獼猴桃葉斑病病菌生物學(xué)特性及室內(nèi)藥劑篩選

張凱東 強(qiáng)遙 劉冰 李邦明 趙尚高 蔣軍喜

摘要：為明確奉新縣獼猴桃葉斑病病菌（Corynespora cassiicola）生物學(xué)特性，并篩選出有效防治藥劑，采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定其在不同溫度、pH值、光照條件、培養(yǎng)基和碳氮源條件下的生長(zhǎng)情況，并測(cè)定17種殺菌劑對(duì)該菌的毒力大小。結(jié)果表明，該菌在5～35 ℃內(nèi)均可生長(zhǎng)，其中30 ℃是最適生長(zhǎng)溫度;pH值范圍在3～12時(shí)病原菌均可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH值為6;全光照條件下最有利于病原菌的生長(zhǎng);PDA培養(yǎng)基是病原菌生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基;甘露醇、硝酸鉀分別為最適碳、氮源。供試的17種殺菌劑對(duì)病原菌的生長(zhǎng)均有一定的毒力作用，其中50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（WP）、50%苯甲·丙環(huán)唑乳油（EC）、40%氟硅唑EC和50%氟啶胺懸浮劑（SC）具有強(qiáng)毒力，EC50分別為0.157、0.574、0.740、0.783 μg/mL，80%乙蒜素WP和80%福美雙水分散粒劑（WG）的毒力最弱，EC50分別為40.437、44.136 μg/mL。

關(guān)鍵詞：獼猴桃葉斑病病菌;生物學(xué)特性;毒力測(cè)定;菌絲生長(zhǎng)速率法;藥劑篩選

中圖分類號(hào)： S436.634? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）18-0106-05

收稿日期：2020-11-25

基金項(xiàng)目：江西省科技計(jì)劃（編號(hào)：20181ACF60017）;國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31460452）。

作者簡(jiǎn)介：張凱東（1995—），男，河南新縣人，碩士研究生，主要從事分子植物病理學(xué)研究。E-mail：2534524603@qq.com。

通信作者：蔣軍喜，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物病害綜合治理研究。E-mail：jxau2011@126.com。

獼猴桃（Actinidia spp.）別稱奇異果，屬獼猴桃科獼猴桃屬多年生藤本植物[1]，起源于中國(guó)。獼猴桃作為一種新興水果[2]，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有“維生素C之王”的美譽(yù)，深受人們的喜愛(ài)。江西省奉新縣是獼猴桃的主要種植區(qū)，種植面積目前約3 333 hm2，獼猴桃產(chǎn)業(yè)對(duì)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展有舉足輕重的作用。近年來(lái)，江西省奉新縣獼猴桃種植區(qū)發(fā)現(xiàn)一種新的獼猴桃葉部病害，病葉初期出現(xiàn)深褐色圓形小斑，后期形成外圍呈深褐色，中央呈灰白色并具有輪紋狀的圓形大病斑，嚴(yán)重時(shí)多個(gè)病斑會(huì)連成一片，造成早期大面積落葉，影響果實(shí)的正常成熟。

江西省奉新縣獼猴桃葉斑病的病原鑒定已有過(guò)報(bào)道，其病原被鑒定為半知菌類棒孢屬中的多主棒孢（Corynespora cassiicola）[3]。多主棒孢是一種重要的植物病原菌[4]，其寄主范圍廣，癥狀類型多樣，生理小種復(fù)雜[5]，常常侵染植物葉片，也可侵染寄主的花、果實(shí)、莖、根[6-7]。目前奉新地區(qū)由多主棒孢（C. cassiicola）引起的獼猴桃葉斑病不斷加重，其中紅陽(yáng)、東紅、臍紅、晚紅等紅心獼猴桃品種易被侵染，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)孬J猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前關(guān)于該地區(qū)病原菌的生物學(xué)特性和殺菌劑篩選研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)奉新縣獼猴桃葉斑病病菌開(kāi)展生物學(xué)特性測(cè)定及殺菌劑篩選，旨在掌握該地區(qū)病原菌的生長(zhǎng)特性，并篩選出具有良好防治效果的化學(xué)藥劑，以期為江西省奉新縣獼猴桃葉斑病的綜合治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為奉新獼猴桃葉斑病病菌菌株SK-4（Corynespora cassiicola），于2019年11月由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂（OMA）培養(yǎng)基、玉米片瓊脂（CMA）培養(yǎng)基、苜蓿煎汁（AEA）培養(yǎng)基、煙草煎汁（TEA）培養(yǎng)基、胡蘿卜（CA）培養(yǎng)基、查氏（Czapek）培養(yǎng)基、牛肉浸膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基、水瓊脂（WA）培養(yǎng)基、紅陽(yáng)獼猴桃葉煎汁培養(yǎng)基等10種，配方參照文獻(xiàn)[8]。

