生姜提取物對魷魚肌原纖維蛋白氧化的影響

劉鑫鑫，陳 彧，陳徐歡，王瑩瑩，霍健聰，繆文華

（浙江海洋大學食品與藥學學院 浙江舟山316022）

近年來，隨著遠洋魷釣的發(fā)展，魷魚產量在遠洋捕撈中所占的比重越來越大?！?018 中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》 數(shù)據(jù)顯示我國魷魚捕獲量達57.43 萬t，占全部遠洋捕撈產量的25.44%。然而，由于魷魚含水量高（70%～85%）、不飽和脂肪酸含量高、組織脆弱等原因，在生產加工過程中，其肌原纖維蛋白（Myofibrillar protein，MFP）容易被氧化。大量研究表明氧化會引起MFP 結構特性的改變，進而降低其功能特性[1-3]。針對氧化帶來的不利影響，常通過添加抗氧化劑以控制氧化反應。目前的抗氧化劑以合成抗氧化劑為主，因安全性問題而導致其使用一直備受質疑[4]。

利用天然多酚物質作為抗氧化劑以抑制蛋白質的氧化成為當前的研究熱點。大量研究發(fā)現(xiàn)多酚物質與蛋白質之間存在相互作用，在有些方面這種相互作用被認為是有利的，如多酚通過與MFP 相互作用提高了MFP 膜抗張強度[5-6]。然而，多酚物質與MFP 的相互作用對其抗氧化性的發(fā)揮是否有利，有待進一步的驗證。Sisse[7]在研究白葡萄提取物對氣調包裝下蛋白質和脂質的影響時發(fā)現(xiàn)，白葡萄提取物的添加加速了MFP 巰基的損失，并降低了肌球蛋白間的相互交聯(lián)。賈娜等[8]將不同濃度的沒食子酸添加到含MFP 的Fenton 氧化體系中，發(fā)現(xiàn)沒食子酸造成MFP 羰基、巰基和溶解度降低，對MFP 的二級結構也造成了影響。有研究者認為多酚物質的濃度決定其在對MFP的氧化過程中所扮演的是抗氧化還是促氧化角色[9]。

生姜提取物（GE）中含有多種酚類物質，其具有優(yōu)良的抗氧化特性[10]。本課題以從魷魚胴體中提取的MFP 為研究對象，按一定比例添加GE，然后利用Fenton 氧化體系，對MFP 進行不同程度氧化，分析羰基含量、總巰基含量、Ca2+-ATPase 活性、表面疏水性等指標的變化，并進行SDS-PAGE電泳，研究GE 對MFP 氧化的控制作用。這對于控制水產品生產加工過程中因蛋白質氧化而造成的功能特性下降具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗原料：試驗所用秘魯魷魚購于舟山國際水產城。

試驗試劑：乙二胺四乙酸、2，4-二硝基苯肼、5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）等均為AR 級，購于國藥化學試劑有限公司。SDS-PAGE 凝膠電泳試劑盒，購于上海碧云天生物技術有限公司；彩虹180 廣譜蛋白Marker（11-180KD），購于北京索萊寶科技有限公司；超微量Ca2+-ATPase 活性檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器與設備

751UVGD 型紫外-可見光分光光度計，上海第三分析儀器廠；DYY-8C 型電泳儀，北京市六一儀器廠；FJ200-SH 型數(shù)顯高速分散均質機，上海標本模型廠；CF-16RN 高速冷凍多用途離心機，日本日立公司；WD-9405B 型水平搖床，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 GE 的制備及其總酚含量的測定 取生姜洗凈，切成片狀于60 ℃烘干。烘干后的生姜用組織搗碎機磨成粉，過60 目篩得生姜粉。準確稱取生姜粉10 g 于250 mL 三角瓶中，按料液比1∶15（g∶mL）加入95%乙醇，25 ℃下超聲波（100 W）萃取15 min 后過濾。旋蒸除去濾液中的乙醇，剩余黃棕色浸膏狀物質即為GE。取GE 稀釋液0.5 mL，加入福林酚試劑1.0 mL，再加入5%碳酸鈉溶液15.0 mL，轉移至100 mL 棕色容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻后靜置2 h，在波長760 nm 處測定吸光度。同時以沒食子酸繪制標準工作曲線y=104.828x+0.04286，R=0.9993，經(jīng)測定樣品中總酚含量為10.97 mg/mL。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取 參照Bertram 等[11]的方法進行肌原纖維蛋白的提取。取經(jīng)過預處理的魷魚胴體肉，加3 倍體積A 液（0.1 mol/L KCl，0.02 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）和1 倍體積B 液（1% TritonX-100，0.1 mol/L KCl，0.02 mol/L Tris-HCl，pH 7.5），勻漿（8 000 r/min）90 s 后冷凍離心（10 000 r/min，15 min，4 ℃），取沉淀。重復以上步驟3 次。最后加入用4 倍體積A 液浸提，冷凍離心（10 000 r/min，15 min，4 ℃），最后取得的沉淀即為肌原纖維蛋白，考馬斯亮藍法測定其蛋白含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白的氧化方法和GE 的添加設計 試驗A（MFP 氧化方法）：固定體系中FeCl3和抗壞血酸鈉濃度，改變H2O2濃度，即0.1 mmol/L FeCl3和0.1 mmol/L 抗壞血酸，H2O2濃度分別選擇0，0.1，1，5，10 和20 mmol/L。將提取的肌原纖維蛋白溶于以上氧化體系中，使得蛋白質的最終質量濃度為20 mg/mL。試驗組分別添加1 mL 總酚質量濃度為0.2 mg/mL 的GE 溶液，而對照組則添加等量蒸餾水。然后將樣品在4 ℃下放置3 h，使肌原纖維蛋白發(fā)生不同程度的氧化，通過添加1 mL乙二胺四乙酸二鈉（1 mmol/L）來中止氧化反應。

