王儀威，馮祎高，劉潤然，盧春甜，曹愛忠，張瑞奇

南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210095

由禾谷鐮孢菌復合種（Fusarium graminearumcomplex）引起的赤霉病是我國小麥生產(chǎn)中一種重要的真菌病害。近年來，由于氣候變暖、抗病品種缺乏以及大量秸稈還田等，赤霉病在長江中下游麥區(qū)和黃淮麥區(qū)頻繁發(fā)生，已成為小麥主產(chǎn)區(qū)的重要病害，嚴重威脅小麥的安全生產(chǎn)。小麥感染赤霉病后不僅影響產(chǎn)量，而且會使籽粒中產(chǎn)生大量脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）等真菌毒素，嚴重危害人類健康[1]?；瘜W殺菌劑如多菌靈、戊唑醇和氰烯菌酯等被廣泛用于小麥赤霉病的防治，但長期使用這些殺菌劑，會造成病菌產(chǎn)生抗藥性，嚴重影響藥劑的防治效果。另外，藥劑防治不僅增加了小麥生產(chǎn)成本，且對環(huán)境也造成污染。因此，培育抗病品種和合理種植布局是控制小麥赤霉病的根本措施。

發(fā)掘優(yōu)異抗性資源及對其抗性進行遺傳解析是培育抗病品種的前提。普通小麥經(jīng)過近萬年的人工馴化和育種選擇，遺傳基礎日趨狹窄，抗赤霉病的種質(zhì)資源相對匱乏，僅有蘇麥3號、望水白等少數(shù)資源[2-3]。盡管研究者針對小麥抗侵染、抗擴展和低毒素積累性狀從小麥種內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與赤霉病抗性相關的數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL）200多個[1]，但大部分位點對赤霉病抗性的貢獻較低，需要將多個位點聚合后才能達到中抗以上水平。然而，小麥近緣種保留了豐富的遺傳多樣性，且對各種生物和非生物脅迫具有良好的適應性，為小麥赤霉病抗性改良提供了優(yōu)異基因資源。

近年來，國內(nèi)外針對小麥高抗赤霉病種質(zhì)資源缺乏問題，已開展了小麥近緣種抗赤霉病資源發(fā)掘工作，在大賴草、鵝觀草、纖毛鵝觀草、長穗偃麥草等近緣種中發(fā)掘出一批抗赤霉病的優(yōu)異種質(zhì)[1]。通過遠緣雜交和染色體工程將赤霉病抗性導入小麥對小麥抗性育種具有重要意義。目前，來自小麥近緣屬種的抗赤霉病基因有3個。其中，來自于大賴草的Fhb3定位于（Leymus racemosus）7Lr#1染色體短臂[4]；來自于鵝觀草的Fhb6定位于（Roegneria kamoji）1Rk#1染色體短臂[5]；來自于偃麥草的Fhb7定位于（Thinopyrum）7E染色體長臂[6]。這些優(yōu)異的赤霉病抗性基因，為小麥抗赤霉病育種提供了重要的基因資源。

鵝觀草（R.kamojiOhwi，2n=42，SSHHYY）為多年生草本植物，廣泛分布于東亞地區(qū)。周永紅等[7]鑒定了鵝觀草屬13個種71份材料，結果表明鵝觀草屬是小麥族中赤霉病抗性最強、抗源最多的一個屬。翁益群[8]等對小麥族8個屬近20個親緣種進行接種鑒定發(fā)現(xiàn)，鵝觀草的赤霉病抗性較好，且通過遠緣雜交和幼胚培養(yǎng)，獲得了鵝觀草與中國春的雜種及回交后代。經(jīng)過多次回交、自交后，Wang等[9]選育出5個附加系和代換系，經(jīng)限制性片段長度多態(tài)性（restricted fragment length polymorphisms，RFLP）分 析，明 確 附 加系NAU701、NAU702和代換系NAU751中鵝觀草染色體分別屬于第1、第5和第3部分同源群，被標定為1Rk#1、5Rk#1和3Rk#1。汪杏芬等[10]選育出赤霉病抗性較好的1Rk#1（1A）異代換系。此后，美國堪薩斯州立大學Cainong等[5]從南京農(nóng)業(yè)大學引進1Rk#1滲入系材料，利用中國春ph1b1b突變材料誘導染色體重組，創(chuàng)制出了T1AL·1AS-1Rk#1S小片段易位系，通過赤霉病抗性鑒定，將該易位系攜帶的抗赤霉病基因定名為Fhb6。由于鵝觀草基因組的核型分析尚不能區(qū)分每條染色體的基因組歸屬，因此，攜帶Fhb6基因的染色體基因組歸屬目前還不清楚。

