王永剛，張旭，張鵬，馬鴻翔*

1.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省作物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州225009；

2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014

植物細(xì)胞工程是以植物細(xì)胞全能性為理論基礎(chǔ)，以植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)為技術(shù)支持，在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平對(duì)植物進(jìn)行遺傳操作，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)植物的改良和利用[1]。小麥赤霉病是危害全球小麥產(chǎn)量和品質(zhì)最重要的病害之一，致病菌侵染后產(chǎn)生的鐮刀菌毒素進(jìn)一步威脅著人畜健康與安全，培育與推廣抗赤霉病品種是控制小麥赤霉病危害的根本途徑[2]。抗赤霉病育種與其他性狀育種一樣，是不斷創(chuàng)造變異、選擇變異和穩(wěn)定變異并培育出新品種的過程。利用細(xì)胞工程創(chuàng)造新的體細(xì)胞無性系變異，以及利用花藥培養(yǎng)或胚拯救技術(shù)穩(wěn)定變異在加速抗赤霉病育種進(jìn)程方面發(fā)揮了重要作用。

1 體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)

植物組織培養(yǎng)脫分化再分化過程中產(chǎn)生的變異稱作體細(xì)胞無性系變異[3]，是植物組織培養(yǎng)過程中的普遍現(xiàn)象，對(duì)各種植物體細(xì)胞無性系變異后代的分析已經(jīng)證明，絕大多數(shù)變異是可遺傳的，可在育種上加以利用。高明尉等[4]以小麥幼胚為外植體育成了具有高產(chǎn)早熟抗病耐濕的小麥品種核組8號(hào)。

1.1 影響體細(xì)胞無性系及變異發(fā)生的因素

影響體細(xì)胞無性系發(fā)生的主要因素包括基因型、外植體和培養(yǎng)條件等?；蛐褪怯绊戵w細(xì)胞無性系發(fā)生的重要因素，基因型對(duì)出愈率影響較小，主要影響綠苗分化率，綠苗分化率在基因型之間差異可達(dá)4倍以上[5]。幼穗、幼胚、成熟胚、莖段和節(jié)等不同組織為外植體的體細(xì)胞變異誘導(dǎo)和分化方面存在明顯差異，以幼胚為外植體的綠苗分化率最高，其次為幼穗，再次是成熟胚和莖段，節(jié)最低[6-7]。

體細(xì)胞無性系變異頻率受基因型和外植體影響。對(duì)體細(xì)胞無性系R1和R2代變異性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同性狀和供體品種的變異頻率差異很大，蘇麥3號(hào)總變異頻率僅為50%，而揚(yáng)麥3號(hào)變異頻率可達(dá)到73%[5]。

1.2 以DON為選擇壓篩選細(xì)胞無性系變異

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）是小麥赤霉病病菌侵染小麥后產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，DON積累有利于赤霉病的擴(kuò)展，試驗(yàn)證明，敲除病菌毒素產(chǎn)生關(guān)鍵酶基因Tri5的突變體菌株侵染寄主后病小穗率顯著降低，擴(kuò)展受到抑制[8]。離體培養(yǎng)試驗(yàn)表明，將幼胚愈傷組織置于添加DON毒素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，兩周后大部分細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂受到抑制，抗病品種與感病品種的幼胚愈傷組織在毒素選擇壓下均出現(xiàn)愈傷組織褐化。毒素濃度為0.6×10-4mol·L-1時(shí)，高抗赤霉病品種望水白的愈傷組織褐化率明顯低于中抗品種溫州紅和尚和感病品種Alondra，在0.8×10-4mol·L-1毒素濃度時(shí)，溫州紅和尚品種的愈傷組織褐化率顯著低于感病品種Alondra，分別為72.3%和84.1%[6]。以DON為選擇壓在蘇麥3號(hào)和綿陽(yáng)11的抗性比較中也得到類似結(jié)論[9]。培養(yǎng)過程中對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷組織以分生孢子定量接種鑒定愈傷組織抗病性，可進(jìn)一步將愈傷組織分為感病和抗病兩種不同類型，在后代材料的赤霉病抗性上，由感病愈傷組織分化出的植株均表現(xiàn)出感病、無抗病植株，由抗病愈傷組織產(chǎn)生的植株則抗病與感病均有，在愈傷組織階段進(jìn)行抗病鑒定可大量淘汰感病材料[10-11]。

