食品中硼酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線制作注意事項(xiàng)探究

◎ 魏文強(qiáng)，李亞平

（通渭縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 通渭 743300）

硼酸是一種含硼化合物，硼酸曾廣泛作為食品添加劑用于面制品、肉制品、水產(chǎn)品中，硼元素也是人體必需的微量元素，但是硼含量超過(guò)限量時(shí)，會(huì)對(duì)人體造成不同程度的毒害[1-4]，成人每日允許最大攝入的硼含量為 0.3 mg·kg-1·d-1[5]，原衛(wèi)生部在 2008 年發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》明確禁止硼酸在食品中添加，即任何食品中不得檢出[6]。目前，我國(guó)食品中硼酸的檢測(cè)方法依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硼酸的測(cè)定》（GB 5009.275—2016），本方法通過(guò)乙基己二醇-三氯甲烷溶液對(duì)食品中的硼酸進(jìn)行富集，再用姜黃素-冰乙酸對(duì)食品中硼酸進(jìn)行顯色，溶液顏色的深淺與所測(cè)定食品中的硼酸含量成正比，可以通過(guò)紫外分光光度計(jì)定量測(cè)定食品中的硼酸[7]。在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制尤為重要，其直接能夠影響到最終食品測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確與否，但在實(shí)際食品中硼酸的測(cè)定過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不好，相關(guān)系數(shù)R值達(dá)不到實(shí)驗(yàn)室要求的問(wèn)題，為探究導(dǎo)致以上問(wèn)題的原因，提高工作效率，本文按照試驗(yàn)步驟，分析總結(jié)試驗(yàn)測(cè)定過(guò)程中的注意事項(xiàng)。

1 材料與方法

1.1 試劑

硼酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg·mL-1）、無(wú)水乙醇（分析純）、2-乙基-1,3-己二醇（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、冰乙酸（分析純）、姜黃色素、三氯甲烷（分析純）、濃硫酸（分析純）和蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（UV8000s），購(gòu)自上海元析儀器有限公司；電子天平（Quintix224-1CN，感量0.1 mg），購(gòu)自德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；渦旋振蕩器（HD-2500），購(gòu)自杭州佑寧儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

（1）準(zhǔn)確吸取硼酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg·mL-1）0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL于25 mL塑料試管中，各加水至5 mL。加硫酸溶液（1+1）1 mL，振蕩混勻，加EHD-CHCl3溶液5.00 mL，蓋上蓋子，渦旋振蕩器振搖2 min，靜置分層，吸取下層的EHDCHCl3溶液并通過(guò)φ7 cm干燥快速濾紙過(guò)濾。

（2）各取1.00 mL過(guò)濾液于50 mL塑料試管中，依次加入姜黃-冰乙酸溶液1.0 mL，硫酸0.5 mL，搖勻，靜置30 min，加無(wú)水乙醇25 mL，靜置10 min，于550 nm處1 cm比色皿測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)系列的硼酸含量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃色素溶解效果對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的影響

分別選用未經(jīng)超聲溶解的姜黃素-冰乙酸和經(jīng)超聲促進(jìn)溶解的姜黃素-冰乙酸作為顯色液，其他試劑和試驗(yàn)條件保持一致進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。未經(jīng)超聲溶解的姜黃素-冰乙酸作為顯色液，做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性和R2值均比經(jīng)超聲促進(jìn)溶解的姜黃素-冰乙酸作為顯色液所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線差。所以在姜黃色素較難溶解的情況下，可以先加適量的冰乙酸，超聲促進(jìn)溶解，然后再定容至100 mL，以保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。

表1 使用不同溶解效果的姜黃素顯色后的吸光度值表

2.2 2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液配制時(shí)間對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的影響

為了驗(yàn)證2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液放置時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的影響，在其他試劑和試驗(yàn)條件保持一致的情況下，選用現(xiàn)用現(xiàn)配的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液和提前配制好，但已經(jīng)放置了12 h、24 h的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。使用不同配制時(shí)間的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性影響較大，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液放置時(shí)間過(guò)久會(huì)造成標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較差，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。