目前，許多外源物質(zhì)鑒定新方法和技術的出現(xiàn)和發(fā)展使得快速鑒定和精確識別外源染色體身份成為可能。為了發(fā)掘鵝觀草基因組中更多優(yōu)異的赤霉病抗源，南京農(nóng)業(yè)大學細胞遺傳所2010年重新開展了中國春與鵝觀草遠緣雜交研究[11]。通過多年回交、自交，獲得了鵝觀草不同染色體滲入到中國春背景的細胞學材料。本研究基于滲入系材料，欲篩選鵝觀草第一部分同源染色體特異分子標記，并進一步利用分子標記對攜帶Fhb6染色體進行基因組歸屬分析，篩選鑒定鵝觀草第一部分同源群不同染色體滲入系材料，為后續(xù)鵝觀草第一部分同源群染色體上赤霉病抗性基因的發(fā)掘奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鵝觀草NAURK01采自南京農(nóng)業(yè)大學江浦試驗田自然生長的鵝觀草。為區(qū)分1989年與中國春雜交的鵝觀草，將重新雜交鵝觀草NAURK01的染色體編號為#2，早期雜交的鵝觀草染色體編號為#1。攜帶抗赤霉病基因Fhb6的二體異代換系材料DS1RK#1(1A)用于分析攜帶Fhb6染色體的基因組歸屬。另外用于鵝觀草染色體基因組歸屬分析的小麥野生近緣屬種包括黑麥（Secale，RR）、大麥（H.vulgare，HH）、老芒麥（E.sibiricus，SSHH）、二倍體擬鵝觀草（P.libanotica，SS）、加拿大披堿草（E.canadensis，StStHH）和纖毛鵝觀草（R.ciliaris，SSYY）。以普通小麥中國春和安農(nóng)8455作為對照。上述材料均由南京農(nóng)業(yè)大學細胞遺傳研究所保存提供。

1.2 細胞學鑒定

將試驗材料種子按單粒編號、浸種、發(fā)芽，待幼根長至2 cm左右，將種子移至盛有0.2 μmol·L-1甲基胺草磷（amiprophos methyl，APM，溶劑為丙酮）溶液的培養(yǎng)皿中浸泡2 h，再用清水沖洗后將根剪下，放入0.5 mL離心管（管蓋上扎一小孔）。隨后將離心管放入密封的笑氣罐中，充入壓強為0.8～1.2 MP的笑氣（N2O），1.5 h后取出，加入90%預冷冰乙酸固定8 min后將根取出，經(jīng)濾紙吸干放入新的1.5 mL離心管，加入適量70%的乙醇，保存于-20℃冰箱備用。用45%醋酸溶液解離根尖，取分生區(qū)細胞以壓片法制片。將制好的片子放入-70℃冰箱，充分冷凍后，揭去蓋片放入無水乙醇中脫水5 min以上，氣干后用于原位雜交。

基因組原位雜交（genomic in situ hybridization，GISH）探針和重復序列寡聚核苷酸探針混合熒光原位雜交（Oligo-fluorescence in situ hybridization，Oligo-FISH）具體操作步驟參照王丹蕊等[12]方法進行。純化后的鵝觀草基因組DNA用Fluorescein-12-dUTP（Roche）經(jīng)缺刻平移法標記后用作GISH探針。使用的重復序列寡聚核苷酸探針為小麥D基因組染色體轉(zhuǎn)化的pAs1-2和pAs1-5，用紅色熒光素TAMRA 5′端標記，探針序列和熒光標記由安徽通用生物系統(tǒng)公司合成。GISH和Oligo-FISH分析時每張制片的雜交液中探針用量為：鵝觀草基因組GISH探針2 μL，重復序列寡聚探針pAs1-2和pAs1-5各加1 μL。進行雜交時封阻用的中國春基因組DNA與鵝觀草基因組GISH探針的濃度比為100∶1。原位雜交制片在OLYMPUS BX53型熒光顯微鏡下選取染色體完整、分散良好的有絲分裂中期細胞，用DP80 CCD(Cooled Color Digital Camera)和cellSens Standard 1.18成像系統(tǒng)（OLYMPUS）拍照，利用Adobe Photoshop（v6.0）軟件進行圖片分析。

