其他點陣分隔明顯較遠(yuǎn)。可能是由于IPA采用了特種麥芽和特種酵母，從而比其他啤酒具有更加濃郁的酒花香氣；而黑啤中添加黑麥芽和焦香麥芽等原材料，其風(fēng)味較其他啤酒有明顯不同。

圖3 不同啤酒的前3 種PC的三維投影圖Fig.3 Three-dimensional score pot of top three principal components for different beer samples

2.2.3 鄰算法模型（K-nearest neighbor，KNN）識別

KNN模型通過對距離度量函數(shù)計算出待測樣本x與每個預(yù)測樣本集數(shù)據(jù)的距離，并對計算出的距離進(jìn)行排序。如果一個樣本在特征空間中的K個最相鄰樣本中的大多數(shù)屬于某一個類別，則該樣本也屬于這個類別[25]。KNN模型以PCA的分向量作為輸入向量，每個樣品對應(yīng)的類別作為輸出向量，采用不同的PC數(shù)和K值對模型進(jìn)行優(yōu)化，以校正集的最高識別率作為判斷優(yōu)化結(jié)果理想程度的依據(jù)。按照2∶1的比例將120 個啤酒樣品隨機分為校正集組（80 個）和預(yù)測集組（40 個）。選取前10 個PC數(shù)和9 個參數(shù)K值對KNN模型進(jìn)行同步優(yōu)化，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)參數(shù)K為7，PC數(shù)為10時，校正集的識別率達(dá)92.5%，預(yù)測集的識別率達(dá)87.5%。

圖4 不同種類啤酒的KNN模型的校正集（a）、預(yù)測集（b）結(jié)果Fig.4 Results of KNN model discrimination of different beer samples in calibration (a) and validation sets (b)

2.2.4 線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）模型識別

與PCA類似，LDA也是一種降維方法，其基本思想是將多維數(shù)據(jù)投影到低維空間，將不同組的數(shù)據(jù)盡可能分開，使得新生成的組有最大的組間距離和最小的組內(nèi)距離[26-27]。LDA同樣以PCA的分向量作為模型的輸入變量，每個樣品對應(yīng)的類別作為輸出變量。如圖5所示，當(dāng)PC數(shù)從1逐漸上升時，校正集和預(yù)測集模型的識別率也逐漸上升；而當(dāng)PC數(shù)超過3時，校正集和預(yù)測集的識別率有所下降。當(dāng)PC數(shù)為3時，預(yù)測集和校正集的識別率均達(dá)到最高的100%。出現(xiàn)此情況的原因可能是當(dāng)PC數(shù)較小時，數(shù)據(jù)量不足以對樣本做最精確的分類；當(dāng)PC數(shù)超過3并逐漸增加時，出現(xiàn)了冗余信息，因此識別率降低。因此，PC數(shù)為3時，能夠取得最佳預(yù)測效果。

圖5 不同種類啤酒的LDA模型的校正集和預(yù)測集結(jié)果Fig.5 Results of LDA model for different beer samples in calibration and validation sets

綜上所述，KNN和LDA模型都能夠?qū)Σ煌那鄭u啤酒進(jìn)行定性區(qū)分。其中LDA模型選用的PC數(shù)比KNN少，而識別率更高。因此，建立的LDA模型為不同青島啤酒的最佳定性判別模型。

2.3 嗅覺可視化技術(shù)對啤酒質(zhì)量指標(biāo)的定量預(yù)測

2.3.1 偏最小二乘（partial least square，PLS）法模型分析

PLS法是經(jīng)典的多元校正方法，能夠克服常見的數(shù)據(jù)集共線性問題[28]。由于嗅覺可視化傳感器中的不同傳感器點可能存在同時對某一類或者多類物質(zhì)具有響應(yīng)的特征，使得傳感器點的色度值之間存在相關(guān)性，因此PLS適用于嗅覺可視化傳感器的數(shù)據(jù)分析[29]。本研究中，將嗅覺可視化數(shù)據(jù)的PC作為自變量，啤酒理化指標(biāo)的實際測量值為因變量，構(gòu)建啤酒理化指標(biāo)的定量模型。一般情況下，PLS模型中的交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）越小，建立的預(yù)測模型的預(yù)測能力越強。本研究根據(jù)啤酒質(zhì)量指標(biāo)將120 個樣本排序，每3 個樣本中選取中間樣本為預(yù)測集（40 個），另外2 個樣本為校正集（80 個）。PLS對啤酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)、原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)和雙乙酰質(zhì)量濃度的預(yù)測效果如表3所示。當(dāng)PC數(shù)為5時，PLS模型對乙醇體積分?jǐn)?shù)的預(yù)測能力最強。校正集的RMSECV和相關(guān)系數(shù)Rc分別為0.186%和0.993 6（圖6a1）；預(yù)測集均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）和相關(guān)系數(shù)Rp分別為0.143%和0.996 6（圖6a2）。當(dāng)PC數(shù)為7時，PLS模型對原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測能力最強。校正集RMSECV和Rc分別為0.729%和0.982 7（圖6b1）；預(yù)測集RMSEP和Rp分別為0.675%和0.986 9（圖6b2）。當(dāng)PC數(shù)為6時，PLS模型對雙乙酰質(zhì)量濃度的預(yù)測能力最強。校正集RMSECV和Rc分別為0.302 mg/L和0.983 0（圖6c1）；預(yù)測集RMSEP和Rp分別為0.254 mg/L和0.988 2（圖6c2）。在最佳PC數(shù)下，3 種質(zhì)量指標(biāo)的PLS模型的校正集與預(yù)測集散點圖如圖6所示。因此，PLS模型對啤酒這3 種質(zhì)量指標(biāo)的定量預(yù)測效果較好。

