王 樂(lè)，馬丹丹，徐 盼，張 茜，崔 勇，葉放蕾

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳科 鄭州 450052 2)廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·廣東省人民醫(yī)院耳鼻咽喉科 廣州 510080

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是體外通過(guò)一定條件將成體細(xì)胞重新編程到多能干細(xì)胞狀態(tài)，具有胚胎干細(xì)胞相似的形態(tài)及增殖分化能力。人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)[1]完全克服了胚胎干細(xì)胞在臨床應(yīng)用時(shí)涉及的倫理及免疫排斥問(wèn)題，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，成為干細(xì)胞治療的主要細(xì)胞來(lái)源。目前hiPSC已逐漸被應(yīng)用到治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的研究[2-3]中，體外誘導(dǎo)hiPSC定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法各不相同，效率低。本研究擬應(yīng)用小分子化合物A8301和DMH1體外誘導(dǎo)hiPSC分化為神經(jīng)干細(xì)胞，為進(jìn)一步的細(xì)胞治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞系CF-1和hiPSC細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院。

1.2 主要試劑及儀器DMH1和A8301購(gòu)自R&D公司，兔抗人Nestin多克隆抗體和鼠抗人Pax6多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，bFGF、Trizol試劑、DMEM/F12培養(yǎng)基、N2、B27、matrigel膠、血清替代物和2.5 g/L胰蛋白酶等購(gòu)自Invitrogen公司，DMEM高糖培養(yǎng)基和GlutaMax等購(gòu)自Gibco公司；紫外分光光度計(jì)和離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡和倒置熒光顯微鏡為Zeiss公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基與實(shí)驗(yàn)分組各個(gè)階段應(yīng)用的培養(yǎng)基及其組成成分見(jiàn)表1。細(xì)胞根據(jù)懸浮階段所用培養(yǎng)基的不同分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。懸浮階段對(duì)照組用基礎(chǔ)的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組用加入小分子化合物A8301和DMH1的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩組貼壁階段均用維持神經(jīng)分化的貼壁培養(yǎng)基。

表1 各階段培養(yǎng)基組成成分

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

1.4.1HiPSC培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)前1 d 6孔板鋪基質(zhì)膠，30 min后每孔加入2×105個(gè)CF-1細(xì)胞及2 mL滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基。吸棄hiPSC原有培養(yǎng)基，加入F12，洗2遍；加入500 μL胰蛋白酶，37 ℃孵育，消化至克隆周邊卷起；吸棄培養(yǎng)基，F(xiàn)12洗2遍；加入1 mL KSR，用1 mL槍頭輕輕刮下hiPSC細(xì)胞團(tuán)，平均分配到已經(jīng)鋪好滋養(yǎng)層細(xì)胞的6孔板中；每孔補(bǔ)加KSR到2 mL；搖勻，將6孔板緩慢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.4.2懸浮培養(yǎng)與類(lèi)胚體形成 吸棄hiPSC原有培養(yǎng)基，加入F12，洗2遍；加入500 μL胰蛋白酶，37 ℃孵育3 min；吸棄培養(yǎng)基，F(xiàn)12洗2遍；添加適量F12，用1 mL槍頭吹打細(xì)胞團(tuán)，使其脫落；用無(wú)菌移液管轉(zhuǎn)移細(xì)胞團(tuán)至15 mL離心管，自然沉淀；棄上清，添加懸浮培養(yǎng)基2 mL，重懸；轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆團(tuán)至低黏附培養(yǎng)瓶中；于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜；次日更換培養(yǎng)瓶。

1.4.3貼壁培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)第9天，6孔板中每孔加入200 μL matrigel膠鋪勻，鋪設(shè)范圍距離孔邊0.5 cm，置37 ℃培養(yǎng)箱中30 min；吸棄matrigel膠；將懸浮狀態(tài)下的類(lèi)胚體移至15 mL離心管中，自然沉降；棄上清，貼壁培養(yǎng)基重懸類(lèi)胚體；每孔均勻分配20～30個(gè)類(lèi)胚體，滴加300 μL貼壁培養(yǎng)基，勿超出matrigel膠覆蓋的范圍；次日補(bǔ)加2 mL貼壁培養(yǎng)基。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Pax6和Nestin mRNA的表達(dá)收集貼壁培養(yǎng)第12天時(shí)的各孔細(xì)胞，嚴(yán)格按照RNA抽提試劑盒說(shuō)明提取總RNA。Pax6和Nestin引物見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性93 ℃ 2 min，然后93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 1 min延伸。以actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物序列

1.6 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞Pax6及Nestin蛋白的表達(dá)吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗，500 mL 40 g/L多聚甲醛固定5 min；500 mL PBS清洗5 min，吸棄，重復(fù)3遍；添加Pax6及Nestin一抗(均稀釋1 000倍后使用)，孵育過(guò)夜；吸棄一抗，PBS洗3遍；添加二抗，常溫孵育1 h，PBS洗3遍；加DPAI至完全覆蓋細(xì)胞，常溫孵育10 min，PBS洗3遍；加入1 mL PBS，錫箔紙避光包裝，保存于4 ℃冰箱。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 23.0分析。兩組Pax6和Nestin mRNA表達(dá)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HiPSC和類(lèi)胚體的形態(tài)學(xué)觀察在滋養(yǎng)層細(xì)胞上可以觀察到未分化的hiPSC形成橢圓或圓形的細(xì)胞克隆團(tuán)，邊界清楚；克隆團(tuán)內(nèi)細(xì)胞核質(zhì)比大，橢圓形或圓形(圖1A)。懸浮培養(yǎng)第3 天，可見(jiàn)三維球形樣細(xì)胞團(tuán)即類(lèi)胚體(圖1B)。