供試藥劑信息見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間

本試驗(yàn)于2020年6—9月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 病原菌生物學(xué)特性研究

1.3.1 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

取直徑為5 mm的適齡菌餅接種到PDA培養(yǎng)基平板中央，置于不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)溫度重復(fù)3次，培養(yǎng)6 d后采用十字交叉法[9]測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算病原菌在不同溫度下的生長(zhǎng)速率。

生長(zhǎng)速率=（菌落直徑-菌餅直徑）/生長(zhǎng)時(shí)間。

1.3.2 不同pH值對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

用 1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，將直徑為 5 mm 的適齡菌餅接種到PDA培養(yǎng)基平板中央，置于 30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。處理和觀察方法同“1.3.1”節(jié)。

1.3.3 不同光照條件對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

將接菌的PDA培養(yǎng)基平板分別置于全光照、全黑暗和光—暗交替（12 h—12 h）的3種不同光照處理下，30 ℃恒溫培養(yǎng)6 d。處理和觀察方法同“1.3.1”節(jié)。

1.3.4 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

取直徑為5 mm的適齡菌餅接種到PDA、OMA、CMA、AEA、TEA、CA、Czapek、NA、WA、紅陽(yáng)獼猴桃葉煎汁培養(yǎng)基平板中央，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。處理和觀察方法同“1.3.1”節(jié)。

1.3.5 不同碳、氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以等量的葡萄糖、可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、纖維二糖和甜醇替換蔗糖，配制9種不同碳源培養(yǎng)基;同理以等量的硝酸鉀、磷酸二氫銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸銨和氯化銨替換硝酸鈉，配制8種不同氮源培養(yǎng)基[10]。取直徑為5 mm的適齡菌餅接種到含不同碳、氮源的培養(yǎng)基平板中央，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，處理和觀察方法同“1.3.1”節(jié)。

1.4 病原菌室內(nèi)藥劑篩選

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定17種殺菌劑對(duì)獼猴桃葉斑病病菌（C. cassiicola）的抑菌作用。用無(wú)菌水將每種藥劑梯度稀釋為9個(gè)不同濃度的藥液，用移液槍吸取1 mL藥液與已融化冷卻至60 ℃的 9 mL PDA培養(yǎng)基混勻配制成含不同濃度（1.0×103、2.5×102、6.3×101、1.6×101、3.9×100、1.0×100、2.4×10-1、6.1×10-2、1.5×10-2 μg/mL）藥劑的PDA培養(yǎng)基平板[11]，并設(shè)不含藥劑的PDA培養(yǎng)基平板作為對(duì)照。取直徑為5 mm的適齡菌餅接種到各處理PDA培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，接菌后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算得出毒力回歸方程、半最大效應(yīng)濃度（EC50）和決定系數(shù)（r2），根據(jù)EC50評(píng)價(jià)殺菌劑的抑菌效果。

抑菌率=對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的生物學(xué)特性研究

2.1.1 不同溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

由圖1可知，獼猴桃葉斑病病菌在20～30 ℃時(shí)生長(zhǎng)較快，30 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快，此時(shí)病菌生長(zhǎng)速率達(dá) 9.94 mm/d;10、15、35 ℃時(shí)病菌生長(zhǎng)均較慢，5 ℃ 時(shí)病菌則停止生長(zhǎng)。

2.1.2 不同pH值對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

由圖2可知，pH值為3～12時(shí)，獼猴桃葉斑病病菌均能生長(zhǎng)，但以pH值為6～9時(shí)菌絲生長(zhǎng)較快，pH值為6時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，此時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率達(dá) 9.44 mm/d，其他pH值時(shí)菌絲生長(zhǎng)均較慢。

2.1.3 不同光照條件對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

由圖3可知，病原菌在3種不同的光照條件下生長(zhǎng)均較快，但以全光照條件下生長(zhǎng)最快，菌絲生長(zhǎng)速率為9.78 mm/d，全黑暗條件下生長(zhǎng)最慢，菌絲生長(zhǎng)速率為8.83 mm/d，表明全光照條件最適宜該病菌生長(zhǎng)。

2.1.4 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

由表2可知，病原菌在10種不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況各不相同，其中在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率最高，達(dá) 9.50 mm/d，為病原菌的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其次是AEA培養(yǎng)基，病原菌的生長(zhǎng)速率達(dá)9.00 mm/d。病原菌在WA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最為緩慢，菌絲稀疏，生長(zhǎng)速率僅為6.78 mm/d，不適宜該病菌的生長(zhǎng)。

