王 恒 李建喜 郭志廷 岳 聰 張 康 仇正英 張 凱 王 磊 王貴波 王學智 楊孝樸 張景艷*

(1.中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術研究中心，蘭州 730050；2.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070)

巨噬細胞在特異性免疫系統(tǒng)和非特異性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，具有“多面性”，與多種疾病的產生及防御有關。在外源性刺激時，巨噬細胞最先作出反應，對異源性物質進行吞噬、處理、加工以及遞呈，此過程伴隨電子的轉移，是氧化脅迫的主要來源，巨噬細胞是機體抗氧化與免疫調控相關機制研究中的一個重要工具細胞。

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)是革蘭氏陽性菌，主要存在小腸中。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.42%嗜酸乳桿菌(0.72×108CFU/g)可顯著促進斜帶石斑魚幼魚的生長，并提高其抗病力和腸道消化酶活性[7]。嗜酸乳桿菌S-層蛋白還可以提高小鼠巨噬細胞的吞噬活性，促進免疫信號分子NO的釋放，調節(jié)細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的表達水平[8]。嗜酸乳桿菌能使抗生素誘導的腸道菌群明顯恢復，可降低雛雞白痢的發(fā)病率并提高治愈率，增強雛雞對致病性大腸桿菌侵染的抵抗能力等[9-10]。然而有關嗜酸乳桿菌的抗氧化方面的研究尚未見報道。鑒于此，本研究通過比較嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物不同組分的抗氧化能力，評價其上清液對小鼠單核巨噬細胞(RAW 264.7細胞)NO含量、ROS水平和SOD、GSH-Px活性的影響以及對LPS誘導的氧化損傷的保護作用，旨在尋找嗜酸乳桿菌中抗氧化活性組分，并明確嗜酸乳桿菌抗氧化活性組分對巨噬細胞氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與細胞

嗜酸乳桿菌BNCC 185342購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司，RAW 264.7細胞購自上海晅科生物科技有限公司。

1.2 試驗試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、丁基化羥基甲苯(BHT)購自上海源葉生物科技有限公司；1,10-鄰二氮菲(1,10-phenanthroline)、吐溫20(Tween 20)、亞油酸、硫代巴比妥酸(TBA)購自北京索萊寶科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gicbo公司，GSH-Px、SOD、ROS試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，Griess試劑購自美國ThermoFisher公司，LPS(大腸桿菌O55∶B5)購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒購自上海澤塔生物科技有限公司。其他化學試劑均為國產分析純。

1.3 嗜酸乳桿菌復蘇及嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物不同組分制備

在37 ℃水浴鍋中迅速融解-80 ℃保存的嗜酸乳桿菌，接種于MRS營養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng)24 h，傳至2～3代，用于后續(xù)試驗。

參考Ragul等[4]的方法，并略作改動。將培養(yǎng)好的嗜酸乳桿菌調整細菌濃度為1×108CFU/mL，4 500×g離心10 min，收集上清液，用0.22 μm濾器過濾，得到無細胞的上清液；離心后的細胞顆粒用0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌3次，再懸浮在PBS中，調整細菌濃度為1×108CFU/mL，得到完整細胞；將細菌濃度為1×108CFU/mL的完整細胞置于超聲細胞破碎機中，并在冰浴條件下超聲(50%功率工作5 s、停頓5 s，共處理40 min，12 000×g離心10 min)除去細胞碎片，得到無細胞的胞內提取物。

1.4 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物不同組分清除自由基的效果比較

1.4.1 DPPH清除率

參考Lin等[11]的方法，并略作改動。取500 μL樣品與500 μL 0.1 mmol/L DPPH在1.5 mL離心管中混勻，放入30 ℃溫箱避光30 min，用抗壞血酸作陽性對照，各樣品組在517 nm吸光度值記為A樣品；對照組以500 μL無水乙醇代替DPPH溶液，在517 nm吸光度值記為A對照；空白組以500 μL PBS或MRS肉湯代替樣品溶液，在517 nm吸光度值記為A空白。用下式計算DPPH清除率：

DPPH清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/
A空白]×100。

1.4.2 羥自由基清除率

參考Zhang等[12]的方法，并略作改動。取0.5 mL 1,10-鄰二氮菲(1.875 mmol/L)、1 mL PBS(0.01 mmol/L，pH 7.4)和0.5 mL硫酸亞鐵(FeSO4，1.875 mmol/L)混勻，分別添加0.5 mL樣品和0.5 mL H2O2(0.1%)，混合后置37 ℃溫育1.5 h，測定536 nm吸光度值。用下式計算羥自由基清除率：

