膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)證候動物模型的研究進(jìn)展

楊威 郭斯印 易志勇

【摘 要】 膝骨關(guān)節(jié)炎基本中醫(yī)證型是腎陽虛證、氣滯血瘀證和寒濕阻滯證，中醫(yī)證候動物模型以腎陽虛模型、血瘀模型和寒濕模型為主。腎陽虛證模型是研究最早的中醫(yī)證候動物模型，造模方法種類繁多，包括西醫(yī)病理造模和中醫(yī)病因造模，但兩者都存在不足，所以病證結(jié)合模型備受關(guān)注?？茖W(xué)評價病證結(jié)合模型，應(yīng)采集動物“四診信息”，結(jié)合基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)等，宏觀微觀綜合評價，必要時運(yùn)用經(jīng)典方劑佐證。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎;動物模型;中醫(yī)證型;病證結(jié)合;研究進(jìn)展;綜述

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病，基本病理改變?yōu)檐浌亲冃院蛠G失、滑膜肥厚及關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨質(zhì)再生，多發(fā)于膝稱為膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）[1-3]。

隨著人民生活水平的提高，預(yù)期壽命的延長，KOA的發(fā)病率逐年增高[4]，國外也有相關(guān)報道[5]。KOA臨床表現(xiàn)為慢性關(guān)節(jié)活動痛、僵硬，嚴(yán)重者關(guān)節(jié)畸形甚至癱瘓，盡管最新臨床和實驗研究認(rèn)為未變性的Ⅱ型膠原有利于KOA患者[6]，但目前病因病機(jī)不明，仍缺乏有效的治療手段[3，7]。而動物實驗是人們深入認(rèn)識KOA發(fā)病機(jī)制和探索有效治療手段的重要途徑[8-11]。

中醫(yī)藥通過減輕KOA患者疼痛、改善關(guān)節(jié)功能和調(diào)節(jié)整體生理功能進(jìn)而提高患者生活質(zhì)量。KOA屬中醫(yī)學(xué)“膝痹”范疇，病因病機(jī)為“本痿標(biāo)痹、本虛標(biāo)實”。肝腎虧虛，筋骨失養(yǎng)為本痿;邪氣痹阻，經(jīng)絡(luò)不暢為標(biāo)痹[12-13]。本病大致可分為氣滯血瘀證、寒濕痹阻證和肝腎虧虛證，分別對應(yīng)血瘀、寒濕和腎陽虛型造模。為進(jìn)一步探究其發(fā)病機(jī)制，就此做一簡要綜述。

1 動物的選擇

OA的動物造模，最常復(fù)制膝關(guān)節(jié)，還包括髖關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)和顳下頜關(guān)節(jié)[14]等。按照體積大小可以將KOA模型動物分為小型、較大型和靈長類，小型動物包括鼠類和兔等，大型動物包括羊、小豬和馬等，靈長類動物有狒狒、獼猴和黑猩猩等。動物的選擇應(yīng)當(dāng)考慮以下幾點(diǎn)因素：實驗?zāi)康摹㈩愋?、時間長短、飼養(yǎng)花費(fèi)、操作難易和結(jié)果檢測等。時間長短要考慮每種動物骨骼成熟時間和發(fā)展為KOA的進(jìn)程[15]。小動物主要用于研究疾病進(jìn)展的病機(jī)和病理生理學(xué)特點(diǎn)，也用于對藥物干預(yù)的首次篩查研究。小動物模型相對經(jīng)濟(jì)、快捷，缺點(diǎn)是與人類在解剖學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)等方面差異很大，在藥物研究方面不能直接等效地推論到人類。例如，小鼠關(guān)節(jié)軟骨的平均厚度是人類的1/70[16]。靈長類動物在生物學(xué)和行為學(xué)上與人類相似，其原發(fā)性KOA的發(fā)展和人類很相似[17]，而且創(chuàng)傷引起的應(yīng)激障礙和抑郁癥基本與人類一樣[18]，但花費(fèi)高。