1.3 分子標記鑒定

CTAB法提取植株葉片DNA[13]。從已定位于小麥第一群染色體臂的特異EST-STS標記中篩選鵝觀草第一部分同源群染色體特異標記[14-16]，標記信息詳見表1。PCR擴增反應體系為10 μL，包含2×TaqTSINGKE Master Mix（green，購自北京擎科生物科技有限公司）5 μL，DNA模板（濃度約120 ng·μL-1）1 μL，引物各0.2 μL（10 μmol·L-1），ddH2O 3.6 μL。然后加入7 μL石蠟油進行液封，防止DNA在PCR過程中揮發(fā)。800 r·min-1離心20 s，取出后緩慢顛倒，使各成分充分混勻。PCR程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸50 s，33次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。8%的聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳檢測PCR產(chǎn)物，1%硝酸銀染色。

表1 鵝觀草第一部分同源群染色體特異分子標記Table 1 Specific molecular markers of homologous group chromosomes1 in R.kamoji

2 結果與分析

2.1 鵝觀草第一部分同源群染色體特異分子標記篩選

利用45個標記對鵝觀草NAURK01及攜帶Fhb6的小麥-鵝觀草異代換系DS1RK#1(1A)進行掃描，有20個標記能夠鑒定出鵝觀草第一部分同源群1條或多條染色體，但多數(shù)標記在鵝觀草與普通小麥中擴增產(chǎn)物的分子量大小較接近。其中，CINAU27、CINAU190、CINAU207和CINAU493在普通小麥中國春和安農(nóng)8455均能擴增出1A、1B和1D特異條帶，同時能夠鑒定鵝觀草第一部分同源群2條或3條染色體，且PCR產(chǎn)物與小麥第一部分同源群染色體擴增產(chǎn)物易于區(qū)分，因此，選取這4個STS標記用于后續(xù)材料鑒定（表1）。其中，CINAU27在鵝觀草中擴增出兩條特異條帶，其余3個標記在鵝觀草中擴增出3條特異條帶(圖1，2)。CINAU493定位于小麥第一部分同源群染色體長臂，其余3個標記定位于小麥第一部分同源群染色體短臂。

2.2 攜帶Fhb6染色體的基因組歸屬分析

利用CINAU27對小麥近緣物種中可能是鵝觀草基因組供體的二倍體或四倍體種進行鑒定，結果（圖1）表明，除大麥（HH）外，該標記在供試材料中均擴增出特異條帶，表明該標記序列在小麥近緣物種中存在同源序列，可用于基因組進化分析。CINAU27在六倍體鵝觀草（SSHHYY）和四倍體纖毛鵝觀草（SSYY）擴增出了兩條分子量大小相同的條帶，一條分子量為930 bp，另一條分子量為590 bp。在四倍體老芒麥（SSHH）和二倍體擬鵝觀草（SS）中僅擴增出了590 bp特異條帶。因此，CINAU27在六倍體鵝觀草中擴增出的590 bp特異條帶應為1S特異條帶，930 bp特異條帶應為1Y特異條帶。攜帶Fhb6小麥-鵝觀草異代換系DS1RK#1(1A)DNA僅出現(xiàn)930 bp特異條帶，缺失1A染色體特異條帶（圖2a），由此推斷，該小麥-鵝觀草異代換系為DS1Y#1（1A），F(xiàn)hb6基因所在的染色體為1Y#1。

圖1 分子標記CINAU27在普通小麥及其近緣屬種PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR productions amplified by marker CINAU27 in wheat and its relatives

2.3 小麥-鵝觀草第一部分同源群染色體滲入系材料分子細胞學鑒定

從中國春與NAURK01的BC2F6世代中共計選育出5份材料涉及鵝觀草第一部分同源群染色體，分別命名為21RK-1、21RK-2、21RK-3、21RK-4和21RK-5。利用篩選的鵝觀草4個特異STS標記對5份材料進行PCR，結果（圖2）表明，21RK-1的4個STS標記擴增產(chǎn)物與攜帶Fhb6小麥-鵝觀草異代換系DS1RK#1(1A)完全相同；與中國春相比，多一條1Y染色體特異條帶，而缺少1A染色體特異條帶。21RK-2與中國春相比，CINAU27的擴增產(chǎn)物多一條1S染色體特異條帶，而缺少1D染色體特異條帶。21RK-3、21RK-4和21RK-5擴增的鵝觀草特異條帶與21RK-2相同，表明均是涉及1S#2染色體的滲入系材料。但21RK-5在用CINAU493擴增時缺少鵝觀草特異條帶，表明該材料包含的染色體是1S染色體短臂。

圖2 基因組特異分子標記在5份小麥-鵝觀草滲入系材料的PCR擴增結果Fig.2 PCR productions of five wheat-R.kamoji introgression lines amplified by using four STS markers