加入培養(yǎng)基篩選的毒素可以使用純DON毒素或者赤霉病病菌提取的粗毒素[12]。毒素對(duì)細(xì)胞毒害能力與處理濃度和時(shí)間有關(guān)，提高濃度和延長(zhǎng)時(shí)間均會(huì)導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率劇降，直至培養(yǎng)細(xì)胞全部死亡。為了提高細(xì)胞突變體的抗性，人們嘗試采用從低毒素含量到高毒素含量的脅迫培養(yǎng)篩選方法[13]。如將感病品種Alondra幼胚或幼胚愈傷組織置于添加了0.4×10-4～1.0×10-4mol·L-1DON毒素的培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，經(jīng)過2～3次篩選后將在毒素下存活并生長(zhǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至添加相同或更高濃度的毒素培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選，經(jīng)過多次篩選最終獲得耐毒素的細(xì)胞系[14]。

1.3 體細(xì)胞無性系變異的分子與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

體細(xì)胞無性系變異檢測(cè)是探討其變異規(guī)律、驗(yàn)證變異的穩(wěn)定性、鑒定篩選有利變異并最終應(yīng)用于育種工作的重要環(huán)節(jié)。體細(xì)胞無性系變異選擇并非對(duì)所有作物都有效，相對(duì)而言，更適用于營(yíng)養(yǎng)繁殖作物如馬鈴薯、甘蔗、香蕉等[15]，但已有報(bào)道證明，體細(xì)胞無性系變異選擇對(duì)小麥同樣有效。以寧麥3號(hào)、蘇麥3號(hào)和揚(yáng)麥3號(hào)等5個(gè)小麥品種經(jīng)體細(xì)胞組織培養(yǎng)的再生植株當(dāng)代及其自交后代為供體材料進(jìn)行分子與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，過氧化物酶和酯酶同工酶電泳發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞無性系存在大量酶譜變異[16]。小麥體細(xì)胞再生株（R1）染色體變異分析發(fā)現(xiàn)R1代有絲分裂表現(xiàn)為染色體數(shù)量變異，常見的有2n-2類型，其次為2n-1類型，也有少數(shù)為2n+1或2n-4等變異類型，再生植株R1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)單價(jià)體、多價(jià)體、染色體橋、落后染色體、斷片和微核等異?，F(xiàn)象[17]。分子標(biāo)記多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，寧麥3號(hào)與抗赤霉病的體細(xì)胞無性系寧895004在分子水平上具有顯著差異[18]。揚(yáng)麥158與其經(jīng)幼胚組培產(chǎn)生的兩個(gè)抗赤霉病突變系間的AFLP分析同樣發(fā)現(xiàn)了多個(gè)位點(diǎn)的變異[19]。

1.4 體細(xì)胞無性系變異培育抗赤霉病小麥品種

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用寧麥3號(hào)、揚(yáng)麥3號(hào)、揚(yáng)麥5號(hào)和揚(yáng)麥158等農(nóng)藝性狀優(yōu)良且豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)品種的幼胚、幼穗及其培養(yǎng)物，幼胚經(jīng)脫分化形成愈傷組織再脫分化成苗，得到綠苗3 000叢，經(jīng)過選擇和鑒定，獲得了一批抗小麥赤霉病且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的育種材料。以寧麥3號(hào)為供體獲得體細(xì)胞無性系變異，經(jīng)農(nóng)藝性狀及赤霉病抗性鑒定，育成了生抗1號(hào)，于1999年通過江蘇省品種審定。以揚(yáng)麥158幼胚為外植體，誘導(dǎo)再生成苗，經(jīng)農(nóng)藝性狀和抗病性鑒定，育成了赤霉病抗性較供體顯著提高的小麥品種——生選3號(hào)[20]（圖1），于2001年通過江蘇省品種審定。

圖1 生選3號(hào)選育過程Fig.1 Breeding process of Shengxuan 3

2 加倍單倍體培育與應(yīng)用

有性雜交是有目的培育抗赤霉病品種的有效途徑。有性雜交后代重組基因型的純合速度影響著常規(guī)育種的效率。為了加快基因型純合速度，加倍單倍體技術(shù)在抗赤霉病育種中得到了研究與應(yīng)用。

