韓 英，李惠源，賈麗艷，甄 攀，高文靜，王軍艷

（1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術中心，山西汾陽 032209；2.山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷 030801；3.山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心，山西太谷 030801）

傳統(tǒng)清香型白酒是以高粱為原料，大曲為發(fā)酵劑，通過網羅環(huán)境中的微生物，采用“清蒸二次清，地缸固態(tài)發(fā)酵，甑桶蒸餾”工藝生產而成，具有“入口綿，落口甜，清香不沖鼻，飲后有余香”的特點[1]，在國內外深受消費者的喜愛。乙酸乙酯是清香型白酒的主要風味物質之一，其在白酒中的含量及與其他風味物質的比例，對于清香型白酒的風格具有重要影響[2]。由于自然環(huán)境對清香型白酒中乙酸乙酯的形成具有一定的影響，使得乙酸乙酯在清香型白酒中的含量及比例具有一定的不穩(wěn)定性，影響清香型白酒的品質[3]。微生物是白酒發(fā)酵的核心。從自然環(huán)境中分離高產乙酸乙酯的菌株，并強化應用于清香型白酒的生產中，對于穩(wěn)定清香型白酒中乙酸乙酯含量，提升清香型白酒品質具有一定的意義。

山西杏花村是以汾酒為代表的傳統(tǒng)清香型白酒的主產地，具有悠久的釀造歷史[4]，自然環(huán)境中存在優(yōu)良的微生物菌種資源。為了挖掘山西杏花村本土環(huán)境中的功能性微生物，課題組從2015 年開始從杏花村汾酒廠分離篩選傳統(tǒng)清香型白酒酒醅及生產環(huán)境中的功能性菌株，期間，從傳統(tǒng)清香型白酒的酒醅中分離篩選獲得1 株高產乙酸乙酯的菌株，經鑒定為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），命名為庫德畢赤酵母FJZ。該菌株具有良好的生物學特性和環(huán)境耐受性[5]，具有應用于傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵生產的潛能。為此，課題組在前期研究的基礎上，以高粱為發(fā)酵基質，采用固態(tài)發(fā)酵技術，以乙酸乙酯和總酯含量為檢測指標，通過單因素及響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，確定庫德畢赤酵母FJZ 固態(tài)發(fā)酵產乙酸乙酯發(fā)酵工藝條件，為該菌株在白酒釀造過程中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株

庫德畢赤酵母FJZ（簡稱菌株FJZ）：分離自山西杏花村汾酒廠新鮮酒醅中。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD液體培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L。固體培養(yǎng)基加20 g瓊脂[6]。

發(fā)酵用高粱固態(tài)培養(yǎng)基：將1 L 去離子水加入到500 g 粉碎后的高粱中浸泡24 h，再經過濾后蒸煮2 h，晾涼至60 ℃后，加入適量糖化酶，消化2 h，制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌備用[7]。

1.1.3 試劑及耗材

蛋白 胨，葡 萄糖，CaCl2，(NH4)2SO4，KH2PO4，MgSO4·7H2O，酵母膏，瓊脂，糖化酶(3000 U/g)，液化酶(20000 U/g)，乙酸乙酯（分析純），以上試劑均購買于北京索萊寶公司。

1.1.4 儀器設備

PR-CJT-4 超凈工作臺，上海普瑞斯儀器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；GNP-9160 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏試驗設備有限公司；BS2010S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；TopPette移液槍，濟南東儀試驗室設備有限公司；85-2A 磁力攪拌器，精鑿科技（上海）有限公司；pHSJ-4A pH計，美國奧立龍公司；DL-1 萬用電爐，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素試驗的設計

（1）發(fā)酵溫度對菌株FJZ產酯能力影響的測定

將菌株FJZ 以3.0%接種量接入發(fā)酵用高粱固態(tài)培養(yǎng)基中，分別在24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃和36 ℃條件下發(fā)酵7 d，測定其總酯和乙酸乙酯含量，探究發(fā)酵溫度對菌株FJZ產酯能力的影響。

（2）發(fā)酵時間對菌株FJZ產酯能力影響的測定

將菌株FJZ 以3.0%接種量接入發(fā)酵用高粱固態(tài)培養(yǎng)基中，30 ℃分別發(fā)酵5 d、7 d、9 d、11 d、13 d，測定其總酯和乙酸乙酯含量，探究發(fā)酵時間對菌株FJZ產酯能力的影響。

