宮莉莉 呂 智

廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院(福建 廈門(mén) 361000)

肺癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高,是最致命的惡性腫瘤之一,5年生存率約為15%,每年約有160萬(wàn)人死于肺癌[1]。在我國(guó),肺癌發(fā)病例數(shù)位居癌癥發(fā)病的首位,每年約78.1萬(wàn)發(fā)病,尤其60歲以上老年患者的肺癌發(fā)病率更高,嚴(yán)重危害老年患者生命健康[2]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最為常見(jiàn)的類(lèi)型,約占所有肺癌病例的80-85%[3]。遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致的癌基因和抑癌基因表達(dá)異常與肺癌發(fā)生密切相關(guān)。研究表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色[4]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200nt,缺少開(kāi)放閱讀框,無(wú)法編碼蛋白質(zhì),但lncRNA 具有調(diào)控基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄過(guò)程,在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖及凋亡等方面發(fā)揮作用,可作為腫瘤抑制基因和癌基因發(fā)揮作用[5]。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 1(colon cancer associated transcript 1,CCAT1)首先在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn),在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高,且大多與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān),對(duì)腫瘤的診斷及預(yù)后判斷具有一定的意義[6]。本研究檢測(cè)老年非小細(xì)胞肺癌患者血漿中CCAT1的表達(dá),分析其與患者臨床特征的關(guān)系,為探討CCAT1作為早期預(yù)測(cè)及預(yù)后的標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 方法

1.1對(duì)象和分組 選取2018年1月至2020年1月在我院接受手術(shù)治療的老年非小細(xì)胞肺癌患者,共納入30例(NSCLS組,n=30),男性18例,女性12例,年齡60～85歲,平均(70.7±8.17)歲；腫瘤直徑:>3cm 11例,≤3cm 19例；TNM分期:Ⅰ期+Ⅱ期16例,Ⅲ期+Ⅳ期14例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床確診為NSCLC；(2)原發(fā)患者,手術(shù)前未進(jìn)行任何治療；(3)無(wú)其他并發(fā)癥。30例老年良性肺部疾病患者包括支氣管擴(kuò)張7例,間質(zhì)性肺炎15例,肺囊腫8例(對(duì)照組,n=30),男性16例,女性14例,年齡60～80歲,平均(67.5±6.15)歲,對(duì)兩組基礎(chǔ)資料進(jìn)行比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者知情同意研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書(shū)。

1.2材料和試劑 血清/血漿 microRNA 快速提取試劑盒、血清/血漿microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和microRNA熒光定量PCR試劑盒購(gòu)至北京百奧萊博科技股份有限公司。

1.3血漿樣品制備及miRNAs提取 患者空腹?fàn)顟B(tài),使用乙二胺四乙酸抗凝采血管采集各組患者外周靜脈血5mL,4℃靜置1h,3000rpm離心10min,收集上清液置于RNase-free離心管中,應(yīng)用microRNA快速提取試劑盒,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取血漿中的microRNA,向1.5mL EP管中加入800μL miRNA Reagent,再加入300μL血漿樣本,混勻后室溫放置5min,13000rpm離心5min,取上清約1mL吸入到新的2mL EP管中,加入1mL異丙醇,上下顛倒混合均勻。將上述溶液通過(guò)吸附柱中,13000rpm離心15s,倒掉過(guò)柱液。分別經(jīng)過(guò)異丙醇、無(wú)水乙醇洗滌,在吸附柱濾芯上加入30μL RNase-free水,13000rpm離心2min,洗脫產(chǎn)物即為提取的miRNAs。

1.4反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR 取RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄后取2ul cDNA 進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 50sec,95℃ 10sec,60℃ 30sec,40個(gè)循環(huán),采用 2-△△ct法進(jìn)行分析lncRNA CCAT1的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下:

lncRNA CCAT1 F:5′-TTGCTCACCTTACTGCCTGA-3′,

lncRNA CCAT1 R:5′-CTCATAAGGAGCGCACAACC-3′。

GAPDH F:5′-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3′,

GAPDH R:5′-GGACTCCACGACGTACTCA-3′。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CCAT1在非小細(xì)胞肺癌和良性肺部疾病中的表達(dá) 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)兩組患者外周血CCAT1的表達(dá),結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,NSCLC組患者外周血中CCAT1表達(dá)增高(P<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)兩組患者血漿中CCAT1的表達(dá)

2.2血漿CCAT1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征的關(guān)系 血漿CCAT1表達(dá)與NSCLC患者性別、吸煙史、病理類(lèi)型、組織分化程度、TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05),與腫瘤大小、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 血漿CCAT1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征的關(guān)系

3 討論

肺癌是全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題,臨床表現(xiàn)與原發(fā)灶位置和是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān),患者早期一般無(wú)典型癥狀,確診時(shí)通常已發(fā)展到中晚期。影像學(xué)篩查如胸部X線、CT、磁共振以及PET-CT都是臨床常用肺癌檢測(cè)手段,但由于其各自的局限性,都不適用于早期肺癌的篩查,確診不及時(shí)是肺癌高病死率的主要原因之一,我國(guó)肺癌患者五年生存率僅為18.7%[7],研究新的肺癌標(biāo)記物以及提高肺癌早期診斷率對(duì)提高其整體生存率至關(guān)重要。

近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和miRNAs在內(nèi)的非編碼RNA表達(dá)失調(diào)在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用,作為診斷和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物被廣泛研究[8]。lncRNA CCAT1定位于人類(lèi)8q24.21,轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為2628個(gè)核苷酸,其編碼序列位于原癌基因c-Myc增強(qiáng)子區(qū)域,可促進(jìn)癌細(xì)胞從細(xì)胞周期G1進(jìn)入S期[9]。研究顯示,CCAT1的過(guò)度表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌、胃癌等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展起促進(jìn)作用。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中,CCAT1高表達(dá),在肺癌細(xì)胞系中沉默CCAT1的表達(dá),細(xì)胞系的增殖和侵襲受到抑制,提示CCAT1在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮癌基因的作用,可能是肺癌治療的潛在靶點(diǎn)[10-11]。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)老年非小細(xì)胞肺癌和良性肺病患者兩組患者血漿中l(wèi)ncRNA CCAT1的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與良性肺病患者相比,lncRNA CCAT1在非小細(xì)胞肺癌患者血漿中表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；進(jìn)一步分析lncRNA CCAT1的表達(dá)及與患者臨床特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)lncRNA CCAT1表達(dá)與患者性別、TNM分期及分化程度無(wú)關(guān),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與腫瘤體積及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜述所述,lncRNA CCAT1在老年非小細(xì)胞肺癌患者血漿中高表達(dá),其表達(dá)水平與患者臨床病理特征關(guān)系密切,有可能是評(píng)估疾病嚴(yán)重程度潛在的分子標(biāo)志物。