王哲， 吳詩(shī)涵， 索金偉， 吳家勝

(浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

香榧是紅豆杉科榧樹(shù)屬雌雄異株的常綠喬木，是經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖選育出的產(chǎn)量高、風(fēng)味好的優(yōu)良栽培品種[1]。香榧屬于裸子植物門(mén)，沒(méi)有真正的果實(shí)，但由于其種實(shí)在形態(tài)上呈核果狀，一般將其劃為堅(jiān)果，稱(chēng)為種實(shí)。相對(duì)于其他的榧樹(shù)類(lèi)型，香榧種實(shí)的種仁(包含胚和胚乳)含有豐富的油脂、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，香脆可口，具有很高的保健、藥用和綜合開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[2-3]。香榧種實(shí)具有綠色肉質(zhì)假種皮，上有縱棱紋，外有白粉；種實(shí)呈長(zhǎng)圓形或橄欖形，基部有宿存的苞鱗和珠鱗，頂部有凸起的短尖頭。假種皮內(nèi)是骨質(zhì)種皮、紅色膜質(zhì)內(nèi)種皮(俗稱(chēng)種衣)，胚乳具有褶皺，呈乳白色至乳黃色[4]。

香榧種實(shí)發(fā)育成熟經(jīng)歷時(shí)間長(zhǎng)，從授粉到種實(shí)成熟需要跨年歷時(shí)17個(gè)月，當(dāng)年4月開(kāi)花授粉后至翌年9月采收前，樹(shù)上可同時(shí)看到大小2種種實(shí)(小的是當(dāng)年授粉的種實(shí)，大的是去年授粉的種實(shí))，即所謂“二代果”現(xiàn)象[5]。香榧種實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育大致可分為以下幾個(gè)時(shí)期：當(dāng)年4月中旬左右進(jìn)行開(kāi)花授粉，授粉后幼果包裹于苞鱗和珠鱗中，并于當(dāng)年9—10月完成受精，原胚形成[6-7]。此后，幼果一直包裹于苞鱗和珠鱗中越冬，體積沒(méi)有明顯增長(zhǎng)，外觀和質(zhì)量上幾無(wú)變化。直到翌年4月初，種實(shí)開(kāi)始啟動(dòng)細(xì)胞分裂和膨大，逐漸從種鱗中突破出來(lái)；5月初幼果開(kāi)始進(jìn)入旺盛的生長(zhǎng)期，含水率開(kāi)始上升，種實(shí)體積明顯增大，種實(shí)內(nèi)干物質(zhì)的積累也加快。在快速生長(zhǎng)初期，種仁(包含胚和胚乳)呈液體狀，到6月中旬種仁呈凝膠狀并逐漸硬化；7月初至9月初是種實(shí)內(nèi)部充實(shí)階段，此時(shí)種實(shí)的體積不再有明顯變化，淀粉逐漸降解，油脂含量不斷升高。9月初至秋分之間種實(shí)成熟，假種皮由綠色轉(zhuǎn)為黃綠色或淡黃色，有的假種皮開(kāi)裂，少量種實(shí)落地，此時(shí)便是采收時(shí)期[8]。人們長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)，香榧種實(shí)在發(fā)育初期會(huì)有大量種實(shí)無(wú)法突破種鱗而停止生長(zhǎng)，但仍宿存在結(jié)果枝上，這類(lèi)種實(shí)稱(chēng)為“僵果”。據(jù)調(diào)查，部分香榧林分僵果率高達(dá)95%，嚴(yán)重制約香榧產(chǎn)量，是當(dāng)前香榧產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵瓶頸因素，因此，對(duì)香榧僵果的研究十分重要。對(duì)于香榧僵果的調(diào)查和研究還未見(jiàn)報(bào)道，完善的觀察是研究香榧僵果發(fā)生原因、提高香榧產(chǎn)量的重要前提。對(duì)香榧僵果的調(diào)查和解剖學(xué)觀察可以為香榧種實(shí)發(fā)育研究提供參考，對(duì)促進(jìn)香榧產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

