河北中醫(yī)學(xué)院 河北省高校中藥配方顆粒應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心 河北省中藥配方顆粒技術(shù)創(chuàng)新中心

張 闖 李葆林 陳世雨 高 樂 田 偉 牛麗穎(石家莊 050091)

提要 目的：研究以不同廠家蛇床子配方顆粒為研究對象，采用“一測多評”(QAMS)法，為蛇床子配方顆粒質(zhì)量標準的制定提供依據(jù)。方法：以蛇床子素為內(nèi)參物，分別建立蛇床子配方顆粒中傘形花內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素的相對校正因子，并利用相對校正因子計算6種成分的含量。同時，采用QAMS和外標法(ESM)對不同廠家共16批蛇床子配方顆粒中上述7種香豆素類成分進行含量測定，驗證一測多評法的準確性、可行性和適用性。結(jié)果：本研究建立的QAMS法同時檢測不同廠家16批蛇床子配方顆粒中7種香豆素成分的含量與ESM法之間無顯著性差異，且相對校正因子重現(xiàn)性良好。結(jié)論：本研究建立的一測多評法可用于蛇床子配方顆粒的質(zhì)量控制。

蛇床子FructusCnidii為傘形科植物蛇床Cnidiummonnieri(L.) Cuss的干燥成熟果實，味苦性溫、歸腎經(jīng)，具有溫腎壯陽、殺蟲止癢、燥濕祛風(fēng)的功效[1-2]。蛇床子所含主要化學(xué)成分為蛇床子素等香豆素類化合物[3-4]。中藥配方顆粒因其即沖即服、易于攜帶等特點，臨床上應(yīng)用越來越普遍，其質(zhì)量控制逐漸成為中藥研究熱點之一[5-6]。本研究基于一測多評(QAMS)法，以價格較低、穩(wěn)定易得的蛇床子素為內(nèi)參物，建立蛇床子素與傘形花內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素的相對校正因子(f)，從而利用一種對照品(蛇床子素)計算出蛇床子配方顆粒中7種香豆素類成分含量[7-9]，并將此結(jié)果與外標法測得結(jié)果進行比較，驗證QAMS法在蛇床子配方顆粒質(zhì)量評價中的準確度及可行性，以期為蛇床子配方顆粒的多成分質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世科技有限公司)、Ultimate3000雙三元液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)、SPD-M20A高效液相色譜儀(日本島津公司)、電子天平(ME204E/02型，瑞士梅特勒-托利多公司)、Milli-Q超純水機(美國密理博公司)、KQ-250E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 實驗所用各對照品：傘形花內(nèi)酯(批號：J0222AS)與佛手柑內(nèi)酯(批號：J1026AS)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，花椒毒酚(批號：16090904)、花椒毒素(批號：151019)、異茴芹素(批號：16081803)、歐前胡素(批號：160511)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，蛇床子素(批號：110822-201308)購于中國食品藥品檢定研究院，各對照品質(zhì)量分數(shù)均≥98%，可供含量測定用色譜級甲醇(Fisher公司)，超純水為實驗室自制。蛇床子配方顆粒樣品購自省級醫(yī)院，蛇床子配方顆粒樣品信息見表1。

表1不同廠家蛇床子配方顆粒樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對照品溶液的制備：精密稱取傘形花內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素對照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度線，超聲溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為233.94 mg/L,115.75 mg/L,90.11 mg/L,152.47 mg/L,70.88 mg/L,547.39 mg/L,171.36 mg/L的單一對照品溶液。分別精密量取等體積上述對照品溶液，置同一量瓶中，配置成含傘形花內(nèi)酯33.42 mg/L，花椒毒酚16.54 mg/L，花椒毒素12.87 mg/L，異茴芹素21.78 mg/L，佛手柑內(nèi)酯 10.13 mg/L，歐前胡素78.20 mg/L，蛇床子素24.48 mg/L的混合對照品溶液，4 ℃冷藏備用。

2.1.2 供試品溶液的制備：精密稱取蛇床子配方顆粒(S1)0.1 g，倒入100 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇100 mL，稱重，超聲提取30 min，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻。濾紙過濾，濾液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A) - 0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min,5%～30%A；10～23 min,30%～40%A；23～35 min,40%～40%A；35～40 min,40%～50%A；25～38 min,90%～100%A； 38～45 min,100%A)；柱溫40 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測波長320 nm，進樣體積10 μL，混合對照品和供試品溶液HPLC圖，見圖1。

注：1.傘形花內(nèi)酯;2.花椒毒酚;3.花椒毒素;4.異茴芹素;5.佛手柑內(nèi)酯;6.歐前胡素;7.蛇床子素。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性范圍考察：將“2.1.1”項下制備的混合對照品溶液分別稀釋至標準品溶液濃度的1、2、4、8、16倍，按照“2.2”項下色譜條件依次進樣，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制各對照品的回歸方程，結(jié)果見表2。

表2蛇床子配方顆粒中7種香豆素類成分的線性關(guān)系考察結(jié)果 (μg/mL)