試驗B（GE 添加設計）：固定體系中含0.1 mmol/L FeCl3和0.1 mmol/L 抗壞血酸，蛋白質質量濃度為20 mg/mL，H2O2濃度為50 mmol/L，各組添加1 mL 總酚質量濃度分別為0，0.1，0.2，0.5，1 mg/mL 的GE 溶液，對照組未添加H2O2和GE 溶液，其它操作同試驗A。

1.4 分析方法

1.4.1 羰基含量測定方法 參考Levine 等[12]的方法并做適當修改。取1 mL 蛋白溶液放入塑料離心管并加入1 mL 2，4-二硝基苯肼（DNPH）溶液（10 mol/L 含2 mol/L HCl），室溫條件下避光靜置1 h（每15 min 振蕩1 次），添加3 mL 20%的三氯乙酸（TCA）后10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用乙酸乙酯-乙醇（體積比1∶1）清洗沉淀至澄清，加入6 mol/L 鹽酸胍溶液0.5 mL，室溫下放置15 min 使沉淀溶解，然后10 000 r/min 離心3 min 去除不溶物。所得溶液于370 nm 波長下測定吸光度。使用分子吸光系數(shù)22 000 L/（mol·cm）計算每mg 蛋白中羰基含量。

1.4.2 總巰基含量的測定 參考Youngsawatdigul等[13]的方法并做適當修改。取1 mL 蛋白溶液于試管中并添加9 mL、50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，10mmol/L EDTA，8 mol/L 尿素，pH 7.0）。取5 mL 上述混合液加入0.5 mL 0.2 mmol/L 的DTNB 試劑（溶解在 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中，pH 7.0），25 ℃保溫25 min，于412 nm波長下測定吸光度。使用分子吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計算每mg 蛋白中總巰基的含量（nmol）。

1.4.3 Ca2+-ATPase 活性測定 取1 mL 蛋白溶液，經(jīng)10 000 r/min 離心5 min 后，倒去上清液并加入1 mL 0.6 mol/L 的KCl 溶液旋渦振蕩溶解。然后利用南京建成生物工程研究所的超微量Ca2+-ATPase 活性檢測試劑盒進行測定。

1.4.4 表面疏水性的測定 參考李艷青[14]的方法并做適當修改。取1 mL 蛋白溶液，經(jīng)10 000 r/min 離心5 min 后，倒去上清液并加入1 mL 20 mmol/L pH 6.0 的磷酸鹽溶液中，80 μL 的溴酚藍（BPB，1 mg/mL），混勻，室溫下攪拌10 min，然后10 000 r/min 離心15 min，取上清液（適當稀釋后）在595 nm 下測定吸收值A1。溴酚藍空白樣是用1 mL pH 6.0，20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液加入200 μL BPB，然后相同條件下測定吸光度A0，按下列公式計算表面疏水性：

1.4.5 SDS-PAGE 電泳 參考Laemmli[15]的方法并做適當修改。選用分離膠體積分數(shù)12%（含12%丙烯酰胺，SDS，1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl，過硫酸銨，TEMED），濃縮膠體積分數(shù)3.75%（含3.75%丙烯酰胺，SDS，1.5 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，過硫酸銨，TEMED），1L 電極緩沖含Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10 mL。電泳采用1 mm 凝膠板；上樣量為10 μL；開始電泳時電壓為80 V，待樣品進入分離膠后改為120 V；電泳結束后，取出膠片用考馬斯亮藍染色1 h（100 mL 染色液含有0.25 g 考馬斯亮藍R250，甲醇45 mL，冰醋酸10 mL），然后用甲醇/冰醋酸脫色液脫至透明（脫色液中含有5%的甲醇和7.5%的冰醋酸）。

