芒果葉總黃酮的提取工藝研究

◎ 莫陽(yáng)麗，劉燕麗，梁偉權(quán)，張開平

（百色學(xué)院 農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西 百色 533000）

芒果（Mangifera indicaL.）屬于仙人掌漆樹科杧果屬，是世界上最受歡迎的熱帶水果之一[1-2]。芒果葉作為芒果的副產(chǎn)品，其富含黃酮類化合物、芒果苷、槲皮素、奎尼酸、山奈酚等多種活性成分[3-5]。芒果葉味酸、甘，性涼、平，具有平喘止咳祛痰[6]、免疫抗炎鎮(zhèn)痛[7-8]、保肝利膽、降血糖[9]和抗氧化[10]等藥理作用，還具有行氣疏滯、去瘀積的功效，可用于熱滯腹痛、氣漲、小兒疳積、消渴等癥狀[11-12]。黃酮類化合物具有抗菌、抗癌、抗氧化等生理功能，可用于治療骨質(zhì)疏松癥和糖尿病[13-14]。目前，關(guān)于芒果葉黃酮類化合物的研究鮮有報(bào)道。芒果葉作為百色優(yōu)勢(shì)資源，具有較大的醫(yī)藥應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化芒果葉總黃酮的提取條件，旨在為芒果葉資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供有效的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

ZT-1000A高速多功能粉碎機(jī)：永康市展帆工貿(mào)有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)真空水泵：上海亞榮生化儀器廠；L6S紫外可見分光光度計(jì)：成都川弘科生物技術(shù)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 材料與試劑

芒果葉：百色市右江區(qū)臺(tái)農(nóng)；蘆?。航靼鄄菰瓷锟萍加邢薰荆粊喯跛徕c、硝酸鋁、過氧化氫、水楊酸等均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參照亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[15]。精確取濃度為0.10 mg·mL-1的0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中。分別加入0.50 mL的5% NaNO2溶液，搖勻靜置6 min；加入0.50 mL的10% Al（NO3）3溶液，搖勻靜置6 min；加入4.00 mL濃度為4% NaOH溶液，再用75% C2H5OH溶液定容，放置15 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 提取工藝流程

芒果葉→清洗→烘干（65 ℃）→粉碎→過篩（100目）→乙醇浸漬→真空抽濾→抽提液。

選取新鮮、沒有腐敗、無(wú)損傷的芒果葉，洗凈、瀝干，65 ℃下烘干，粉碎，過100目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

在50 mL碘量瓶中準(zhǔn)確稱取2 g芒果葉粉末，加入75%乙醇溶液，在60 ℃恒溫水浴鍋中水浴2 h后，真空抽濾，將濾液定容至50 mL容量瓶；在25 mL容量瓶中加入1 mL樣品溶液，加入0.5 mL的5% NaNO2溶液，振搖后放置6 min；加入0.5 mL 10%Al(NO3)3溶液，振搖后擱置6 min；加4% NaOH溶液4.00 mL，再加入75%乙醇定容，擱置15 min。在510 nm處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算樣品中黃酮類物質(zhì)得率：

式中：C為芒果葉中黃酮提取液的濃度（mg·mL-1）；N為稀釋倍數(shù)；V為芒果葉黃酮提取液的體積（mL）；M為芒果葉粉質(zhì)量（g）。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

選取提取時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、料液比（1∶20、1∶ 25、1∶30、1∶ 35、1∶40）、乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、提取溫度（60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃）4個(gè)因素，每個(gè)因素取5個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)3次，按照“1.3.2”所述的基本步驟，研究各個(gè)因素對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS statistics 18軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)

為了確定芒果葉黃酮類物質(zhì)提取的最優(yōu)條件，以黃酮得率為指標(biāo)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，選取提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度和提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)芒果葉黃酮得率的影響

由圖1可知，芒果葉提取液中的黃酮得率隨著提取時(shí)間的增加先上升后下降。提取時(shí)間為2 h時(shí)，黃酮類物質(zhì)的得率最高；提取時(shí)間超過2 h時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率明顯降低?？赡艿脑蚴情L(zhǎng)時(shí)間浸提，部分乙醇揮發(fā)，沸點(diǎn)增大，從而導(dǎo)致部分黃酮類化合物遭到破壞，使得黃酮得率下降。因此，選擇提取時(shí)間為2 h。SPSS軟件方差分析表明提取時(shí)間對(duì)芒果葉黃酮得率的影響顯著（P＜0.05）。