羥自由基清除率(%)=(As-An)/(Ab-An)×100。

式中：As為樣品和H2O2吸光度值；An為PBS/MRS肉湯和H2O2吸光度值；Ab為PBS/MRS肉湯和水吸光度值。

1.4.3 亞油酸清除率

參考Lin等[11]的方法，并略作改動。取0.1 mL亞油酸、0.2 mL Tween 20和19.7 mL去離子水混合，制備亞油酸乳液(20 mL)。將1 mL亞油酸乳液、0.5 mL PBS(0.01 mmol/L，pH 7.4)、0.2 mL FeSO4(0.01%)、0.2 mL H2O2(0.01%)和0.5 mL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物不同組分樣品混合，空白組用PBS或MRS肉湯代替樣品，37 ℃孵育12 h后。取2 mL反應溶液與0.2 mL三氯乙酸(TCA；4%)、2 mL TBA(0.8%)和0.2 mL丁基化羥基甲苯(BHT，0.4%)混合，100 ℃孵育30 min，冷卻后加入2 mL氯仿萃取。取200 μL上清液加入96孔板，測定532 nm吸光度值。用下式計算亞油酸清除率：

亞油酸清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100。

式中：A樣品為試驗樣品吸光度值；A空白為空白樣品吸光度值。

1.5 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞增殖、釋放NO及氧化水平的影響

1.5.1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞增殖的影響

將消化后的RAW 264.7細胞離心，調整細胞濃度為5×105CFU/mL，接種于96孔板，靜置12 h，棄上清液。對照組加入100 μL完全培養(yǎng)液(只含10% FBS)，試驗組每孔加入5、25、50、125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清(將原液用完全培養(yǎng)基稀釋10倍)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，用PBS清洗2遍，加入100 μL完全培養(yǎng)液和10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1.5 h，測定450 nm吸光度值，計算細胞活力。

1.5.2 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞釋放NO的影響

將消化后的RAW 264.7細胞離心，調整細胞濃度為1×106CFU/mL，接于6孔板，靜置12 h。對照組加入1 mL完全培養(yǎng)液，試驗組每孔加入5、25、50、125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液，并用完全培養(yǎng)液補足1 mL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，收集上清液，根據(jù)Griess試劑說明書測定上清液中NO含量。

1.5.3 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞氧化水平的影響

細胞處理同1.5.2，收集上清液，ROS水平及SOD、GSH-Px活性采用試劑盒測定，根據(jù)試劑盒說明書進行操作。

1.6 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對LPS誘導的RAW 264.7細胞氧化應激的影響

1.6.1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對LPS誘導的RAW 264.7細胞釋放NO的影響

將RAW 264.7細胞以1×106CFU/mL接于6孔板后，靜置12 h。對照組加入1 mL完全培養(yǎng)液，試驗組每孔加入25、125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液，用完全培養(yǎng)液補足1 mL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，棄上清液，加入0.5 μg/mL LPS孵育24 h，以0.5 μg/mL LPS孵育24 h作為陽性對照(LPS組)，收集上清液，根據(jù)Griess試劑說明書測定上清液中NO含量。

1.6.2 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對LPS誘導的RAW 264.7細胞SOD和GSH-Px活性的影響

細胞處理同1.6.1，收集上清液，SOD和GSH-Px活性采用試劑盒測定，根據(jù)試劑盒說明書進行操作。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經Excel 2010整理后，采用GraphPad Prism 5軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時采用Tukey氏法進行多重比較，差異顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液、完整細胞及胞內提取物對DPPH、羥自由基和亞油酸清除率的影響

分別制備嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液、完整細胞及胞內提取物，比較它們對DPPH、羥自由基和亞油酸清除率的影響，結果見圖1?？箟难嵋约笆人崛闂U菌培養(yǎng)物上清液、完整細胞和胞內提取物的DPPH清除率(圖1-A)分別為96.63%、86.98%、16.24%和68.03%，羥自由基清除率(圖1-B)分別為54.03%、68.93%、33.61%和12.65%；嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液、完整細胞和胞內提取物的亞油酸清除率(圖1-C)分別為15.21%、4.82%和6.75%。嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液的DPPH、羥自由基和亞油酸清除率均顯著高于嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物完整細胞和胞內提取物(P<0.05)。因此，選用嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液作用于RAW 264.7細胞，探究嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞抗氧化的調節(jié)作用。

數(shù)據(jù)柱標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞增殖的影響

由圖2可知，隨著嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液劑量增大，RAW 264.7細胞的細胞活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與對照組相比，25、50和125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液顯著提高了RAW 264.7細胞的細胞活力(P<0.05)。