2.1 花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)加倍單倍體

培養(yǎng)基和基因型是影響花藥培養(yǎng)效果的重要因素。不同基因型綠苗產(chǎn)出率差異很大，Alondra與蘇麥3號(hào)相比綠苗產(chǎn)出率相差10倍[6]。不同雜交組合的花藥培養(yǎng)出愈率和綠苗分化率也存在顯著差異，最高出愈率達(dá)85.32%，最低4.0%，綠苗分化率最高達(dá)17.9%，最低為0。雜交組合父本、母本對(duì)F1花粉綠苗產(chǎn)量的影響明顯，以揚(yáng)麥158為母本、望水白為父本的F1代花粉綠苗比例為6.79%；以蘇麥3號(hào)、繁60096為父本的F1代花粉綠苗比例分別是1.62%和0.99%。不同世代小麥花藥培養(yǎng)的遺傳效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)出愈率主要受顯性效應(yīng)影響，而綠苗分化率以加性和顯性效應(yīng)為主，也存在上位效應(yīng)和基因間的互作[21]。培養(yǎng)基比較試驗(yàn)中，C17和W14兩種培養(yǎng)基較適合小麥花藥培養(yǎng)，添加低濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑4PU-30可改善愈傷組織質(zhì)量，從而提高綠苗分化率[22]。

花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)加倍單倍體技術(shù)已成功用于赤霉病抗性遺傳改良。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)雙單倍體技術(shù)結(jié)合常規(guī)育種選育出了生抗2號(hào)、生選6號(hào)等赤霉病抗性改良的小麥新品種。其中生選6號(hào)是以矮稈、大穗、中感赤霉病的寧麥8號(hào)為母本，以高產(chǎn)、中抗赤霉病的弱筋小麥寧麥9號(hào)為父本，雜交種子經(jīng)花藥培養(yǎng)、誘導(dǎo)單倍體、秋水仙素獲得加倍，后代經(jīng)性狀鑒定與田間篩選，于2008年通過國(guó)家品種審定（圖2）。據(jù)國(guó)家區(qū)試2005—2009年的鑒定結(jié)果，在421個(gè)參試品種（系）中，22個(gè)品種（系）在一年鑒定中達(dá)到“抗”，而生選6號(hào)連續(xù)兩年鑒定結(jié)果都為“抗”[23]。

圖2 生選6號(hào)選育過程Fig.2 Breeding process of Shengxuan 6

2.2 玉米授粉誘導(dǎo)小麥加倍單倍體

玉米授粉誘導(dǎo)加倍單倍體的原理是：小麥玉米雜交后，在最初的3次細(xì)胞分裂中來自玉米花粉的染色體被逐漸排除掉，僅剩下21條來自母本小麥的染色體，形成了小麥單倍體胚，單倍體胚培養(yǎng)成苗經(jīng)染色體加倍可獲得純合的加倍單倍體。

玉米基因型、玉米與小麥花期的匹配度、2,4-D處理及培養(yǎng)條件影響著玉米授粉誘導(dǎo)加倍單倍體的效率。廣甜2號(hào)（甜玉米）、中北407（普通玉米）、爆裂玉米和中糯2號(hào)（糯玉米）的得胚率分別為35.7%、10.3%、8.7%和5.9%[24]。甜玉米、糯玉米、普通玉米得胚率逐步降低[25]。小麥與玉米雜交必須保證花期相遇，常采用分期播種并配合適當(dāng)?shù)脑O(shè)施條件以及加強(qiáng)肥水管理等方法來調(diào)節(jié)花期，或利用夏季氣溫較低地區(qū)的繁殖以解決小麥與玉米花期不遇的問題。玉米花粉的新鮮度也影響得胚率，以開花第1天取得的玉米花粉對(duì)小麥?zhǔn)诜鄣门呗首罡?，此后逐漸降低[26]。玉米花粉授粉的小麥胚乳嚴(yán)重?cái)∮虍惓Ｍ嘶沟秒s種幼胚在生長(zhǎng)發(fā)育早期因胚乳營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足而夭亡，可應(yīng)用2,4-D處理授粉后的雜交穗或小花，促進(jìn)小麥子房發(fā)育膨大，直至能進(jìn)行離體培養(yǎng)。2,4-D的處理方法中以噴灑柱頭法得胚率高，其次為節(jié)間注射法，100 mg·L-1的2,4-D濃度得胚率最高[27]。