表2 使用不同配制時(shí)間的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液顯色后的吸光度值表

2.3 試驗(yàn)過(guò)程中使用的濃硫酸的開(kāi)啟時(shí)間對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的影響

硼酸測(cè)定過(guò)程中長(zhǎng)時(shí)間使用同一瓶的濃硫酸，由于濃硫酸易吸水，會(huì)造成濃硫酸的濃度下降，為了驗(yàn)證試驗(yàn)過(guò)程中所使用的濃硫酸開(kāi)啟時(shí)間對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的影響，在其他試劑及試驗(yàn)條件保持一致的情況下，使用相同品牌、同一批次但打開(kāi)時(shí)間不同的濃硫酸，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。使用相同品牌、同一批次但打開(kāi)時(shí)間不同的濃硫酸對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性影響較大，使用打開(kāi)時(shí)間越長(zhǎng)的濃硫酸，顯色反應(yīng)顏色會(huì)越淺，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性也會(huì)更差，造成最終的檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

表3 使用開(kāi)啟時(shí)間不同的濃硫酸顯色后的吸光度值表

2.4 含有2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液的不同容積的塑料試管對(duì)硼酸富集、萃取效果的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的影響

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硼酸的測(cè)定》（GB 5009.275—2016）中5.2要求吸取硼酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于25 mL塑料試管中，然后進(jìn)行后續(xù)操作。但在實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，相較于25 mL的塑料試管，選用50 mL的塑料試管做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性更好，這可能是因?yàn)樗芰显嚬苋萘孔兇螅?-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液對(duì)硼酸富集、萃取效果變好。為了驗(yàn)證該因素的影響，在其他試劑及試驗(yàn)條件保持一致的情況下，分別選用50 mL塑料試管、25 mL塑料試管，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。選用50 mL的塑料試管富集、萃取硼酸做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性?xún)?yōu)于選用25 mL的塑料試管。選取50 mL的塑料試管可以使2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液混合更為均勻，對(duì)硼酸的富集、萃取更為有效，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性更好。

表4 選用不同容積規(guī)格塑料試管富集、萃取硼酸后的吸光度值表

3 結(jié)論

分光光度法測(cè)定食品中硼酸的測(cè)定步驟較為復(fù)雜，在硼酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作過(guò)程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。

（1）姜黃素-冰乙酸溶液作為顯色溶液，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性有很重要的影響，在配制過(guò)程中姜黃色素較難溶解，可以先加適量的冰乙酸，超聲促進(jìn)溶解，然后定容至100 mL，此溶液也必須保存于塑料容器中，因?yàn)樵趶?qiáng)酸條件下，含硼酸鹽的玻璃器皿不穩(wěn)定，可以將硼酸鹽轉(zhuǎn)化為硼酸溶液，使用塑料容器可以避免帶入外源性的硼。

（2）2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液因?yàn)楹腥燃淄椋燃淄樵诠庹障虏环€(wěn)定，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致硼酸標(biāo)準(zhǔn)系列梯度不明顯，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不好，相關(guān)系數(shù)R值達(dá)不到實(shí)驗(yàn)室要求，因此，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液要現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）試驗(yàn)過(guò)程中所使用的濃硫酸易吸水而導(dǎo)致濃度下降，反復(fù)使用，會(huì)使最后的顯色反應(yīng)梯度不佳，最終造成標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性不好、相關(guān)系數(shù)R值達(dá)不到實(shí)驗(yàn)室的要求，所以應(yīng)保證濃硫酸的密封性，或者盡量使用新打開(kāi)的濃硫酸。

（4）選用50 mL的塑料試管做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性?xún)?yōu)于選用25 mL的塑料試管，最終做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)R值普遍能達(dá)到0.99以上，符合實(shí)驗(yàn)室的要求，所以建議將標(biāo)準(zhǔn)溶液系列加入到50 mL的塑料試管中，之后再進(jìn)行后續(xù)操作，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。