1.5 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)均為3 次平行的平均值，結果表示為“平均數(shù)±標準差”。利用Microsoft Excel 軟件處理數(shù)據(jù)，OriginPro 8 軟件作圖以及SPSS Statistics 22 中的單因素方差分析進行顯著性分析，以P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 GE 對MFP 氧化時羰基含量的影響

羰基的形成（醛基和酮基）是蛋白質氧化后的一個顯著變化，被廣泛用于測量蛋白質的氧化程度[16]。如圖1a所示，與未氧化的蛋白相比，氧化的蛋白質羰基含量顯著增加，尤其是未添加GE 的組別。H2O2濃度為20 mmol/L 的組別與0 mmol/L的組別相比，其羰基含量增加了90.35%（P<0.05），而GE 在一定程度上抑制了MFP 羰基的形成，當H2O2濃度為20 mmol/L 時，添加GE 后，其羰基含量顯著下降了19.19%（P<0.05）。如圖1b所示，GE抑制羰基含量效果與濃度呈正相關，GE 添加量越大，則羰基含量越低。分別添加0.1，0.2，0.5，1 mg/mL 的GE 溶液后，其羰基含量分別降低了3.95%，9.21%，23.25%，30.26%（P<0.01），這可能與姜酚類物質所具備的酚羥基結構有關，通常認為酚類物質通過接收羥基自由基的方式[10]，避免了蛋白質側鏈被氧化修飾，從而抑制了蛋白羰基含量的增加。

圖1 GE 對MFP 羰基含量的影響Fig.1 The effect of GE on carbonyl content of MFP

2.2 GE 對MFP 氧化時總巰基含量的影響

MFP 的巰基極易與多酚物質發(fā)生交聯(lián)作用導致總巰基含量的降低[7-8]，因此通過MFP 總巰基含量的變化可直觀地了解氧化條件下GE 與MFP 的交聯(lián)程度。如圖2a所示，添加或未添加GE 的組別經(jīng)氧化后，MFP 均發(fā)生了顯著降低（P<0.05）。當H2O2濃度為0 mmol/L 時，添加GE 后蛋白總巰基降低了3.92%（P<0.05），Prodpran 等[5]在研究酚類物質對肌原纖維蛋白交聯(lián)性影響中發(fā)現(xiàn)了同樣的情況。而在氧化環(huán)境下，GE 進一步促進了蛋白總巰基含量的下降。當H2O2濃度分別為1，5，10，20 mmol/L 時，添加GE 后蛋白質總巰基含量分別降低了16.72%，23.87%，26.13%，14.81%（P<0.05）。類似的情況同樣在圖2b 中被觀察到，分別添加0.1，0.2，0.5，1 mg/mL 的GE 溶液后，與未添加GE的組別相比，其總巰基含量分別降低了2.36%，5.91%，26.63%，32.54%（P<0.01）。以上數(shù)據(jù)充分說明，GE 促進了總巰基含量的降低，且促進效果與GE 濃度呈正相關，即GE 濃度越高總巰基含量越低。相關研究發(fā)現(xiàn)多酚化合物與巰基之間存在相互作用，即在氧化條件下多酚化合物被氧化為相應的醌類物質，進而與巰基反應生成巰基-醌化合物[17-19]。Jongberg 等[20]認為巰基-醌化合物的生成不僅避免了巰基被氧化為二硫鍵，還提高了多酚物質的抗氧化活性。

圖2 GE 對MFP 總巰基含量的影響Fig.2 The effect of GE on total sulfhydryl content of MFP

2.3 GE 對MFP 氧化時Ca2+-ATPase 酶活性的影響

肌球蛋白頭部催化中心具有兩個活性巰基（-SH1和-SH2），其中-SH1負責Ca2+-ATPase 酶活性[21]。羥基自由基對這些基團的氧化修飾會導致肌球蛋白構象的改變，影響其與底物的相互作用，進而影響Ca2+-ATPase 酶活性[22]。通過Peason 相關性分析可知，兩者之間（圖2b，圖3b）相關系數(shù)為0.911，P=0.000，因此Ca2+-ATPase 酶活性變化與總巰基含量的變化之間有著極高的相關性。