表3 PLS模型對啤酒質(zhì)量指標(biāo)的預(yù)測結(jié)果Table 3 Results of prediction of quality indicators of beer samples by using PLS model

圖6 啤酒質(zhì)量指標(biāo)的PLS模型Fig.6 Plots of PLS model predicted values against measured values for quality indicators of beer samples in calibration and prediction sets

2.3.2 最小二乘支持向量機（least squares-support vector machines，LS-SVM）模型分析

LS-SVM利用解線性等式代替SVM中的二次規(guī)劃問題，是SVM的改進(jìn)版本[30]。LS-SVM建模過程采用徑向基核函數(shù)（radial basis function，RBF）為核函數(shù)，并結(jié)合二部格點搜索法和留一法尋找最優(yōu)的RBF正則化參數(shù)γ和核函數(shù)參數(shù)σ2。LS-SVM對啤酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)、原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)和雙乙酰質(zhì)量濃度的預(yù)測結(jié)果如表4所示。當(dāng)最佳參數(shù)組合（γ，σ2）為（269.65，181.96）時，LS-SVM模型對乙醇體積分?jǐn)?shù)的預(yù)測能力最強。LS-SVM模型得出乙醇體積分?jǐn)?shù)的校正集RMSECV和Rc分別為0.042 7%和0.998 6（圖7a1），LS-SVM模型得出乙醇體積分?jǐn)?shù)的預(yù)測集RMSEP和Rp結(jié)果分別為0.108 0%和0.997 0（圖7a2）。當(dāng)最佳參數(shù)組合（γ，σ2）為（13 248.94，42.58）時，LS-SVM模型對原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測能力最強。LS-SVM模型得出原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的校正集RMSECV和Rc結(jié)果分別為0.376%和0.994 9（圖7b1）；LS-SVM模型得出原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測集RMSEP和Rp結(jié)果分別為0.611%和0.988 3（圖7b2）。當(dāng)最佳參數(shù)組合（γ，σ2）為（10 059.51，109.13）時，LS-SVM模型對雙乙酰質(zhì)量濃度的預(yù)測能力最強。LS-SVM模型得出雙乙酰質(zhì)量濃度的校正集RMSECV和Rc分別為0.117 mg/L和0.998 9（圖7c1）；預(yù)測集RMSEP和Rp分別為0.244 mg/L和0.989 2（圖7c2）。在最佳PC數(shù)下，3 種質(zhì)量指標(biāo)的LS-SVM模型的校正集與預(yù)測集散點圖如圖7所示。因此，LS-SVM模型對啤酒這3 種質(zhì)量指標(biāo)的定量預(yù)測效果很好。

圖7 啤酒質(zhì)量指標(biāo)的LS-SVM模型Fig.7 Plots of LS-SVM model predicted values against measured values for quality indicators of beer samples in calibration and prediction sets

表4 LS-SVM模型對啤酒質(zhì)量指標(biāo)的預(yù)測結(jié)果Table 4 Results of prediction of quality indicators of beer samples by using LS-SVM model

綜上所述，PLS、LS-SVM模型都能夠?qū)η鄭u啤酒的3 種質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行定量預(yù)測。其中LS-SVM模型比PLS模型預(yù)測效果更好。因此，建立的LS-SVM模型為青島啤酒3 種質(zhì)量指標(biāo)的最佳定量預(yù)測模型。

3 結(jié) 論

測定8 種青島啤酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)、原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)和雙乙酰質(zhì)量濃度，結(jié)果表明不同啤酒的3 種質(zhì)量指標(biāo)都具有一定差異，其中純生啤酒的這3 個質(zhì)量指標(biāo)均最低，而Strong啤酒均最高。構(gòu)建的嗅覺可視化傳感器陣列結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析結(jié)果表明，LDA模型能夠較好地區(qū)分8 種啤酒；同時，LS-SVM模型對乙醇體積分?jǐn)?shù)、原麥汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)和雙乙酰質(zhì)量濃度都具有良好的定量預(yù)測能力。因此，使用嗅覺可視化傳感器技術(shù)對啤酒品質(zhì)進(jìn)行快速、無損檢測可行。