高效液相色譜法測定醬菜中脫氫乙酸含量的不確定度評定

邢蕊，胡宗武，梁笑天，董蔚，漆倩涯

(1.蘭州中檢科測試技術(shù)有限公司，蘭州 730070；2.蘭州理工大學(xué) 石油化工學(xué)院，蘭州 730050)

醬菜是將新鮮的蔬菜經(jīng)腌漬、微生物發(fā)酵或醬漬加工而成的各種蔬菜制品[1]，因味道鮮美、營養(yǎng)豐富而深受人們的喜愛，逐漸成為人們飯桌上不可或缺的調(diào)味副食品[2-3]。脫氫乙酸是一種低毒高效的食品防腐劑[4-5]，常用于面包、糕點、果蔬汁、發(fā)酵豆制品、腌漬的蔬菜等食品中[6]。但是大量地使用脫氫乙酸將會影響人體的腎臟、肝臟[7]，甚至可能引發(fā)癌癥[8]，同時GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[9]中也明確指出了脫氫乙酸在一些食品中的最大使用量，其中在腌漬的蔬菜中脫氫乙酸的最大使用量為1.0 g/kg[10]。因此，我們對食品中脫氫乙酸的使用進行日常監(jiān)管及對檢測結(jié)果的準確性判斷顯得尤為重要[11]。

本實驗依據(jù)GB 5009.121-2016《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》[12]、JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[13]和CNAS-GL006-2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[14]中規(guī)定的基本方法和程序，采用高效液相色譜法對醬菜中脫氫乙酸的含量進行了測定，分析醬菜中脫氫乙酸含量的不確定度來源，并對其測定結(jié)果的不確定度進行了計算和評定，從而為醬菜中脫氫乙酸含量測定方法的可行性和準確性提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬菜：市售；脫氫乙酸標準品：批號B0003452，純度99.9%，北京曼哈格生物科技有限公司；乙酸銨：色譜純，Aladdin公司；甲醇：色譜純：HiPure Chem公司；硫酸鋅和氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器) 日本島津公司；ME204E電子天平 梅特勒-托利多公司；KQ-500DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；LD5-2B離心機 北京雷勃爾離心機有限公司。

1.3 實驗方法

參照GB 5009.121-2016《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》第二法液相色譜法。

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取脫氫乙酸標準品10 mg，用1 mL氫氧化鈉溶液(20 g/L)溶解在10 mL容量瓶中，用水定容，配制成1000 μg/mL濃度的標準貯備液。分別吸取脫氫乙酸貯備液0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 mL于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL的標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

稱取已粉碎的試樣2 g，置于50 mL離心管中，加入約10 mL水、5 mL硫酸鋅溶液(120 g/L)，用氫氧化鈉溶液(20 g/L)調(diào)pH至7.5，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。置于離心管中，超聲提取10 min，4000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm有機濾膜，供高效液相色譜測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱 ZORBAX Eclipse Plus C18柱 (4.6 mm×250 mm×5.0 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇+0.02 mol/L乙酸銨溶液(10+90，體積比)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：293 nm。

1.4 數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中脫氫乙酸含量的計算公式為：

式中：X為樣品中脫氫乙酸的含量，g/kg；C為樣品溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg/mL；C0為空白樣品溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品溶液總體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)實驗方法所建立的數(shù)學(xué)模型并結(jié)合相關(guān)信息，分析影響測定結(jié)果的不確定度，其主要來源于樣品的稱量、樣品溶液的定容、標準溶液的配制、容量瓶的校準、標準曲線的擬合、樣品的重復(fù)性分析等過程。

通過分析以上各不確定度分量，并合成相對標準不確定度。在95%的置信水平下，得到擴展不確定度，最終量化高效液相色譜法測定醬菜中脫氫乙酸含量的不確定度。

2.2 不確定度各分量的評定

2.2.1 樣品稱量過程中引入的不確定度

稱量過程的重復(fù)性和天平的準確性是樣品稱量過程中不確定度的主要來源，其中樣品稱量過程中的重復(fù)性所引入的不確定度分量已包含在各種因素造成的重復(fù)性影響修正值不確定度分量中。

根據(jù)電子天平的檢定證書，天平的分辨率為0.1 mg，稱樣量m≤50 g時，最大允許誤差為±0.5 mg，稱取樣品2 g，按均勻分布，則不確定度為：

則稱重的相對標準不確定度為：

2.2.2 樣品定容過程中引入的不確定度

樣品定容過程中的不確定度主要是容量瓶的準確性和溫度變化兩個方面引入的。

2.2.2.1 容量瓶的準確性引入的不確定度

經(jīng)計量校準，本次實驗所用的25 mL容量瓶合格，根據(jù)校準證書可得其容量的允許誤差為±0.03 mL，按均勻分布，則相對標準不確定度為：

2.2.2.2 溫度變化引入的不確定度

玻璃器具出廠校準溫度與實驗室使用溫度的差異是溫度變化引入的不確定度，已知玻璃器具的校準溫度為20 ℃，本實驗室實際使用溫度變化范圍為±3 ℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，則不確定度分量為：