如圖3a所示，各組MFP 的Ca2+-ATPase 的活性隨H2O2濃度的增加均發(fā)生了顯著下降（P<0.05）。未氧化MFP 的Ca2+-ATPase 的活性為2.45 U/mg，經(jīng)氧化后分別下降了34.73%（0.1 mmol/L），72.36%（1 mmol/L），90.18%（5 mmol/L），91.32%（10 mmol/L），95.64%（20 mmol/L）。當H2O2濃度為0.1 mmol/L 時，與未添加GE 的組別相比，添加GE 的MFP Ca2+-ATPase 活性相對下降了72.89%（P<0.05）。陳洪生等[23]在研究中同樣發(fā)現(xiàn)多酚類物質在氧化條件下加速Ca2+-ATPase 活性下降的情況。通過圖3b 我們可發(fā)現(xiàn)，在氧化條件下，高質量濃度GE（0.2，0.5，1 mg/mL）的添加抑制了Ca2+-ATPase 活性（P<0.05），而低質量濃度GE 的添加（0.1 mg/mL）未對酶活性造成顯著性影響（P>0.05）。巰基-醌化合物的生成雖然避免了巰基被氧化為二硫鍵，但仍然對肌球蛋白的Ca2+-ATPase 活性造成了顯著影響。

圖3 GE 對氧化MFP Ca2+-ATPase 活性的影響Fig.3 The effect of GE on Ca2+-ATPase activity of MFP

2.4 GE 對MFP 氧化時表面疏水性的影響

氧化導致蛋白質二級、三級結構發(fā)生改變，一些疏水基團從蛋白質內部暴露，致使表面疏水性的增加[11，16]。如圖4a所示，所有MFP 樣品的表面疏水性均隨H2O2濃度的增加而顯著增加。當H2O2濃度分別為10，20 mmol/L 時，添加GE 后其表面疏水性分別降低了7.18%，16.41%（P<0.05）。如圖4b所示，GE 抑制表面疏水性效果與GE 濃度呈正相關，即GE 添加量越大，則MFP 的表面疏水性越低。分別添加0.1，0.2，0.5，1 mg/mL 的GE 溶液后，其表面疏水性分別降低了8.29%，15.43%，25.49%和26.54%，以上數(shù)據(jù)說明GE 具有抑制氧化MFP表面疏水性增加的效果，且濃度越高抑制效果越好。GE 抑制MFP 表面疏水性的增加可能存在多種途徑：1）GE 通過清除羥基自由基，維持了MFP正常的空間構象；2）酚類物質與MFP 相結合，使得蛋白質分子表面極性增強[24]；3）GE 的添加造成蛋白的聚集從而抑制表面疏水性的增加[25]。

圖4 GE 對氧化MFP 表面疏水性影響Fig.4 The effect of GE on surface hydrophobicity of MFP

2.5 SDS-PAGE 電泳

不同分子質量條帶對應的蛋白質分別為：肌球蛋白重鏈（MHC，約200 ku），副肌球蛋白（PM，100～135 ku），肌動蛋白（Actin，35～48 ku），以及肌球蛋白輕鏈（MLC，11～17 ku）。蛋白質氧化的一個主要結果是通過共價鍵和非共價鍵的方式形成蛋白質聚合物[26-27]，導致一些蛋白分子堆積在分離膠頂部，甚至可能存在于濃縮膠中。如圖5a所示，MFP 經(jīng)20 mmol/L 的H2O2氧化3 h 后，產生部分分子質量大于200 ku 的蛋白聚合物（I），相同的情況可在圖5c 中觀察到（Ⅱ）。在添加GE 后，如圖5b、5c所示，氧化前后蛋白條帶并未發(fā)現(xiàn)顯著變化，同時添加不同濃度的GE 也未能對蛋白條帶產生顯著性影響（Ⅱ）。因此認為，蛋白與多酚類物質交聯(lián)形成的聚合物是可被還原的[8]。

圖5 GE 對氧化MFP SDS-PAGE 電泳圖譜影響Fig.5 The effect of GE on SDS-PAGE pattern of oxidized MFP

3 結論

GE 的添加具有抑制蛋白氧化的效果，表現(xiàn)在其抑制了羰基和表面疏水性的增加。同時，GE 與MFP 的活性巰基相互作用生成巰基-醌加成物，這極大地促進了總巰基含量的降低，但卻避免了活性巰基被氧化為二硫鍵。然而，巰基-醌化合物的生成不可避免地造成肌球蛋白Ca2+-ATPase 活性的下降。通過SDS-PAGE 電泳圖譜可知，GE 與MFP 之間的交聯(lián)是可被還原的。今后還需要深入研究酚類氧化產物與MFP 側鏈氨基酸交聯(lián)的具體位點與方式，同時不同的多酚物質對蛋白結構和功能性影響也有待進一步探索。