（3）接種量對菌株FJZ產酯能力影響的測定

將菌株FJZ 分別以3%、5%、7%、9%和11%的接種量接入發(fā)酵用高粱固態(tài)培養(yǎng)基中，30 ℃條件下發(fā)酵7 d，測定其總酯和乙酸乙酯含量，探究接種量對菌株FJZ產酯能力的影響。

（4）輔料添加量對產酯能力影響的測定

將菌株FJZ 以3.0%接種量接入發(fā)酵用高粱固態(tài)培養(yǎng)基中，分別按12%、14%、16%、18%和20%的比例加入谷糠，30 ℃條件下發(fā)酵7 d，測定其總酯和乙酸乙酯含量，探究輔料添加量對菌株FJZ產酯能力的影響

1.2.2 響應面試驗設計

根據單因素試驗確定影響產酯能力的顯著因素，以總酯和乙酸乙酯含量作為響應值設計響應面試驗，獲得最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。

1.2.3 理化指標的測定

（1）總酯含量的測定：采用堿皂化回流法[8]。

（2）乙酸乙酯含量的測定：參考魏志陽[9]的方法測定樣品中乙酸乙酯含量，對樣品前處理方法略作修改，即稱取50.00 g樣品于燒杯中，加入300 mL體積分數為10%乙醇浸泡0.5 h，期間，每隔10 min 攪拌1 次，過濾，濾渣再用體積分數為10%的乙醇反復清洗過濾，定容至1000 mL，獲得液相檢測用品，備用。

1.2.4 數據的處理

利用Origin8.5 軟件和Design Expert 10 進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對菌株FJZ產酯能力的影響（圖1）

圖1 發(fā)酵溫度對產酯能力的影響

由圖1 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，庫德畢赤酵母FJZ 的產酯能力也發(fā)生相應的變化，酯類濃度呈先上升后下降的趨勢，且乙酸乙酯與總酯含量變化趨勢一致，呈正相關性。當溫度在24～30 ℃范圍內時，乙酸乙酯及總酯含量逐漸上升；當培養(yǎng)溫度在30 ℃時，總酯及乙酸乙酯含量都達到了最大值，分別為（7.98±0.17）g/100 g 和（1.38±0.021）g/kg；當發(fā)酵溫度在30 ℃以上時，乙酸乙酯及酯類含量呈下降趨勢。以上結果表明，菌株FJZ 在30 ℃時產酯能力最佳，高溫對菌株FJZ 產乙酸乙酯能力具有抑制作用。因此，菌株FJZ 固態(tài)發(fā)酵產乙酸乙酯的最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.2 發(fā)酵時間對菌株FJZ產酯能力影響（圖2）

由圖2 可知，隨著發(fā)酵時間的延長，酯類濃度呈先上升后緩慢下降的趨勢。當發(fā)酵時間為7 d時，總酯含量和乙酸乙酯含量都達到最大值，分別為（7.02±0.02）g/100 g 和（1.35±0.013）g/kg，酒醅中總酯及乙酸乙酯含量增加了3 g/100 g 和1.08 g/kg，分別提高了75%和400%。因此，菌株FJZ 固態(tài)發(fā)酵產乙酸乙酯的最佳發(fā)酵時間為7 d。

圖2 發(fā)酵時間對產酯能力的影響

2.3 接種量對菌株FJZ產酯能力影響（圖3）

圖3 接種量對產酯能力的影響

接種量對高粱培養(yǎng)基中菌株發(fā)酵周期有很大影響，接種量過低會使菌株生長緩慢，導致代謝速率低，產酯能力不足[10]。而接種量過高，過量的菌株生長所消耗的底物過多，造成產酯所需的營養(yǎng)物質嚴重不足，導致菌株產酯能力下降，使酯類濃度降低。由圖3可知，隨著接種量的變化，菌株FJZ在高粱培養(yǎng)基中的酯類濃度呈現先上升后下降的趨勢。當接種量為3%時，總酯和乙酸乙酯濃度都達到最大值，分別為（8.24±0.07）g/100 g 和（1.33±0.01）g/kg，分別比空白對照組提高了104%和850%；當接種量大于3%時，總酯含量呈現緩慢下降的趨勢。因此，菌株FJZ 固態(tài)發(fā)酵產乙酸乙酯的最佳接種量為3%。