基因組原位雜交和oligo-FISH鑒定發(fā)現(xiàn)（圖3），21RK-1的染色體數(shù)目2n=42，包含一對鵝觀草染色體（圖3B），其Oligo-FISH核型與1Y#1相同（圖3G），因此，21RK-1是1Y#2染色體代換1A染色體的二體異代換系DS1Y#2(1A)。21RK-2的染色體數(shù)目2n=42，包含一對鵝觀草染色體且其oligo-FISH核型與1Y染色體不同（圖3G），且缺少一對1D染色體（圖3C），因此，21RK-2是1S#2染色體代換1D染色體的二體異代換系DS1S#2（1D）。21RK-3是添加1S#2染色體的異附加系DA1S#2（圖3D）。21RK-4為1S#2和TW·1S#2S的雙單體附加系（圖3E）。21RK-5為純合TW·1S#2S易位系（圖3F）。

圖3 小麥-鵝觀草滲入系材料的GISH/FISH分析Fig.3 GISH/FISH analysis of six wheat-R.kamoji introgression lines

3 討論

小麥野生近緣屬種包含大量的異源多倍體，這些異源多倍體基因組的二倍體供體鑒定是一項復雜的工作。傳統(tǒng)的異源多倍基因組組成分析主要依靠染色體核型分析，或?qū)愒炊啾扼w與不同二倍體雜交后對其雜種F1花粉母細胞減數(shù)分裂染色體進行構型分析。鵝觀草是異源六倍體（2n=2x=42，SSHHYY），染色體較多，要獲得一套以普通小麥為背景的完整鵝觀草添加系/代換系是一項長期工作，并且鵝觀草染色體組的核型難以區(qū)分每一條染色體，因此，小麥-鵝觀草染色體滲入系的鑒定具有巨大挑戰(zhàn)。南京農(nóng)業(yè)大學細胞遺傳研究所早在20年前就選育出了抗赤霉病較好的二體異代換系材料DS1RK#1(1A)[8-10]，將其攜帶的抗赤霉病基因命名為Fhb6[5]，但一直無法確定攜帶該基因染色體的基因組歸屬。本研究通過篩選小麥及其近緣屬種第一部分同源染色體特異分子標記，明確了攜帶抗赤霉病基因Fhb6的染色體為1Y染色體。利用這些標記從中國春與鵝觀草的滲入系中鑒定出了5份涉及鵝觀草第一部分同源群染色體的新種質(zhì)。本研究結果表明，基因組特異分子標記為精確、高效鑒定小麥-鵝觀草滲入系提供了新策略，加快了鵝觀草中優(yōu)異抗性基因的發(fā)掘工作，對小麥與其他野生近緣種的遠緣雜交工作具有借鑒作用。

小麥及其近緣屬種赤霉病抗性遺傳分析表明，高抗病材料往往包含多個抗病基因。異源六倍體鵝觀草是抗小麥赤霉病最強的野生近緣屬種，可能也是多個抗性基因聚合的效應。本實驗室對鵝觀草與普通小麥雜種后代的赤霉病抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，中國春與鵝觀草雜種F1及回交BC1F1和BC2F1后代的赤霉病抗性較高[11]，但總體上隨著回交和自交代數(shù)增加呈下降趨勢。這可能是隨著世代增加，攜帶多條鵝觀草染色體的單株逐步被淘汰，每個植株(系)中只保留1～2條外源染色體，因此，推測鵝觀草抗小麥赤霉病基因可能位于不同染色體。從鵝觀草1Y染色體短臂末端定位到一個赤霉病抗性位點Fhb6，與其部分同源的第一部分同源群其他染色體上也可能存在Fhb6等位基因。本研究從中國春與鵝觀草重新雜交的后代中選育到新的1Y#2（1A）二體異代換系，還選育到4個與其部分同源的1S#2染色體滲入系材料。這些材料為進一步發(fā)掘Fhb6等位基因奠定了基礎。盡管對這些材料還未進行系統(tǒng)的赤霉病抗性鑒定，但多年的自然發(fā)病觀察發(fā)現(xiàn)攜帶1S#2染色體的21RK-2和21RK-3抗性較好，可能攜帶新的赤霉病抗性位點，生育期較中國春早，穗型與中國春不同，短芒且育性好（圖4）。DS1S#2（1D）二體異代換系材料21RK-2與感赤霉病優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種安農(nóng)8455雜交獲得了1S#2與1D雙單體材料，后續(xù)將進一步從其自交后代材料中鑒定1DL.1S#S和1DS.1S#L補償性易位系，系統(tǒng)分析安農(nóng)8455遺傳背景下易位系的赤霉病抗性和農(nóng)藝性狀，為小麥抗赤霉病育種提供新種質(zhì)。

圖4 中國春及中國春-鵝觀草滲入系穗型Fig.4 Spikes of Chinese Spring and CS-R.kamoji introgression lines