劉 斌 劉 曄

1.靖邊縣中醫(yī)醫(yī)院(陜西 榆林 718500);2.靖邊縣人民醫(yī)院(陜西 榆林 718500)

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)腸癌發(fā)病率在全球居第3位,且呈逐年增高趨勢(shì)[1]。P53起初被認(rèn)為是致癌基因,隨著研究的深入,其抑癌功能陸續(xù)報(bào)道[2]。P53參與腫瘤的周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及抑制血管生成等過(guò)程[3]。中藥苦參堿(Matrine)除了具有抗心律失常、抗炎、抗病毒等作用外,還具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[4],但是苦參堿治療結(jié)腸癌相關(guān)研究報(bào)道較少,本研究通過(guò)使用苦參堿干預(yù)人結(jié)腸SW-480細(xì)胞,探究苦參堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制,為后續(xù)深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

一抗P53/E-Cad/Bax/β-actin購(gòu)自proteintech公司,二抗購(gòu)自中山金橋公司。蛋白提取試劑盒購(gòu)自凱基生物公司,CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物公司。Western Blot曝光儀購(gòu)自AZURE公司,酶標(biāo)儀購(gòu)自bio-rad公司。

2 方法

2.1CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定苦參堿對(duì)SW-480細(xì)胞的影響 將SW-480細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng),等到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),消化細(xì)胞接后種于96孔板內(nèi),生長(zhǎng)一段時(shí)間后加入含苦參堿細(xì)胞培養(yǎng)液,繼續(xù)在5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),棄掉原培養(yǎng)液加入不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,同時(shí)加入CCK-8檢測(cè)試劑,開(kāi)始測(cè)定吸光度值并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2Western blot檢測(cè)P53蛋白表達(dá)變化 將SW-480細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng),等到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),加入含苦參堿的細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)一段時(shí)間后收取細(xì)胞并提取蛋白。配置SDS-PAGE蛋白膠,加樣電泳結(jié)束后,開(kāi)始轉(zhuǎn)膜,條件為300mA 轉(zhuǎn)模30～50min,待封閉完成后分別放入一抗(P53/E-Cad/Bax/β-actin)中室溫孵2～4h,洗膜后放入二抗(1∶4000)中室溫孵育1～2h,洗膜后加入發(fā)光液采集圖像,保存數(shù)據(jù)。

2.3統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 19.0分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),使用GraphPad Prism5.0作圖。原始數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,同時(shí)滿足方差齊性,則使用t檢驗(yàn)或方差分析,P<0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1苦參堿對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖力的影響 使用不同濃度含苦參堿培養(yǎng)基干預(yù)SW-480細(xì)胞,結(jié)果如圖1所示,當(dāng)苦參堿濃度為3mg/mL時(shí),能夠較好的抑制SW-480細(xì)胞的增殖。

圖1 苦參堿干預(yù)SW-480細(xì)胞活力測(cè)定

3.2Western blot 檢測(cè)P53蛋白表達(dá)水平 結(jié)果如圖2所示,使用2/3/4mg/mL的苦參堿干預(yù)細(xì)胞后,提取蛋白通過(guò)Western blot 檢測(cè)P53、Bax、E-Cad蛋白表達(dá),結(jié)果MA組較CON組P53、Bax、E-Cad蛋白表達(dá)量明顯增高(P<0.05);MA2組較MA3組P53蛋白表達(dá)量明顯增高(P<0.05),MA4組較MA3組BAX/E-Cad蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。

圖2 苦參堿干預(yù)SW-480 P53蛋白表達(dá)水平CON:對(duì)照組,MA:苦參堿干預(yù)組

4 討論

近年來(lái)隨著人們生活水平提高以及生活方式的改變,結(jié)腸癌的發(fā)病率及致死率逐年增高,嚴(yán)重危險(xiǎn)到人類健康[5]。起初P53基因被認(rèn)為是一種致癌基因,隨著研究的深入P53抑癌功能逐漸被揭示[6]。P53基因是人類腫瘤相關(guān)性最高的基因,P53基因廣泛分布于核仁、線粒體等結(jié)構(gòu)中,參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及維持基因組穩(wěn)定等過(guò)程[7]。P53在不同組織中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制不盡相同,P53通常在Bcl-2家族的作用下通過(guò)線粒體調(diào)控凋亡。Bcl-2家族主要由抑制細(xì)胞凋亡蛋白和促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白組成,Bax基因是人體最主要的凋亡基因,是極重要的促細(xì)胞凋亡(Apoptosis)基因之一[8]。研究發(fā)現(xiàn) P53 作為轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平激活Bax的表達(dá),進(jìn)而引起細(xì)胞衰老,抑制腫瘤的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。單良[10]等研究報(bào)道明根皮素可通過(guò)激活ERK、P38通路增加P53、BAX蛋白表達(dá)水平,誘導(dǎo)人卵巢癌CAOV-3細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗癌作用。張蕾[11]等研究報(bào)道淫羊藿苷可顯著抑制小鼠CT26細(xì)胞結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng),其機(jī)制可能與上調(diào)p53和Bax蛋白,下調(diào)Bcl-2蛋白有關(guān)。

苦參堿(Matrine)是臨床上一種常用中藥,研究表明苦參堿可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,臨床上苦參堿對(duì)白血病、肝癌和胃癌都有較好的療效,同時(shí)由于其毒副作用小,故有可能發(fā)展成為很好的抗腫瘤藥物[12]。張偉等[13]研究了不同濃度苦參堿對(duì)人急性淋巴細(xì)胞白血病侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參堿能全面抑制白血病細(xì)胞的粘附能力、運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力。E-Cad通過(guò)相連的鏈蛋白使相鄰的癌細(xì)胞相連,維持細(xì)胞間的粘附,當(dāng)E-Cad表達(dá)降低,使其粘附性變小,發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。楊鵬等研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡,該藥理作用可能與苦參堿對(duì)Akt信號(hào)通路的抑制有關(guān)[15]。李金州等研究表明苦參堿可抑制結(jié)腸癌SW480和SW480/M5細(xì)胞的增殖,克隆形成和遷移侵襲能力,其機(jī)制可能與抑制AKT/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)[16]。

本研究使用中藥苦參堿干預(yù)人結(jié)腸細(xì)胞SW-480,通過(guò)CCK-8、Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖力及P53變化,以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移因子E-Cad的變化情況,研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠較好的抑制人結(jié)腸細(xì)胞SW-480的增殖力,使用苦參堿干預(yù)后,P53蛋白及其下游基因Bax表達(dá)量MA組較CON組升高,E-Cad表達(dá)量升高。

綜上所述,苦參堿可能通降低結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,達(dá)到抗腫瘤作用。