崔 健，李婧靜，李飛翔，李樹強，朱洪山，朱 寧，聞 君，劉偉利，陳艷艷，吳 睿

鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)康復科 鄭州 450014

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是世界范圍內(nèi)常見的神經(jīng)退行性疾病，已成為老年人癡呆最常見的病因之一[1]。AD起病隱匿，患者認知和記憶功能持續(xù)惡化，出現(xiàn)行為異常、人格改變及社會行為混亂[2]。該病通常呈進行性加重，患者逐漸喪失獨立生活的能力。AD的致死率和致殘率很高，給家庭和社會帶來了沉重的負擔[3]。雖然AD的診斷和治療已經(jīng)有了一定的進展，但其分子發(fā)病機制仍未闡明[4]。對其潛在機制的進一步研究，可以幫助人們更加深刻地了解AD，以促進有效治療策略的制定。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類在大腦中富集的特殊單鏈非編碼RNA[5]。circRNA具有共價閉合的連續(xù)環(huán)，無5’-3’極性以及poly(A)，可特異性吸附微小RNA(miRNA)，作為內(nèi)源分子海綿，調控miRNA的表達，發(fā)揮其獨特的生物學效應[6-7]。越來越多的證據(jù)表明，circRNA通過直接吸附miRNA，在包括AD在內(nèi)的許多疾病的發(fā)病中發(fā)揮特殊作用。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡參與了AD的發(fā)病過程。有研究[9]證實circRNA-7是miRNA-7分子海綿，調節(jié)散發(fā)性AD海馬大腦中UBE2A和EGFR的代謝過程。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)miR-214-3p在SAMP8小鼠腦組織顯著下降，與AD的發(fā)病機制有關，miR-214-3p對神經(jīng)元凋亡和自噬有抑制作用。該研究分析了AD患者血漿及人神經(jīng)母細胞瘤細胞中hsa_circ_0000880和miR-214-3p的表達,探討hsa_circ_0000880作為AD診斷的生物標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 病例選擇選取2018年5月至2019年5月在鄭州大學第二附屬醫(yī)院就診的AD患者28例(AD組)，年齡70～90(78.1±5.6)歲，男18例，女10例，診斷參照IWG-2[11]標準，排除急性心肌梗死、帕金森病、癌癥和多發(fā)性硬化者[12-14]。招募28名健康人作為正常對照(對照組)，年齡70～90(77.4±5.9)歲，男18名，女10名。經(jīng)常規(guī)檢查、實驗室檢查、影像學檢查、簡易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE)評分、蒙特利爾認知評估(MoCA)評分等，確定對照組的神經(jīng)功能正常[15]。高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高脂血癥均根據(jù)現(xiàn)行臨床標準[16-19]診斷。所有受試者均被告知受試目的并且簽署知情同意書。本試驗方案均經(jīng)鄭州大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 血漿hsa_circ_0000880和miR-214-3p水平的qRT-PCR檢測采集AD組及對照組受試者空腹8 h后的外周血2.5 mL，立即4 ℃條件下4 000×g離心15 min。分離后的血漿于-80 ℃保存。使用RNeasy mini kit(德國Qiagen公司)從血漿中提取總RNA。根據(jù)Circbank(http://www.circbank.cn/)獲得的circRNA序列并擴增引物，利用反轉錄酶M-MLV(日本TaKaRa公司)合成第一鏈cDNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix(日本TaKaRa公司)進行hsa_circ_0000880檢測。Hsa_circ_0000880上游引物序列5’-TCCGACAGAAAAGAGTGCGA-3’，下游引物序列5’-AATCCATAGCATCGAGCCCC-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物序列5’-GGCGATGCTG GCGCTGAGTAC-3’，下游引物序列5’- GAGGCTGT TGTCATACTTCTC-3’。反應體系共20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，上、下游引物及ROX Reference Dye Ⅱ各0.4 μL、DNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應條件：預變性95 ℃ 2 min；變性95 ℃ 30 s, 退火及延伸60 ℃，30 s，共40個循環(huán)。使用Hairpin-it MicroRNAs定量PCR試劑盒(上海Gene Pharma公司產(chǎn)品)進行miR-214-3p檢測。miR-214-3p上游引物序列5’-GCCGAGACAGCAGGCACA-3’，下游引物序列5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；內(nèi)參U6 上游引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應體系：2×Real-time PCR Buffer 10 μL,上、下游引物各0.3 μL，miRNA RT product 2 μL，Tag酶0.2 μL，加雙蒸餾水至20 μL。反應條件：預變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 12 s，退火/延伸58 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法分析hsa_circ_0000880和miR-214 -3p的相對表達水平。

1.3 細胞實驗

1.3.1細胞和主要試劑 人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y和293T細胞購自美國 Type Culture Collection。293T細胞使用含體積分數(shù)15%胎牛血清和青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，SH-SY5Y使用含體積分數(shù)15%胎牛血清及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均為37 ℃，體積分數(shù)5%CO2及體積分數(shù)95%相對濕度。Hsa_circ_0000880 siRNA(si-Circ)、對照siRNA(si-NC)、miR-214-3p mimic和對照miRNA(miR-NC)均購自中國上海GenePharma公司，雙熒光素酶報告實驗用載體pmirGLO和檢測系統(tǒng)購自Promega(北京)公司，Lipofectamine 3000 購自美國Invitrogen公司。