玉米授粉誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體胚還需進(jìn)行胚拯救，胚拯救成苗效率受胚齡、幼胚大小及培養(yǎng)條件的影響[28-29]，在授粉后12～16 d選擇0.5～1.0 mm的幼胚進(jìn)行離體培養(yǎng)可獲得更高的成苗率[30]。此外，幼胚離體培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體植株須經(jīng)加倍獲得純合的加倍單倍體，用秋水仙素溶液對(duì)具有2～3個(gè)分蘗的單倍體植株進(jìn)行浸根處理，并向其中加入20 mL·L-1的二甲基亞楓（DMSO）的處理效果更好[31]。

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院在玉米授粉培育加倍單倍體研究基礎(chǔ)上育成了抗赤霉病的小麥品種寧麥20。寧麥20是以矮稈、多穗、抗赤霉病新品系Y18為母本，與高產(chǎn)、中抗赤霉病、高抗小麥黃花葉病的生選4號(hào)為父本雜交，經(jīng)玉米雜交的染色體消失技術(shù)創(chuàng)制加倍單倍體，經(jīng)性狀鑒定篩選培育而成，于2012年通過江蘇省品種審定（圖3）。經(jīng)多年人工單花滴注接種鑒定和省區(qū)域試驗(yàn)指定單位鑒定，寧麥20赤霉病抗性達(dá)到“抗”級(jí)。2009—2011年江蘇省2年區(qū)域試驗(yàn)鑒定結(jié)果顯示，寧麥20赤霉病反應(yīng)級(jí)為0.95～1.2，抗病對(duì)照蘇麥3號(hào)為0.9～1.1[32]。

圖3 寧麥20選育過程Fig.3 Breeding process of Ningmai 20

3 幼胚培養(yǎng)快速成苗

促進(jìn)作物的發(fā)育進(jìn)程是加快作物育種速度、提高作物改良效率的重要方向。王海波等[33]提出利用“幼胚培養(yǎng)”省去種子發(fā)育時(shí)間，通過理化調(diào)控加快植株發(fā)育速度的作物快速發(fā)育技術(shù)。利用幼胚離體培養(yǎng)技術(shù)打破種子休眠，加快植株生長(zhǎng)，可實(shí)現(xiàn)一年多代的育種目標(biāo)，對(duì)于利用分子標(biāo)記輔助選擇轉(zhuǎn)移抗赤霉病QTL位點(diǎn)尤為重要。

3.1 幼胚培養(yǎng)快速成苗影響因素

胚齡是培養(yǎng)成苗的重要因素，小麥花后8～16 d的幼胚均能培養(yǎng)成苗，胚齡越大成苗率越高，以花后12～14 d的幼胚培養(yǎng)較好[34]。培養(yǎng)基及激素配比也影響幼胚成苗，以12 d胚齡的幼胚進(jìn)行培養(yǎng)，向培養(yǎng)基中添加0.1 mg·L-1萘乙酸（NAA）后幼胚成苗率、生根苗率、平均根長(zhǎng)、莖粗等性狀顯著高于其他濃度，且側(cè)根數(shù)量也多[34]，在培養(yǎng)基中添加2,4-D，生根率則隨著2,4-D濃度的增加而顯著降低。添加麥芽提取物可顯著促進(jìn)幼胚萌發(fā)和生長(zhǎng)，表現(xiàn)為成苗率高、根系生長(zhǎng)快、側(cè)根多、幼苗莖粗、植株高、單株根數(shù)多[34]。同時(shí)在培養(yǎng)基中添加0.5%麥芽提取物和0.1 mg·L-1的NAA時(shí)，除幼胚苗根長(zhǎng)高于單一使用麥芽提取物的處理外，其余性狀沒有顯著差異[35]。