2 KOA的西醫(yī)病理學(xué)造模概述

KOA按病因分為原發(fā)性和繼發(fā)性[15]，繼發(fā)性包括創(chuàng)傷后、廢用性和繼發(fā)于其他系統(tǒng)性疾病的KOA，常以前兩者進(jìn)行動物模擬。對應(yīng)經(jīng)典的造模方式是人工誘導(dǎo)和自發(fā)造模，人工誘導(dǎo)包括關(guān)節(jié)制動、侵入性和非侵入性模型，侵入性模型主要是手術(shù)誘導(dǎo)和化學(xué)生物誘導(dǎo)，手術(shù)誘導(dǎo)包括關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)和關(guān)節(jié)外手術(shù)，關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)指破壞關(guān)節(jié)韌帶、半月板、軟骨、滑膜和植入異物等，關(guān)節(jié)外手術(shù)包括破壞關(guān)節(jié)周圍肌肉、韌帶、血管和切除卵巢等;非侵入性包括過關(guān)節(jié)撞擊、關(guān)節(jié)內(nèi)脛骨平臺骨折、周期性脛骨平臺軟骨受壓和脛骨過度負(fù)載等[19-20]。西醫(yī)病理學(xué)造模方法繁多，還有一些創(chuàng)新的、少數(shù)人使用的造模方法未提及，每種具體的造模方式都有其優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)其特有的致病機(jī)制、病理變化特點(diǎn)以及自身需求選擇合適的KOA模型。

3 KOA的中醫(yī)證型造模

多數(shù)學(xué)者將KOA證型大致概括為正虛、邪實和虛實夾雜證。李具寶等[21]通過比較近10年文獻(xiàn)中KOA患者內(nèi)服方藥，認(rèn)為其對應(yīng)的中醫(yī)證型為虛證、實證和虛實夾雜證，虛證主要分為肝腎虧虛證、腎虛髓虧證、脾腎虧虛證等，實證主要有寒濕痹阻證、氣滯血瘀證、濕熱壅盛證、筋脈瘀滯證、風(fēng)濕痹阻證等，虛實夾雜證包括陽虛寒凝證和氣虛濕阻證。高玉花[22]通過檢索與KOA證型相關(guān)的文獻(xiàn)并對144例符合標(biāo)準(zhǔn)的女性患者進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)其基本證型是氣血瘀滯證、肝腎不足證、脾腎陽虛證和寒濕痹阻證。胡彬等[23]采用KOA臨床證候調(diào)查表，并運(yùn)用對應(yīng)分析和二步聚類分析得出3種主要證型，分別是腎虛髓虧型（50.5%）、陽虛寒凝型（3.5%）、瘀血阻滯型（23.0%）。何峰等[24]在對200例KOA患者辨證治療研究中，將其進(jìn)一步分為肝腎虧虛證、氣滯血瘀證和寒濕痹阻證3種證型。因此，對應(yīng)臨床主要證型，目前動物實驗也以腎陽虛、血瘀和寒濕模型為主。

3.1 腎陽虛模型 腎陽虛證模型是研究最早的中醫(yī)證候動物模型，已有50多年歷史，是連接西醫(yī)基礎(chǔ)和中醫(yī)臨床的樞紐，可深化對中醫(yī)證候的認(rèn)識，有利于中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展[25]，簡要概括當(dāng)前動物造模方法，按照機(jī)制大致可分為西醫(yī)病理學(xué)造模和中醫(yī)病因?qū)W造模，且以前者多見。

3.1.1 西醫(yī)病理學(xué)造模 沈自尹等[26-27]經(jīng)過大量動物研究認(rèn)為，下丘腦細(xì)胞損害及其引起的功能紊亂是腎陽虛證的主要病理基礎(chǔ)，下丘腦受損導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺、甲狀腺、性腺軸功能紊亂，繼而其支配的代謝和免疫器官出現(xiàn)相應(yīng)的功能失?；蚪Y(jié)構(gòu)病理改變。進(jìn)一步以藥測證研究中采用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，腎虛證大鼠模型存在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫和神經(jīng)-內(nèi)分泌-骨代謝兩大基因調(diào)控路線紊亂[27]。西醫(yī)病理學(xué)造?？煞譃槟I上腺皮質(zhì)、甲狀腺和性腺功能抑制模型，DNA合成抑制腎陽虛模型和其他病理模型。