2.1.5 不同碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

由表3可知，病原菌在9種不同碳源培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速率有顯著差異。其中病原菌在甘露醇上生長(zhǎng)最快，為最適碳源，生長(zhǎng)速率為11.39 mm/d，山梨醇和葡萄糖次之，病原菌在可溶性淀粉和甜醇上生長(zhǎng)最慢，生長(zhǎng)速率僅分別為8.39、8.22 mm/d。

2.1.6 不同氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

由表4可知，病原菌在以硝酸鉀和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，其生長(zhǎng)速率分別為9.17、9.11 mm/d，顯著高于其他6種氮源培養(yǎng)基，硝酸鈉次之，病原菌在磷酸二氫銨上生長(zhǎng)最為緩慢且菌絲稀疏，生長(zhǎng)速率僅為2.89 mm/d。

2.2 17種殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

由表5可知，17種殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)存在不同的抑制作用，藥劑的EC50范圍為0.157～44.136 μg/mL。其中50%咪鮮胺錳鹽WP、50%苯甲·丙環(huán)唑EC、40%氟硅唑EC、50%氟啶胺SC的毒力作用強(qiáng)，其EC50均小于1 μg/mL，分別為0.157、0.574、0.740、0.783 μg/mL;其次是75%戊唑·肟菌酯WG、75%戊唑·嘧菌酯WG、19%啶氧·丙環(huán)唑SC、43%戊唑醇SC、12%中生菌素WP和60%吡唑·代森聯(lián)WG，這6種藥劑的EC50在 1～10 μg/mL 范圍內(nèi)。50%異菌脲SC、40%嘧霉胺SC、80%乙蒜素WP和80%福美雙WG的毒力作用較弱，其EC50均大于28 μg/mL。

3 結(jié)論與討論

病原菌的生物學(xué)特性測(cè)定和化學(xué)藥劑篩選是植物病害研究的重要內(nèi)容。本研究明確了奉新縣獼猴桃葉斑病病菌生長(zhǎng)最適宜的溫度、pH值、光照條件、培養(yǎng)基、碳氮源條件，并篩選到10多種有效藥劑，這為該病害發(fā)生規(guī)律和防治研究奠定了較好的工作基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，奉新縣獼猴桃葉斑病病菌在25～30 ℃條件下適宜生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，病原菌生長(zhǎng)的最適pH值為6，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，全光照最有利于該病菌的生長(zhǎng)，甘露醇和硝酸鉀分別為最適碳、氮源。崔永亮對(duì)四川省獼猴桃褐斑病病菌的生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果顯示，病菌最適生長(zhǎng)溫度范圍為25～30 ℃，最適pH值為6，不同光照條件對(duì)病菌的生長(zhǎng)影響不明顯，最適培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基[12];楊紹麗等對(duì)黃瓜靶斑病病菌的測(cè)定結(jié)果顯示，病菌最適生長(zhǎng)溫度為 30 ℃，最適pH值為8，全光照有利于病菌生長(zhǎng)，麥芽糖和硝酸鉀分別為最適碳、氮源[13];陳旭玉等對(duì)廣藿香棒孢霉葉斑病病菌的測(cè)定結(jié)果表明，病菌最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，最適pH值為6，全光照或光暗交替有利于菌絲生長(zhǎng)[14];番華彩等對(duì)香蕉棒孢霉葉斑病菌的測(cè)定結(jié)果顯示，病菌最適生長(zhǎng)溫度為 28 ℃，最適pH值為7，全黑暗條件下病原菌菌絲生長(zhǎng)最快，乳糖和甘露醇、蛋白胨為最適碳、氮源[15];李俊香等對(duì)甜瓜靶斑病病菌的測(cè)定結(jié)果顯示，病菌最適生長(zhǎng)溫度為 27 ℃，最適pH值為7，葡萄糖和硝酸鉀分別為最適碳、氮源[16]。不同研究者的研究結(jié)果表明，來(lái)源于不同寄主的的多主棒孢菌生物學(xué)特性存在差異，這可能與生理小種間的差異和寄主植物不同有關(guān)[17]。