3.2 幼胚培養(yǎng)結(jié)合標(biāo)記輔助選擇培育抗赤霉病小麥材料

以抗赤霉病小麥品種蘇麥3號(hào)為赤霉病抗性供體，感赤霉病小麥揚(yáng)麥15為輪回親本，采用幼胚離體培養(yǎng)和分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合將蘇麥3號(hào)的主效抗赤霉病QTL向揚(yáng)麥15轉(zhuǎn)移，提高后代材料的赤霉病抗性。對(duì)雜交或回交后代在苗期提取DNA進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，保留陽(yáng)性植株與揚(yáng)麥15進(jìn)行回交，授粉后12～14 d取麥穗剝出籽粒經(jīng)75%乙醇消毒30 s和0.1%氯化汞消毒10～15 min后，無菌水沖洗3～5次，在無菌條件下剝出幼胚，將幼胚尖端向下接種在培養(yǎng)基上，放入25℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，接種4 d后置于2～4℃條件下春化15 d，然后移栽至盆缽中生長(zhǎng)。利用生長(zhǎng)室和溫室，13個(gè)月內(nèi)完成了5代回交，接著在生長(zhǎng)室內(nèi)進(jìn)行自交，獲得了穩(wěn)定的育種材料。對(duì)親本材料揚(yáng)麥15、蘇麥3號(hào)以及回交高代材料進(jìn)行單花滴注接種鑒定，發(fā)現(xiàn)攜帶與蘇麥3號(hào)主效QTL連鎖分子標(biāo)記的BC5F4代植株病小穗率在16.72%～40.08%之間，而對(duì)照揚(yáng)麥15的病小穗率為48.75%[36]。

4 展望

植物細(xì)胞工程應(yīng)包括胚胎培養(yǎng)、加倍單倍體、體細(xì)胞無性系變異、原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交、組織培養(yǎng)快速繁殖、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及固定化細(xì)胞培養(yǎng)等[1]，本文著重總結(jié)了以抗小麥赤霉病育種為目標(biāo)在植物細(xì)胞工程技術(shù)方面的研究與應(yīng)用進(jìn)展。實(shí)踐表明，運(yùn)用體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)、加倍單倍體培育和幼胚快速成苗等細(xì)胞工程技術(shù)可增加遺傳變異范圍，提高常規(guī)育種效率，20多年來已經(jīng)育成了生抗1號(hào)、生抗2號(hào)、生選3號(hào)、生選4號(hào)、生選6號(hào)、寧麥20等小麥品種，分別通過國(guó)家或省小麥品種審定。育成品種的赤霉病抗性較供體或?qū)φ掌贩N均有所提高，其中生選6號(hào)和寧麥20在國(guó)家和省統(tǒng)一品種試驗(yàn)的病害抗性鑒定中表現(xiàn)為抗赤霉病[23,32]。

細(xì)胞工程技術(shù)在小麥育種中應(yīng)用也存在著一定局限性，比如，體細(xì)胞無性系突變的多方向性、遺傳穩(wěn)定性、部分基因型再生困難,以及在組織培養(yǎng)中的變異愈傷組織再生能力下降等都是該技術(shù)應(yīng)用于小麥育種所面臨的問題[37]。加倍單倍體培育是雜交后基因型快速純合的重要途徑，花藥或小孢子離體培養(yǎng)誘導(dǎo)階段受諸多因素影響，體外再生的優(yōu)化同樣復(fù)雜而困難，存在基因型依賴性和單倍體誘導(dǎo)率低等問題[38]。小麥與玉米雜交的染色體消失法避免了小麥基因型的限制，是目前在小麥育種中應(yīng)用較多的加倍單倍體培育方法[39]。近年發(fā)展起來的不依賴于離體培養(yǎng)的靶向著絲點(diǎn)操縱法（targeted centromere manipulation,CENH3），通過CENH3的靶向調(diào)控導(dǎo)致不同作物的紡錘體附著缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致單倍體誘導(dǎo)系的缺失，類似于玉米的誘導(dǎo)系，有可能在將來的育種中得到應(yīng)用[40]。

植物細(xì)胞工程是建立在現(xiàn)代生物科學(xué)和工程技術(shù)基礎(chǔ)上的技術(shù)，其發(fā)展有賴于植物學(xué)、植物生理學(xué)、遺傳育種學(xué)、基因組學(xué)、分子生物學(xué)、植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展與進(jìn)步。隨著學(xué)科的發(fā)展，植物細(xì)胞工程技術(shù)不限于植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)直接在育種上的應(yīng)用，而更多地在小麥赤霉病抗性遺傳機(jī)制和分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，利用細(xì)胞生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等研究成果，與分子標(biāo)記輔助選擇、遺傳轉(zhuǎn)化或基因組編輯等分子育種技術(shù)相結(jié)合，在分子水平上對(duì)小麥赤霉病抗性進(jìn)行遺傳改良[41-42]。