2.2.2.3 定容過程中引入的相對標準不確定度

2.2.3 由標準曲線求得結(jié)果引入的不確定度

脫氫乙酸標準物質(zhì)的純度、標準溶液的配制過程和擬合標準曲線非線性所引入的不確定度是標準曲線求得結(jié)果引入的不確定度主要來源。

2.2.3.1 脫氫乙酸標準物質(zhì)純度引入的不確定度

由標準物質(zhì)證書可知，本實驗所用的脫氫乙酸標準物質(zhì)的純度為99.9%，其相對擴展不確定度為2%，k=2，則標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度為：

2.2.3.2 標準溶液配制過程中稱量標準物質(zhì)引入的不確定度

由本實驗所用電子天平的檢定證書可知，天平的分辨率為0.01 mg，稱樣量m≤5 g時，最大允許誤差為±0.05 mg，稱取標品9.68 mg，按均勻分布，則不確定度為：

則標準品稱量的相對標準不確定度為：

2.2.3.3 標準溶液配制過程中所用容量瓶準確性引入的不確定度

本實驗采用10 mL A級容量瓶配制標準溶液，其允許誤差為±0.020 mL，假設(shè)為均勻分布，則相對標準不確定度為：

2.2.3.4 標準溶液配制過程中溫度變化引入的不確定度

水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，本實驗室使用溫度與校準溫度變化范圍為±3 ℃，則不確定度分量為：

2.2.3.5 標準曲線的擬合引入的不確定度

本實驗采用6個濃度水平點的脫氫乙酸標準溶液，每一濃度點測定2次，測定結(jié)果見表1。

表1 脫氫乙酸的標準曲線測定結(jié)果Table 1 The determination results of standard curves of dehydroacetic acid

本實驗對樣品測定液進行了6次測定，由直線方程求得各次測量值，計算其平均質(zhì)量濃度為C=9.834 μg/mL，其相對標準不確定度為：

將以上各計算值帶入公式，得標準曲線擬合的不確定度：

=0.00788。

即得由標準曲線求得結(jié)果引入的合成相對標準不確定度為：

=0.0131。

2.2.4 各種因素造成的重復(fù)性引入的不確定度

在整個處理過程中，因樣品前處理的不確定度有溫度、時間、加入試劑的量、提取效率、容器附著的量等引入的不確定度分量，可通過平行測定來評估不確定度分量。

在重復(fù)性條件下，對樣品進行了6次獨立測試，脫氫乙酸含量分別是0.122，0.123，0.123，0.121，0.122，0.123 g/kg，則脫氫乙酸含量的平均值為0.122 g/kg，則樣品測試的重復(fù)性所引入的相對標準不確定度為：

2.3 相對標準不確定度的合成及擴展

2.3.1 各不確定度分量匯總

各相對標準不確定度分量見表2。

表2 相對標準不確定度分量表Table 2 The relative standard uncertainty components

2.3.2 合成相對標準不確定度

對上述各不確定度分量進行分析，合成相對標準不確定度為：

=0.0135。

2.3.3 相對擴展不確定度

取置信概率95%，k=2，得高效液相色譜法測定醬菜中脫氫乙酸的相對擴展不確定度為：

Urel=k×Urel(y)=2×0.0135=0.0270。

2.3.4 擴展不確定度

由實驗數(shù)據(jù)可知樣品中脫氫乙酸含量為0.122 g/kg，其擴展不確定度為：

U=0.122×0.0270=0.003 g/kg。

2.3.5 結(jié)果表示

通過高效液相色譜法測定醬菜中脫氫乙酸含量，測定結(jié)果為：

X=(0.122±0.003) g/kg，k=2。

3 結(jié)論

參照GB 5009.121-2016中的方法，采用高效液相色譜法對醬菜中脫氫乙酸的含量進行了測定，并根據(jù)JJF 1059.1-2012和CNAS-GL006-2019中規(guī)定的方法和程序，對實驗過程中影響脫氫乙酸含量的各不確定度進行分析和評定。通過分析發(fā)現(xiàn)，對測定結(jié)果影響最大的是由標準曲線所求得的濃度，其次是測定的重復(fù)性。而樣品稱量和樣液定容所引入的不確定度較小。因此，在實驗過程中我們應(yīng)選擇質(zhì)量穩(wěn)定、準確度等級較高的標準品，嚴格把控標準品的配制過程，其次可增加標準溶液的濃度點和測定次數(shù)，加強操作人員的培訓(xùn)，檢測儀器的校準等措施減小測定結(jié)果的不確定度，從而提高檢測結(jié)果的準確性。