17種藥劑的室內(nèi)毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，50%咪鮮胺錳鹽WP、50%苯甲·丙環(huán)唑EC、40%氟硅唑EC和50%氟啶胺SC對(duì)奉新縣獼猴桃葉斑病病菌具有較強(qiáng)毒力，EC50分別為0.157、0.574、0.740、0.783 μg/mL。這4種殺菌劑對(duì)其他植物多主棒孢葉斑病病菌也表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑菌效果。李俊香等對(duì)甜瓜靶斑病病菌的室內(nèi)毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，咪鮮胺錳鹽的毒力作用最強(qiáng)，EC50為0.609 μg/mL[18];王進(jìn)強(qiáng)等對(duì)橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌的毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，苯甲·丙環(huán)唑和氟硅唑具有較好的毒力效果，EC50分別為0.620、0.760 μg/mL[19];Li等對(duì)黃瓜靶斑病防治藥劑的篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，氟啶胺具有較強(qiáng)的毒力作用，EC50為0.213 μg/mL[20]。本試驗(yàn)中藥劑篩選結(jié)果是藥劑在室內(nèi)與病原菌菌絲直接接觸而產(chǎn)生的抑菌效果，并不能完全代表其田間實(shí)際防效，藥劑在田間的防效還受到來(lái)自寄主植物、病菌及環(huán)境條件的綜合影響[21]。因此，要確定奉新縣獼猴桃葉斑病最適防治藥劑，尚有待于進(jìn)一步的田間藥效試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐小彪，張秋明. 中國(guó)獼猴桃種質(zhì)資源的研究與利用[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2003，20（6）：648-655.

[2]張計(jì)育，莫正海，黃勝男，等. 21世紀(jì)以來(lái)世界獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展以及中國(guó)獼猴桃貿(mào)易與國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（23）：48-55.

[3]秦雙林，王園秀，蔣軍喜，等. 江西奉新縣獼猴桃葉斑病病原菌鑒定[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38（3）：488-491.

[4] 李寶聚，高 葦，石延霞，等. 多主棒孢和棒孢葉斑病的研究進(jìn)展[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2012，39（2）：171-176.

[5]李博勛，馮艷麗，劉先寶，等. 我國(guó)熱帶作物多主棒孢種群多樣性及致病力分化分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2019，40（12）：2456-2465.

[6]Silva W K，Multani D S，Deverall B J，et al. RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus Corynespora cassiicola[J]. Australian Journal of Botany，1995，43（6）：609-618.

[7]Silva W K，Wijesundera R C，Karunanayake E H，et al. New hosts of Corynespora cassiicola in Sri Lanka[J]. Plant Disease，2000，84（2）：202.

[8]方中達(dá). 植病研究法[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[9]田守波，朱為民，朱龍英，等. 番茄棒孢葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 植物保護(hù)，2020，46（3）：157-162，166.

[10]李 誠(chéng)，王 祿，蔣軍喜，等. 獼猴桃果實(shí)熟腐病菌生物學(xué)特性及其寄主抗病性鑒定研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（5）：1061-1065.

[11]周 英. 奉新獼猴桃3種真菌病害病原鑒定、生物學(xué)特性及藥劑篩選研究[D]. 南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[12]崔永亮. 猴桃褐斑病的研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[13]楊紹麗，吳仁鋒，馬曉龍，等. 武漢地區(qū)黃瓜靶斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 長(zhǎng)江蔬菜，2015（4）：58-61.

[14]陳旭玉，甘炳春，隋 春，等. 廣藿香棒孢霉葉斑病病原菌生物學(xué)特性及藥劑篩選[J]. 農(nóng)藥，2012，51（3）：215-217，221.

[15]番華彩，郭志祥，白亭亭，等. 香蕉棒孢霉葉斑病病原菌生物學(xué)特性測(cè)定[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49（3）：481-487.

[16]李俊香，洪 霓，古勤生. 甜瓜靶斑病病原菌的生物學(xué)特性[J]. 中國(guó)瓜菜，2019，32（10）：11-17.

[17]秦小芳，霍 行，周 瓊，等. 白及疫病病原菌的生物學(xué)特性及侵染特性測(cè)定[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020（8）：47-51.

[18]李俊香，洪 霓，古勤生.22種殺菌劑對(duì)甜瓜靶斑病菌的室內(nèi)毒力測(cè)試[J]. 中國(guó)瓜菜，2018，31（9）：13-16.

[19]王進(jìn)強(qiáng)，張春霞，何明霞，等. 幾種殺菌劑對(duì)橡膠樹(shù)多主棒孢的毒力測(cè)定[J]. 農(nóng)藥，2010，49（7）：524-526.

[20]Li T，Xiu Q，Zhang J，et al. Pharmacological characteristics and efficacy of fluazinam against Corynespora cassiicola，causing cucumber target spot in greenhouses[J]. Plant Disease，2020，104（9）：2449-2454.

[21]蔣 妮，宋利沙，陳乾平，等. 羅漢果斑枯病菌主要生物學(xué)特性及防治藥劑篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（24）：78-81.