1.3.2雙熒光素酶報告實驗 應用PCR法擴增從AD患者血漿中提取的包含miR-214-3p結合位點的的野生型hsa_circ_0000880片段(Circbank數(shù)據(jù)庫預測)，并使用重疊擴增PCR法構建并擴增結合位點突變的突變型hsa_circ_0000880片段，然后將野生型或變異型hsa_circ_0000880分別克隆到pmirGLO載體得到pmirGLO-Wt-circ_0000880(Wt-circ_0000880)或pmirGLO-Mut-hsa_circ_0000880(Mut-circ_0000880)。根據(jù)說明書的方法使用Lipofectamine 3000 將載體和miR-214-3p mimic或miR-NC共轉染至293T細胞，孵育24 h后，進行熒光素酶活性檢測。

1.3.3抑制hsa_circ_0000880表達對SH-SY5Y細胞miR-214-3p表達的影響 SH-SY5Y細胞以每孔4×105個的密度接種于6孔板，分為si-Circ和si-NC組，每組設3個復孔，分別轉染相應siRNA。使用Lipofectamine 3000(Invitrogen公司產(chǎn)品)進行轉染，嚴格按照說明書操作。應用qRT-PCR法(同1.2)進行miR-214-3p表達的檢測。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0分析。兩組臨床特征和血漿hsa_circ_0000880水平、si-Circ和si-NC組SH-SY5Y細胞中miR-214-3p表達的比較采用兩獨立樣本t檢驗或χ2檢驗。采用ROC曲線評估hsa_circ_0000880對AD的診斷價值。AD患者血漿hsa_circ_0000880水平與MMSE、MoCA評分，miR-214-3p的相關關系采用Peason相關性分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩組臨床特征比較見表1。AD組MMSE和MoCA評分低于對照組。

表1 兩組的臨床特征比較

2.2 兩組血漿hsa_circ_0000880水平比較AD組血漿hsa_circ_0000880水平為(2.967±0.886)，較對照組(1.539±0.558)明顯升高(t=7.210，P=0.015)。

2.3 血漿hsa_circ_0000880對AD診斷的ROC曲線分析ROC曲線見圖1。AUC為0.886，95%CI為0.773～0.999，取截斷值為2.395時，其診斷的敏感度為73.7%，特異度為94.7%。

圖1 hsa_circ_0000880診斷AD的ROC曲線

2.4 AD患者血漿hsa_circ_0000880水平與MMSE、MoCA評分相關性AD患者血漿hsa_circ_0000880水平和MMSE、MoCA評分呈負相關(r=-0.646和-0.601,P<0.001)。

2.5 AD患者血漿miR-214-3p與hsa_circ_0000880水平的相關性AD患者血漿miR-214-3p水平為(0.551±0.192)，與hsa_circ_0000880水平呈負相關(r=-0.053,P=0.002)。

2.6 雙熒光素酶報告實驗結果見表2。

表2 雙熒光素酶報告實驗結果(n=5)

2.7 抑制hsa_circ_0000880表達對SH-SY5Y細胞miR-214-3p表達的影響si-Circ組細胞中miR-214-3p相對表達水平為(2.362±0.162)，較si-NC組(1.000±0.052)升高(t=17.909,P=0.048)。

3 討論

非編碼RNA因其獨特的生物學效應,可能與AD的病理機制(如淀粉樣蛋白沉著病、突觸缺失和神經(jīng)元凋亡)有關[5，20]。Feng等[21]在AD患者血漿中發(fā)現(xiàn)LncRNA BACE1水平升高，BACE1可能成為預測AD的潛在生物標志物。有研究[11]表明經(jīng)Aβ25～35蛋白誘導處理的SH-SY5Y細胞中miR-133b的表達下調，并且miR-133b可以作為特異性的生物標志用于AD的早期診斷，其敏感性高達90.8%。該研究結果顯示AD患者血漿hsa_circ_0000880水平明顯高于對照組。此外，hsa_circ_0000880診斷AD的ROC曲線的AUC為0.886，95%CI為0.773～0.999，截斷值為2.935時，其敏感度為73.7%，特異度為94.7%，提示hsa_circ_0000880在診斷AD方面可能具有較高的價值。

MMSE和MoCA評分一般用于各類認知障礙和癡呆的初步篩查[22]。臨床上通常聯(lián)合檢測兩者，可提高認知障礙的檢出率，提高認知篩查的準確性。一般來說，MMSE和MoCA得分越低，病情越嚴重[23]。該研究結果表明AD組患者血漿hsa_circ_0000880水平與MMSE/MoCA評分呈負相關，提示隨著AD病情的加重，血漿hsa_circ_0000880水平呈上升趨勢。

最近的研究表明circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡在AD發(fā)生發(fā)展過程的許多方面起著關鍵作用。最近的研究[9，24]表明，ciRS-7-miRNA-7-ube2a通路在海馬AD大腦組織中存在異常，表明了ciRS-7對miRNA-7的“海綿吸附作用”。Yang等[25]發(fā)現(xiàn)circ_0000950可以通過靶向調控miR-103，增加PTGS2的表達，從而抑制神經(jīng)元增殖，促進神經(jīng)元凋亡。Lu等[26]發(fā)現(xiàn)circHDAC9-miR-138-Sirt1在AD的認知損傷和病理過程中有潛在作用。本研究的雙熒光素酶報告實驗結果表明has_circ_0000880與miR-214-3p有靶向關系。基于以上發(fā)現(xiàn)，我們推測hsa_circ_0000880可能通過下調miR-214-3p的表達在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

綜上所述，AD患者血漿hsa_circ_0000880在水平升高，可能通過直接吸附miR-214-3p，參與AD的病理過程，hsa_circ_0000880可作為AD診斷的生物標志物。