于浙江省杭州市臨安區(qū)浙江農(nóng)林大學(xué)香榧種植基地隨機(jī)選取5株長(zhǎng)勢(shì)良好的香榧作為觀測(cè)對(duì)象。試驗(yàn)地為土質(zhì)疏松、排水良好的山坡地，基地采用統(tǒng)一的田間施肥管理，3月中旬施入速效肥，9月中旬采果以后施用化肥和有機(jī)肥。

1.2 方法

1.2.1 香榧種實(shí)發(fā)育及僵果率調(diào)查

從2018年4月一年生枝上的營(yíng)養(yǎng)芽抽梢、混合芽開(kāi)花開(kāi)始到9月采收結(jié)束，每3～5 d觀察香榧種實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育變化，記錄僵果發(fā)生情況。

1.2.2 敗育香榧的組織切片觀察

采集授粉后一年生和二年生枝條上的香榧僵果各6對(duì)，按照常規(guī)石蠟制片法制片，觀察胚珠結(jié)構(gòu)。具體方法如下。

固定。將香榧種實(shí)浸沒(méi)于FAA固定液中固定24 h。

脫水。固定好的香榧材料取出后用70%乙醇稍加沖洗，再依次用50%、70%、85%、95%、100%濃度梯度的乙醇浸沒(méi)，100%乙醇重復(fù)2次，以完全置換掉組織內(nèi)的水分，每級(jí)1 h。

透明。將脫水的材料依次用不同比例的乙醇、二甲苯溶液(2∶3、1∶1、1∶2)浸沒(méi)，再用純二甲苯浸沒(méi)2次，每級(jí)1.5 h，使組織中乙醇完全被二甲苯替代從而透明。

浸蠟。將材料取出，轉(zhuǎn)入到帶刻度的50 mL離心管，從不同比例的二甲苯和石蠟的溶液逐步過(guò)渡到純蠟，使材料中的二甲苯完全被石蠟置換。

包埋。將熔化的純蠟倒入小紙盒中，將小紙盒置于冰水上，再將材料放入小紙盒，使用加熱過(guò)的鑷子調(diào)整材料位置，待小紙盒中的石蠟表面凝固后壓入水中冷卻。

修蠟。將蠟塊中材料周邊的蠟修整為長(zhǎng)方體，材料隱約可見(jiàn)。

切片。將材料置于Leica RM2235全自動(dòng)切片機(jī)蠟座上，切出蠟帶，切片厚度7～8 μm。

黏片。在干凈的載玻片上加入1%明膠1滴并涂勻，加入數(shù)滴展片劑(2%～4%甲醛溶液)，將材料截?cái)嗪笃街糜谳d玻片上，將載玻片置于42 ℃烤片機(jī)上烘烤，2 min后用吸水紙吸干水分，再烘烤2 min，裝入切片盒中。染色前烘箱37 ℃繼續(xù)烘烤1～2 d。

脫蠟。按100%二甲苯1→100%二甲苯2→1/2二甲苯+1/2乙醇→100%乙醇1→100%乙醇2→95%乙醇→85%乙醇→75%乙醇→50%乙醇→35%乙醇→蒸餾水的順序依次浸沒(méi)，每級(jí)5 min。

染色。采用番紅與固綠色法。番紅用1%的水溶液，固綠用0.5%的乙醇液，番紅染色時(shí)間2～4 h，固綠染色時(shí)間為20 s。

1.2.3 香榧僵果發(fā)生的位置效應(yīng)

隨機(jī)選取247根香榧一年生枝條，將枝條分為上、中、下3段，從最靠近主枝的對(duì)果位置開(kāi)始，依次編為1～11號(hào)，統(tǒng)計(jì)不同位置形成不同類(lèi)型對(duì)果的頻率，計(jì)數(shù)不同類(lèi)型對(duì)果數(shù)目。隨機(jī)選取香榧二年生枝條，按其在樹(shù)體上所處位置的高度分為上、下二類(lèi)枝條，按樹(shù)體朝向分為東、南、西、北四類(lèi)枝條，按僵果數(shù)與幼果總數(shù)之比統(tǒng)計(jì)僵果率。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧種實(shí)敗育的觀察