圖1 提取時(shí)間對(duì)芒果葉黃酮得率的影響圖

2.1.2 料液比對(duì)芒果葉黃酮得率的影響

從圖2可以看出，隨著料液比增加，芒果葉提取液中的黃酮類物質(zhì)得率逐漸增加。當(dāng)料液比小于1∶30時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率增幅較大；料液比大于1∶30時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率增加緩慢，說(shuō)明乙醇劑量加大，有助于芒果葉中黃酮類物質(zhì)徹底溶出，但考慮提取成本，確定料液比為1∶30。SPSS軟件方差分析表明料液比對(duì)芒果葉黃酮得率的影響顯著（P＜0.05）。

圖2 不同料液比對(duì)芒果葉黃酮得率的影響圖

2.1.3 乙醇濃度對(duì)芒果葉黃酮得率的影響

由圖3可知，芒果葉提取液中黃酮類物質(zhì)得率隨著乙醇濃度的增加先增加后下降。當(dāng)乙醇濃度為50%～70%時(shí)，芒果葉中黃酮類物質(zhì)容易溶出，黃酮得率不斷升高；繼續(xù)增加乙醇濃度，一些脂溶性物質(zhì)和色素浸出，黃酮類物質(zhì)得率顯著下降，并且這些物質(zhì)將與黃酮類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)溶劑，影響黃酮類物質(zhì)溶出。因此，乙醇濃度的選擇為70%。SPSS軟件方差分析表明乙醇濃度對(duì)芒果葉黃酮得率的影響顯著（P＜0.05）。

圖3 乙醇濃度不同對(duì)芒果葉黃酮得率的影響圖

2.1.4 提取溫度對(duì)芒果葉黃酮得率的影響

由圖4可知，芒果葉提取液中黃酮類物質(zhì)得率隨著溫度的升高先增加后下降。溫度升高加快分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，有助于芒果葉中醇溶性雜質(zhì)溶出。高溫也會(huì)使一些可溶性蛋白變性，增加溶液的黏度，使黃酮得率降低。因此，選取最合適的提取溫度為65 ℃。SPSS軟件方差分析表明提取溫度對(duì)芒果葉黃酮得率的影響顯著（P＜0.05）。

圖4 提取溫度對(duì)芒果葉黃酮得率的影響圖

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表1選取的因素和水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，芒果葉黃酮類物質(zhì)提取的最優(yōu)方案為A2B2C2D3，即提取時(shí)間為2 h，芒果葉與乙醇的比例為1∶30，乙醇濃度為70%，提取溫度為70 ℃。由極差分析表明，影響黃酮得率因素主次順序?yàn)镃＞D＞A＞B，即乙醇濃度＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析表

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選工藝A2B2C2D3和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)組合A2B1C2D3分別重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，其中A2B2C2D3工藝的黃酮得率為（4.87±0.08）%，而A2B1C2D3工藝的黃酮得率為（5.02±0.06）%。通過差異顯著性分析（P<0.05），說(shuō)明這兩種提取工藝差異性顯著。因此，選擇芒果葉黃酮類物質(zhì)提取的最佳工藝組合為A2B1C2D3，即提取時(shí)間為2 h，芒果葉與乙醇的比例為1∶25，乙醇濃度為70%，提取溫度為70 ℃。

3 結(jié)論

黃酮類化合物種類繁多，且理化性質(zhì)差別大，同一原料采用不同提取方法，提取的黃酮類化合物差別較大。目前，黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有乙醇加熱回流法、超聲波法和微波輔助法等[9]。張帆等[15]對(duì)比乙醇加熱回流法和超聲波法提取芒果葉中的黃酮類物質(zhì)，結(jié)果超聲波法提取法的黃酮得率低于乙醇加熱回流法。本實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn)獲得芒果葉黃酮類化合物的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：提取時(shí)間為2 h，芒果葉與乙醇的比例為1∶25，乙醇濃度為70%，提取溫度為70 ℃，在此條件下，芒果葉中黃酮得率為5.02%。

我國(guó)芒果種植區(qū)域廣，芒果葉資源豐富、價(jià)格低廉、四季可采。黃酮類化合物具有抗脂肪氧化、抗衰老、抗菌、治療心腦血管疾病等功效。因此對(duì)芒果葉黃酮類化合物進(jìn)行研究，充分利用芒果葉植物資源，變廢為寶，可為芒果葉的深加工與保健類產(chǎn)品研發(fā)提供支持。