圖2 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞增殖的影響 Fig.2 Effects of Lactobacillus acidophilus culturesupernatant on proliferation of RAW 264.7 cells

2.3 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞中NO含量的影響

由圖3可知，隨著嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液劑量增大，RAW 264.7細胞中NO含量逐漸升高。與對照組相比，5、25和50 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液提高了RAW 264.7細胞中NO含量，但無顯著差異(P>0.05)；125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液顯著提高了RAW 264.7細胞中NO含量(P<0.05)。

圖3 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞中NO含量的影響 Fig.3 Effects of Lactobacillus acidophilus culture supernatant on NO content of RAW 264.7 cells

2.4 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞中ROS水平的影響

由圖4可知，與對照組相比，5、25、50和125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞中ROS水平均無顯著影響(P<0.05)。與5、25 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液相比，125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液顯著提高了RAW 264.7細胞中ROS水平(P<0.05)。

2.5 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞中SOD和GSH-Px活性的影響

由圖5-A可知，與對照組相比，25和50 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液顯著提高了RAW 264.7細胞中SOD活性(P<0.05)，5和125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞中SOD活性無顯著影響(P>0.05)。

由圖5-B可知，與對照組相比，5、25和50 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞中GSH-Px活性無顯著影響(P>0.05)，125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液顯著降低了RAW 264.7細胞中GSH-Px活性(P<0.05)。

圖5 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞中SOD、GSH-Px活性影響Fig.5 Effects of Lactobacillus acidophilus culture supernatant on SOD and GSH-Px activities of RAW 264.7 cells

2.6 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對LPS誘導的RAW 264.7細胞中NO含量的影響

由圖6可知，與對照組相比，0.5 μg/mL LPS顯著提高了RAW 264.7細胞中NO含量(P<0.05)。與LPS組相比，25、125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液顯著降低了LPS誘導的RAW 264.7細胞中NO含量(P<0.05)。其中，125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液組RAW 264.7細胞中NO含量量顯著低于25 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液組(P<0.05)。

2.7 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對LPS誘導的RAW 264.7細胞中SOD、GSH-Px活性的影響

由圖7-A可知，與對照組相比，0.5 μg/mL LPS降低了RAW 264.7細胞中SOD活性，但差異不顯著(P>0.05)。與LPS組相比，25、125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液顯著提高了LPS誘導的RAW 264.7細胞中SOD活性(P<0.05)。其中，125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液組RAW 264.7細胞中SOD活性顯著低于25 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液組(P<0.05)，但25、125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物組均顯著高于對照組和LPS組(P<0.05)。

由圖7-B可知，與對照組相比，0.5 μg/mL LPS顯著降低了RAW 264.7細胞中GSH-Px活性(P<0.05)。與LPS組相比，25 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液顯著提高了LPS誘導的RAW 264.7細胞中GSH-Px活性(P<0.05)。

-：未添加 not added；+：添加 added。下圖同 The same as below.

圖7 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對LPS誘導的RAW 264.7細胞中SOD、GSH-Px活性的影響Fig.7 Effects of Lactobacillus acidophilus culture supernatant on SOD and GSH-Px activities of RAW 264.7 cells induced by LPS

3 討 論

3.1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物不同組分清除自由基的效果比較

氧化應激是自由基在體內產生的一種負面作用，被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素。益生菌的抗氧化功能可通過清除自由基的方式來減緩氧化應激反應，也可通過酶防御系統(tǒng)和非酶防御系統(tǒng)抵御ROS引起的氧化應激，調節(jié)機體氧化損傷[13]。據(jù)報道，植物乳桿菌[5]、干酪乳桿菌亞種casei SY13和保加利亞乳桿菌LJJ[12]對DPPH和羥自由基具有清除能力，長雙歧桿菌ATCC 15708和嗜酸乳桿菌ATCC 4356[11]對DPPH和亞油酸具有清除能力，嗜熱鏈球菌821和長雙歧桿菌15708[14]、干酪乳桿菌KCTC 3260[15]的完整細胞和胞內提取物均對羥自由基和亞油酸具有清除能力，鼠李糖乳桿菌[16]上清液也對DPPH具有清除能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液、完整細胞和胞內提取物對DPPH、羥自由基和亞油酸均具有清除能力，但清除能力不同；嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對DPPH、羥自由基和亞油酸清除能力高于嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物完整細胞和胞內提取物，嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物完整細胞對羥自由基清除能力高于嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物胞內提取物，而嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物胞內提取物對DPPH和亞油酸的清除能力高于嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物完整細胞，這種差異性與菌株的特定性質有關。