在香榧種實(shí)發(fā)育過(guò)程中，僵果始于授粉后翌年的4月下旬，在部分種實(shí)迅速膨大的同時(shí)，部分種實(shí)停止生長(zhǎng)，在體積上有明顯差異。僵果主要發(fā)生在種鱗裂開(kāi)時(shí)期和胚珠突破初期，有些僵果的種鱗不會(huì)裂開(kāi)，有些僵果的種鱗裂開(kāi)，但胚珠的高度不會(huì)超過(guò)種鱗。香榧僵果按照對(duì)果的數(shù)目可分為雙膨果、單僵果和雙僵果3類(lèi)，僵果數(shù)目依次為0、1、2，具體見(jiàn)圖1。

圖1 一年生枝條和二年生枝條上的雙僵果、單僵果和雙膨果

2.2 香榧雌花和種實(shí)發(fā)育階段敗育的組織觀察

如圖2所示，香榧僵果自4月初開(kāi)始，其幼果珠心組織萎縮，同時(shí)僵果細(xì)胞顯示出更多的紅色，表明木質(zhì)化程度更高。5月初正常發(fā)育種實(shí)的胚乳發(fā)育良好，體積增大，胚乳細(xì)胞豐富飽滿(mǎn)；而僵果無(wú)胚乳分化，萎蔫，內(nèi)部組織降解。

圖2 一年生枝條和二年生枝條上僵果結(jié)構(gòu)

2.3 香榧種實(shí)敗育的位置效應(yīng)

不同類(lèi)型對(duì)果在枝條上的分布如表1所示。在247根一年生枝條上，共有雙膨果158對(duì)，單僵果753對(duì)，雙僵果690對(duì)，比例分別是10%、47%、43%。在1號(hào)位置上，雙膨果、單僵果和雙僵果的數(shù)目依次為44、118、85，頻率依次為0.178、0.478、0.433。從每對(duì)果的位置來(lái)看，2號(hào)位置的雙膨果數(shù)目最少，雙僵果數(shù)目最多；從對(duì)果在枝條上的位置來(lái)看，枝條下端的雙僵果數(shù)目最多。

表1 一年生枝條上香榧不同類(lèi)型對(duì)果的分布情況

不同方位和不同單株二年生枝條上僵果率情況如表2所示，統(tǒng)計(jì)幼果總數(shù)5 571個(gè)，各方向至少統(tǒng)計(jì)1 200顆，平均僵果率為89%，朝南的僵果率最低，下方僵果率比上方低。

表2 不同方位二年生枝條上香榧僵果率

3 小結(jié)與討論

種實(shí)敗育是植物普遍存在的一種現(xiàn)象，導(dǎo)致敗育的因素包括授粉受精不良，營(yíng)養(yǎng)缺乏，環(huán)境脅迫等[9]。授粉期的珠心敗育是授粉不良導(dǎo)致的，目前通過(guò)人工授粉已經(jīng)可以顯著提高香榧授粉期的掛果數(shù)量[10]。香榧種實(shí)敗育(僵果)主要發(fā)生在幼果開(kāi)始膨大時(shí)，此時(shí)僵果率很高。本次觀察到的僵果率達(dá)89%，對(duì)香榧產(chǎn)量有很大影響，同時(shí)也表明香榧還有很大的增產(chǎn)空間。已有田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在香榧花期和幼果期噴施提高細(xì)胞活性的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能有效提高香榧產(chǎn)量[11]，但是幼果期具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)對(duì)香榧僵果發(fā)生的位置調(diào)查發(fā)現(xiàn)，位于枝條下端(基端)的對(duì)果容易發(fā)生雙僵果，上端的對(duì)果主要發(fā)生單個(gè)僵果；朝南方的僵果率最低，樹(shù)體下方僵果率比上方低，但總體上差異不顯著，位置效應(yīng)不明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，光照是氣候因子中影響香榧產(chǎn)量的主要因素[12]，同時(shí)光合同化物對(duì)于植物種實(shí)的正常發(fā)育至關(guān)重要[13]。因此，枝條下端(基端)對(duì)果雙僵果更多發(fā)生可能是由于遮擋導(dǎo)致的光照相對(duì)不足，朝南方向枝條上僵果率較低可能是朝南方向光照更充足所致。