臨床研究結(jié)果表明，腎陽虛證的表現(xiàn)與腎上腺皮質(zhì)功能低下緊密相關(guān)[28]。腎上腺皮質(zhì)功能抑制模型可分為糖皮質(zhì)激素應(yīng)用法，氨基導(dǎo)眠能灌胃法和腎上腺切除術(shù)。最早和最常用的是糖皮質(zhì)激素法，大量文獻(xiàn)表明，糖皮質(zhì)激素藥物種類繁多，造模時給藥途徑、劑量、給藥時間、持續(xù)時間和動物選擇等都有所差異，其中國內(nèi)外最認(rèn)可的方式是將氫化可的松注射液以10 mg·kg-1·d-1的劑量注射到成年大鼠腹腔，持續(xù)15 d即可成模[29]。其次是去勢法。切除動物雙側(cè)睪丸或卵巢[30]，可成功模擬腎陽虛證。但也有研究認(rèn)為，此法不僅創(chuàng)傷大且性腺軸的反饋途徑中斷，去勢后的動物不能較好地模擬臨床腎陽虛患者表現(xiàn)[31]。根據(jù)Hartley豚鼠關(guān)節(jié)軟骨快速衰老的特性，筆者通過切除雙側(cè)卵巢成功構(gòu)建絕經(jīng)后原發(fā)性KOA模型[32]。最近，陳穎穎等[33]對SD大鼠采用Hulth造模法加不同濃度腺嘌呤灌胃成功構(gòu)建腎虛型KOA模型，并發(fā)現(xiàn)100 mg·kg-1是最佳濃度。

3.1.2 中醫(yī)病因?qū)W造模 腎藏精，主骨生髓，主人體發(fā)育和生殖。腎虛多由先天稟賦不足或后天失養(yǎng)，房勞內(nèi)傷，久病耗氣，年老或受驚所致。主要分為房事傷身、老年腎陽虛、恐傷腎和先天腎虛模型[34-36]。臨床診斷腎虛的主要癥狀為異常精子質(zhì)量，性功能低下，射精無力或性高潮失常[37]，而精液的代謝組學(xué)分析可用于區(qū)別腎虛不育男性的中醫(yī)“證”型[38]。然而，筆者尚未發(fā)現(xiàn)運(yùn)用中醫(yī)病因?qū)W方法建立腎虛型KOA模型的文獻(xiàn)報道。

目前，腎陽虛造模法種類繁多，病理造模方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于病因造模，而后者被越來越多的研究者青睞。但兩者都存在明顯不足，前者只能反映臨床腎虛病理的某一個方面，后者病因和病證之間不存在一一對應(yīng)的關(guān)系[39]。病證結(jié)合模型將是未來發(fā)展的方向[40-42]。

3.2 血瘀模型 血瘀證的臨床表現(xiàn)為舌質(zhì)青紫、瘀斑等，動物實驗的標(biāo)準(zhǔn)是舌質(zhì)瘀紫、尾色瘀青、血流緩慢、血黏度增高等[43]，常用的造模方法是腎上腺皮質(zhì)激素注射法[44]。具體方法是采用氫化可的松10 mg·kg-1·d-1肌肉注射，13次用藥后腎上腺素0.36 mg·kg-1皮下注射1次。2013年，劉振峰等[45]用此法加經(jīng)典Hulth造模法成功建立了動物體征和血液流變學(xué)均符合血瘀證的KOA大鼠模型;盡管臨床上血瘀證常見，且常以活血法治之，但此后未見相關(guān)動物模型報道。

3.3 寒濕模型 《素問·痹論篇》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也?！憋L(fēng)寒濕邪是重要的病因。2016年，李艷彥等[46]采用冷固法復(fù)制寒濕型KOA模型，通過將大鼠放入（6±0.5）℃的水中6 h，而后予以雙下肢石膏固定18 h，如此反復(fù)5周后建模成功。隨后，趙樂等[47]用此法成功建立寒濕證KOA動物模型，之后對此法改進(jìn)，通過交替將大鼠雙下肢伸直位石膏固定和自然站立于（6±2）℃冰水中各6 h，持續(xù)6周，也能成功構(gòu)建該模型[48]。2020年，孫力威[49]采用石膏固定加低溫環(huán)境刺激 加冰水站立成功建立寒濕證KOA模型。