2.4 輔料添加量對菌株FJZ產酯能力影響（圖4）

圖4 輔料添加量對產酯能力的影響

白酒固態(tài)發(fā)酵中，輔料的填充，賦予酒醅一定的疏松度，使得酒醅中具有微量的氧氣，這有利于好氧或兼性厭氧微生物的生長，促進香味成分的生成；然而，輔料用量過大，透氣性過好，也會導致酒醅升溫和生酸過快，影響發(fā)酵和風味物質的形成[11-12]。由圖4 可知，隨著輔料添加量的增加，乙酸乙酯及酯類含量呈先上升后下降的趨勢。當輔料添加量為4%時，總酯和乙酸乙酯含量都達到最大值，分別為（8.11±0.08）g/100 g 和（1.28±0.014）g/kg。因此，菌株FJZ 固態(tài)發(fā)酵產乙酸乙酯的最佳輔料添加量為4%。

通過對菌株FJZ 的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、輔料添加量進行單因素水平試驗，探究各因素水平對產乙酸乙酯能力以及總酯含量的影響，結果表明，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、輔料添加量對于酒醅中總酯和乙酸乙酯的形成具有一定的影響。

2.5 響應面法試驗結果及方差分析

通過單因素試驗，篩選出4 個影響總酯和乙酸乙酯變化的顯著因子，為進一步優(yōu)化工藝，對發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）、輔料添加量（D）4 個因素進行優(yōu)化試驗設計（表1），結果見表2。

表1 響應面分析的因素水平

表2 響應面試驗設計與結果

對應用Design Expert 8.0.6.1 軟件設計的響應面試驗結果進行多元化回歸擬合分析，得出該菌株固態(tài)發(fā)酵的總酯含量（Y1）與發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）、輔料添加量（D）四因素變量的二次方程模型為：

Y1=8.11-0.31*A-0.19*B-0.27*C-0.45*D-0.37*A*C+0.17*A*D+0.07*B*C+0.043*B*D +0.25*C*D-1.32*A2-1.15*B2-0.37*C2-0.48*D2。

乙酸乙酯含量（Y2）與A、B、C、D四因素的二次方程為：

Y2=1.26+0.019*A-0.072B+0.11*C+0.067*D+0.060*AB-0.065*AC+0.023*AD+5.000E-003*BC-0.013*BD+0.050*CD-0.14*A2-0.20*B2-0.27C2-0.19*D2。

根據表3 方差分析可知，回歸模型P 模型＜0.0001＜0.01，表明該響應面回歸模型差異極顯著。失擬項P=0.0502/0.0523＞0.05，差異不顯著，說明試驗誤差較小，模型預測結果可靠?；貧w方程R2=0.9931/0.9986，表明四因素與總酯和乙酸乙酯含量之間的多元回歸關系顯著，試驗設計的可靠性極佳，因此，可以利用該回歸方程預測上述因素對菌株FJZ 產酯工藝的優(yōu)化。由方差分析結果可知，接種量A，發(fā)酵溫度B，接種量C，輔料添加量D 對高粱固態(tài)培養(yǎng)基中總酯含量和乙酸乙酯含量的影響都極顯著。

表3 響應面試驗方差分析

2.6 發(fā)酵條件驗證試驗

根據響應面試驗結果，最終確定菌株FJZ 最佳產酯發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間6.92 d、發(fā)酵溫度29.67 ℃、接種量3.08%、輔料添加量3.89%。根據實際情況，對預測最佳工藝參數進行微調，最終實際工藝參數為發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量3%，輔料添加量4%，為驗證模型預測的工藝參數可靠性，在此條件下進行驗證試驗，以傳統(tǒng)清香型白酒正常發(fā)酵酒醅為對照，重復3 組平行試驗，測得高粱固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中總酯含量和乙酸乙酯含量分別為（8.13±0.08）g/100 g 和（1.30±0.014）g/kg，實際數值與模型預測數值基本一致，故該模型基本準確。

傳統(tǒng)清香型白酒大米查、二米查各發(fā)酵28 d 酒醅中的乙酸乙酯含量在0.3～0.5 g/kg 之間，而利用以上模型，菌株FJZ 所產乙酸乙酯可以達到（1.30±0.014）g/kg，生成量約為傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵酒醅中乙酸乙酯的2.5～4 倍，以上結果表明，菌株FJZ具有提升傳統(tǒng)清香型白酒中乙酸乙酯含量的能力。

3 結論

菌株FJZ 高粱固態(tài)發(fā)酵產乙酸乙酯最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間7 d，接種比例3%，輔料添加量4%。該條件下高粱固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中總酯含量可達（8.13±0.08）g/100 g，乙酸乙酯含量達（1.30±0.014）g/kg，在高粱中產乙酸乙酯能力強。菌株FJZ 具有強化應用于傳統(tǒng)清香型白酒生產中提升乙酸乙酯含量的能力。以上研究為菌株FJZ 在白酒及其他釀造類食品中的開發(fā)利用奠定了理論和應用基礎。