2.3.2 精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液，按照“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算得到傘形花內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素色譜峰的峰面積RSD分別為1.94%、2.17%、1.97%、2.16%、2.20%、2.51%、2.50%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一蛇床子配方顆粒供試品溶液(S1)，分別溶液配好后0、2、4、6、8、12、24、48 h，按照“2.2”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果1～7號峰的峰面積RSD分別為0.62%、1.20%、1.29%、1.57%、0.66%、0.78%、0.84%，表明蛇床子配方顆粒供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗：取同一批蛇床子配方顆粒6份，按方法與結(jié)果 “2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算蛇床子配方顆粒中傘形花內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素色譜峰的平均質(zhì)量分數(shù)，計算其RSD分別為0.33%、1.59%、0.93%、1.04%、0.59%、0.77%、0.67%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗：取重復(fù)性試驗同批蛇床子配方顆粒(S1)6份，每份約0.05 g，精密稱定，分別加入與蛇床子配方顆粒中7種香豆素類成分近似相等含量的對照品溶液，按照 “2.1.2”項下方法制備供試品溶液，“2.2”項下色譜條件進樣檢測，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，1～7號峰的加樣回收率分別為100.62%、101.19%、100.69%、100.41%、100.09%、100.27%、100.22%，RSD分別為1.31%、0.49%、1.02%、1.14%、1.10%、1.04%、0.50%，表明本方法準確度良好。

2.4 相對校正因子(fs/i)的建立 本實驗采用多點矯正法。根據(jù)公式fs/i=fs/fi=As×Ci/(Ai×Cs)計算QAMS的相對校正因子(fs/i)，式中fs/i為內(nèi)標物s對待測組分i的校正因子，As為內(nèi)標物s峰面積，Cs為內(nèi)標物s濃度，Ai為組分i峰面積，Ci為組分i濃度。以蛇床子素為內(nèi)參物(s)，根據(jù)公式分別計算蛇床子素對傘形花內(nèi)酯(A)、花椒毒酚(B)、花椒毒素(C)、異茴芹素(D)、佛手柑內(nèi)酯(E)和歐前胡素(F)的相對校正因子，結(jié)果見表3。同時，本研究還對不同高效液相色譜儀、不同色譜柱、不同進樣體積、不同色譜柱柱溫、不同流動相體積流量、不同檢測波長對fs/i的影響，結(jié)果表明這些因素對fs/i無影響。

表3 各組分的相對校正因子測定結(jié)果

2.5 待測成分的色譜峰定位 本部分通過計算在不同色譜儀和不同色譜柱中，蛇床子配方顆粒中各組分的色譜峰與蛇床子素色譜峰的相對保留時間(ts/i)，對供試品中7種香豆素組分色譜峰進行定位，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，不同儀器與色譜柱測得的ts/i的RSD分別為2.53%、1.81%、1.78%、1.50%、0.57%、0.62%，均小于3%，表明可以以ts/i對蛇床子配方顆粒中各組分的色譜峰定位。

表4不同儀器與色譜柱測得各成分相對保留時間

2.6 QAMS與外標法(ESM)測定結(jié)果的比較 取16批不同廠家生產(chǎn)的蛇床子配方顆粒，按照相同飲片量計算給藥劑量，制成供試品溶液。分別采用QAMS和外標法計算不同廠家16批蛇床子配方顆粒中1～7號峰的含量，每批3份，結(jié)果見表5。比較QAMS法與ESM測得的各組分含量，發(fā)現(xiàn)2種方法測得的蛇床子配方顆粒中7種組分含量基本一致，RSD小于3%，可認為建立的QAMS法可以替代ESM用于蛇床子配方顆粒中7種香豆素成分的含量測定。

表5 QAMS法與外標法測定16批蛇床子配方顆粒中7種香豆素類成分含量測定的結(jié)果 (mg/g)

3 討論

本研究考察了3種高效液相色譜儀和2種色譜柱對蛇床子配方顆粒中7種香豆素類成分分離的影 響，同時通過不同進樣體積、不通色譜柱柱溫、不同流動相流速、不同檢測波長，以及相對校正因子和相對保留時間的可靠性進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同儀器、不同色譜柱、不同柱溫、不同流速下的相對校正因子和相對保留時間的RSD均小于3.0%，說明該QAMS法的系統(tǒng)耐用性良好。

本實驗收集了6個廠家生產(chǎn)的16批蛇床子配方顆粒，根據(jù)常規(guī)的外標法和建立的一測多評的方法，分別對16批蛇床子配方顆粒進行含量測定和準確度分析，驗證了QAMS法的準確性和可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種含量測定的結(jié)果基本一致，無顯著性差異，說明本研究建立的QAMS法可用于蛇床子配方顆粒的質(zhì)量控制。從16批蛇床子配方顆粒含量測定結(jié)果來看，7種香豆素類成分中，花椒毒酚與蛇床子素含量最高，而傘形花內(nèi)酯和花椒毒素含量較低。

本研究建立的QAMS分析方法，在只有蛇床子素標準品的情況下，能夠利用相對校正因子同時測得蛇床子配方顆粒中7種成分的含量，降低了檢測成本，提高了檢測效率，對蛇床子配方顆粒評價標準的完善具有重要意義，也將有利于QAMS法在中藥質(zhì)量控制中的推廣。