2.2 神經(jīng)花環(huán)的形成實(shí)驗(yàn)組類(lèi)胚體進(jìn)入貼壁培養(yǎng)階段后，可進(jìn)一步分化形成花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，即神經(jīng)花環(huán)(圖1C)；而對(duì)照組神經(jīng)花環(huán)形成較少(圖1D)。

A：未分化階段的hiPSC(×50)；B：懸浮階段形成的類(lèi)胚體(×50)；C：實(shí)驗(yàn)組貼壁階段形成的神經(jīng)花環(huán)(×100)；D：對(duì)照組貼壁階段細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.3 細(xì)胞中Pax6和Nestin表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Pax6和Nestin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(2.75±0.26)和(3.052±0.344)，均高于對(duì)照組的(0.97±0.18)和(1.018±0.131)(t=5.622和5.530，P<0.001)；免疫熒光染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

A：細(xì)胞核DAPI染色后呈藍(lán)色熒光；B：Pax6染色后呈紅色熒光；C：Nestin染色后呈綠色熒光；D：DAPI、Pax6和Nestin共染

3 討論

HiPSC的產(chǎn)生解決了胚胎干細(xì)胞帶來(lái)的倫理及免疫排斥問(wèn)題，已被廣泛應(yīng)用到各種疾病如心肌病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的研究[4-6]中；其治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病被認(rèn)為是最具前景的方法[7-8]，但到目前為止，仍然未找到一種誘導(dǎo)hiPSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的高效方案。傳統(tǒng)的關(guān)于干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法有以下幾種。①視黃酸誘導(dǎo)：視黃酸是一種經(jīng)典的神經(jīng)誘導(dǎo)劑[9]，能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞，但因視黃酸加入培養(yǎng)基后活性不穩(wěn)定而使誘導(dǎo)效率低。②共培養(yǎng)法，可分為基質(zhì)共培養(yǎng)和條件共培養(yǎng)，但共培養(yǎng)基成分復(fù)雜，不利于進(jìn)行機(jī)制研究[10]。本研究采用無(wú)血清培養(yǎng)法，培養(yǎng)基由成分確定的生長(zhǎng)因子及蛋白組成，不含成分不明的血清[11]，利于進(jìn)行基礎(chǔ)研究。

在體外懸浮培養(yǎng)時(shí)，多能干細(xì)胞形成三維球形樣細(xì)胞聚集，這些聚集而成的細(xì)胞團(tuán)叫作類(lèi)胚體。類(lèi)胚體有胚胎發(fā)育的所有標(biāo)記，是干細(xì)胞分化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，調(diào)控類(lèi)胚體的分化可有效控制干細(xì)胞的分化方向[12]。類(lèi)胚體制作方法有懸滴法、應(yīng)用低吸附培養(yǎng)板培養(yǎng)等[13]，這些方法操作復(fù)雜，成本較高。本研究首先使hiPSC在沒(méi)有分裂能力的滋養(yǎng)層細(xì)胞上生長(zhǎng)，形成細(xì)胞克隆團(tuán)；其次通過(guò)懸浮培養(yǎng)使細(xì)胞克隆團(tuán)形成類(lèi)胚體；然后貼壁培養(yǎng)促使類(lèi)胚體內(nèi)細(xì)胞分化形成神經(jīng)花環(huán)。神經(jīng)花環(huán)由表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記的細(xì)胞構(gòu)成，并能在一定條件下分化為各種神經(jīng)細(xì)胞[14]。本研究觀察到神經(jīng)花環(huán)在培養(yǎng)12 d時(shí)形成的最多，這也與正常人類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)管形成所需2周的時(shí)間一致[15]。

類(lèi)胚體具有胚胎發(fā)育的所有標(biāo)記，可分化成內(nèi)胚層、中胚層及外胚層細(xì)胞，而在類(lèi)胚體的形成過(guò)程中加入原條細(xì)胞抑制劑可以減少內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞的形成。原條細(xì)胞的形成依賴(lài)于活化的BMP和TGF-β等信號(hào)通路[16]。很多研究[17]在形成類(lèi)胚體階段通過(guò)添加TGF-β和BMP信號(hào)通路抑制劑，抑制胚胎干細(xì)胞向中胚層和內(nèi)胚層分化，同時(shí)應(yīng)用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子促使神經(jīng)干細(xì)胞增殖。但既往應(yīng)用的抑制劑多為蛋白質(zhì),活性不穩(wěn)定。小分子化合物作為高效穩(wěn)定抑制劑，已被廣泛應(yīng)用到干細(xì)胞領(lǐng)域[18-19]；小分子化合物A8301可以選擇性抑制TGF-βⅠ型受體激酶ALK5[19]；小分子化合物DMH1是BMP信號(hào)通路ALK2受體的選擇性抑制劑[18]。Pax6和Nestin為神經(jīng)元前體細(xì)胞的特征性標(biāo)記。本研究聯(lián)合應(yīng)用小分子化合物A8301和DMH1抑制TGF-β和BMP信號(hào)通路，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組Pax6和Nestin表達(dá)增高，提示A8301和DMH1可阻滯干細(xì)胞向內(nèi)胚層及中胚層分化，從而更有利于hiPSC定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞。

綜上，hiPSC可經(jīng)過(guò)體外懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)形成富含神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)花環(huán)，同時(shí)小分子化合物A8301和DMH1可有效地促進(jìn)hiPSC分化為神經(jīng)干細(xì)胞。