4 KOA病證結(jié)合模型

辨病與辨證相結(jié)合已成為中醫(yī)師主流的診療模式[50]，臨床收效頗豐，雖然研究其作用機(jī)制的病證結(jié)合模型進(jìn)展緩慢，卻受越來越多學(xué)者的青睞。LIU等[51]關(guān)節(jié)內(nèi)注射木瓜蛋白酶，并將膝關(guān)節(jié)在50 ℃環(huán)境下作用2 h，觀察局部腫脹、疼痛和活動受限程度及軟骨病理變化，得到腎虛血瘀型KOA模型。陳穎穎等[52]通過Hulth、Hulth及D半乳糖、Hulth及腺嘌呤、Hulth及去勢法等不同造模方法對比發(fā)現(xiàn)，Hulth及去勢法更適合建立大鼠KOA腎陽虛證模型;而筆者前期單純采用去勢法建立豚鼠絕經(jīng)后原發(fā)性KOA腎陽虛證模型，可較好地模擬絕經(jīng)后原發(fā)性KOA患者臨床表現(xiàn)，操作雖然簡單，但耗時太長[32]。為推動KOA模型更好地服務(wù)于科研，武晏屹等[53]以KOA中、西醫(yī)最新臨床診療規(guī)范為依據(jù)，創(chuàng)造性地提出了動物模型與中、西醫(yī)的臨床吻合度，也更有利于病證結(jié)合模型的發(fā)展。

5 小結(jié)與展望

KOA又名骨痹、痛痹、寒痹等?！稄埵厢t(yī)通》曰：“骨痹者，即寒痹、痛痹也，其證痛苦攻心，四肢攣急，關(guān)節(jié)浮腫?！苯Y(jié)合KOA中醫(yī)病因證候文獻(xiàn)，認(rèn)為主要病因是腎虛、瘀血和寒濕，基本證型是肝腎虧虛、氣滯血瘀和寒濕阻滯證，分別對應(yīng)腎陽虛、血瘀和寒濕模型。中醫(yī)學(xué)從整體辨證論治的角度出發(fā)，治療KOA有獨(dú)特的優(yōu)勢，而有關(guān)KOA的中醫(yī)證候動物模型研究及相關(guān)文獻(xiàn)資料缺乏或零散，尤其缺少病因?qū)W模型研究;加之臨床上患者病證的復(fù)雜性和動態(tài)性，嚴(yán)重限制了中醫(yī)藥對KOA的深入研究。KOA證型大部分是多種病因相互作用的結(jié)果，進(jìn)而出現(xiàn)多種證型兼夾或轉(zhuǎn)變;因此，實際造模時可以將多種基本模型按需求和內(nèi)在規(guī)律組合，建立符合中醫(yī)臨床的復(fù)合證候模型;但干預(yù)因素過多，實際操作困難，模型穩(wěn)定性和可靠性不高。另外，動物的食水、墊料、光照及周圍環(huán)境等飼養(yǎng)環(huán)境也極為重要。

KOA病因病機(jī)不明，是世界性難題，單純用西醫(yī)或中醫(yī)都不能有效地解除患者病痛，中西醫(yī)結(jié)合療效顯著。由此過渡到基礎(chǔ)實驗，將西方先進(jìn)的KOA造模理念結(jié)合中醫(yī)證候模型建立病證結(jié)合動物模型將是進(jìn)一步認(rèn)識KOA病因病機(jī)以及藥物防治的主流方向[54]。當(dāng)前KOA病證結(jié)合模型主要以西醫(yī)病理病因造模為主，缺乏中醫(yī)證候體現(xiàn)的病因或誘因，在西醫(yī)建?；A(chǔ)上施加中醫(yī)病因可能更有益。另外，科學(xué)地評價病證結(jié)合模型很難。宋亞剛等[55]提出“證候”評價指標(biāo)加“病”評價指標(biāo)綜合評估，具體需要與獸醫(yī)合作采集動物的“四診信息”，結(jié)合基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)等信息，宏觀微觀相結(jié)合共同評價，必要時運(yùn)用經(jīng)典方劑佐證，這將是病證結(jié)合模型的發(fā)展方向。

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收稿日期：2021-03-20;修回日期：2021-04-15