3.2 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞增殖、釋放NO及氧化水平的影響

巨噬細胞是機體天然免疫系統(tǒng)重要的免疫細胞，在外來物質刺激下，巨噬細胞活化、吞噬、溶解異物，維持機體內環(huán)境穩(wěn)定，是天然免疫和后天免疫的重要橋梁。研究表明，LPS通過激活誘導型一氧化氮合酶(iNOS)刺激巨噬細胞誘導氧化應激。維生素C可通過提高四氫生物喋呤的穩(wěn)定性來維持iNOS活性，從而保護巨噬細胞免受LPS誘導的氧化應激[17]。

本研究分別將5、25、50和125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液作用于RAW 264.7細胞，結果發(fā)現(xiàn)，5、25、50和125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞無毒性作用。而RAW 264.7細胞中NO含量與嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液具有劑量依賴性關系。研究表明，NO是脂溶性的，在生物膜中迅速擴散，可以調節(jié)自然殺傷細胞、中性粒細胞和肥大細胞的功能活動，并影響幾種細胞因子的產生，增強機體免疫系統(tǒng)功能[18-19]。本研究中，RAW 264.7細胞中NO含量上升可能與免疫系統(tǒng)有關，但還需進一步驗證。

ROS是各種自由基的總稱，其在體內積聚會導致炎癥等各種病理變化。本研究發(fā)現(xiàn)，5、25和50 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞中ROS水平無顯著影響，說明5、25和50 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液不會引起細胞內ROS紊亂。

SOD和GSH-Px是細胞內的抗氧化酶，可以防止氧化應激[20]。植物乳桿菌C88能提高D-半乳糖處理小鼠機體的SOD和GSH-Px活性[21]。發(fā)酵乳桿菌可通過提高抗氧化酶，包括肝臟SOD、GSH-Px和過氧化氫酶(CAT)活性來保持正常豬的健康生長[22]。丹參酮ⅡA明顯逆轉了顱腦外傷誘導的氧化應激和細胞凋亡，MDA含量減少，SOD和GSH-Px活性增加[23]。本研究也發(fā)現(xiàn)，25和50 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液可引起RAW 264.7細胞SOD活性升高，但對GSH-Px活性無顯著影響；當嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液劑量升高至125 μL時，可以顯著降低RAW 264.7細胞中SOD和GSH-Px活性。

綜上所述，與對照組相比，25和50 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液可促進RAW 264.7細胞增殖，升高RAW 264.7細胞中NO含量和SOD活性；與25 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液相比，50 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液有提高NO含量、ROS水平和SOD、GSH-Px活性趨勢，但無顯著差異，而125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液抑制了SOD和GSH-Px活性。因此，選用25和125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液作用于后續(xù)試驗。

3.3 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對LPS誘導的RAW 264.7細胞氧化應激的影響

乳酸桿菌是一種益生菌，在自然界中分布廣泛，具有物種多樣性。一些乳酸桿菌及其代謝產物對機體氧化應激具有較好的保護作用，是發(fā)揮其益生性的一個重要方面。研究表明，植物乳桿菌KSFY 06在體內外通過提高SOD和GSH-Px活性，降低NO含量保護LPS誘導的小鼠急性肝損傷[24]。原花青素通過抑制氧化應激，下調放射性心臟損傷小鼠的MDA含量，上調SOD、GSH-Px活性，抑制心臟損傷[25]。Wang等[26]使用大腸桿菌(Escherichiacoli)O141∶K99誘導斷奶犢牛氧化應激，β-葡聚糖能提高28日齡斷奶犢牛的抗氧化功能，降低EscherichiacoliO141∶K99感染后氧化應激的發(fā)生率。本研究利用0.5 μg/mL LPS 37 ℃處理RAW 264.7細胞24 h后，可成功引起RAW 264.7細胞中NO含量顯著升高。選用25和125 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液處理12 h后，再以LPS刺激RAW 264.7細胞24 h的作用方式，評價嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液對RAW 264.7細胞氧化應激的預防和保護作用，結果發(fā)現(xiàn)，25 μL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液可顯著升高RAW 264.7細胞中SOD和GSH-Px活性，降低NO含量。該結果表明嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液可同通過干預細胞SOD、GSH-Px活性，發(fā)揮對LPS誘導的RAW 264.7細胞氧化應激的保護作用。

4 結 論

① 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液、完整細胞和胞內提取物均具有清除DPPH、羥自由基和亞油酸的能力，其中嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物上清液的清除能力較強。

② 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)上清液對RAW 264.7細胞具有抗氧化作用，可通過降低NO含量，提高SOD、GSH-Px活性調節(jié)LPS誘導的RAW 264.7細胞的氧化應激。