李 敏，孫曉敏，趙二要，張 磊，董利利

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院 1.呼吸科；2.普內(nèi)一病區(qū)，河南 鄭州 450000)

肺炎支原體肺炎(Mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)是由肺炎支原體引起的肺部感染性疾病[1]。其中，難治性MPP(refractory MPP，RMPP)患兒病情危重，治療難度大，嚴(yán)重時可引發(fā)心肌損傷、消化系統(tǒng)損傷等多種肺外并發(fā)癥，對患兒的生命健康造成極大的威脅[2]。目前MPP的發(fā)病機制尚不明確，可能與免疫炎癥損傷、T淋巴細(xì)胞亞群Th1/Th2失衡有關(guān)?，F(xiàn)有研究[3-4]報道微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)參與調(diào)控免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及感染等多種生理過程，且與多種肺部疾病密切相關(guān)，因此推測miR-155可能也參與MPP的發(fā)生發(fā)展。但目前關(guān)于miR-155在MPP和RMPP中的研究報道尚不多見。因此，本研究擬通過檢測MPP患兒外周血中miR-155表達(dá)水平，探討miR-155在RMPP中的表達(dá)意義及與Th1/Th2平衡的相關(guān)性，為RMPP及RMPP合并肺外損傷的早期診斷及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2016年12月—2019年6月在河南省兒童醫(yī)院住院治療的MPP患兒病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒體征、癥狀、胸部X線片及支原體抗體檢測符合第8版《諸福棠實用兒科學(xué)》呼吸系統(tǒng)疾病中的MPP診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡<14歲；③入院前未進(jìn)行類固醇激素治療或大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療；④病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往患有支氣管哮喘、反復(fù)呼吸道感染、慢性肺疾病或重癥肺炎未痊愈者；②既往有先天性心臟病或腎、肝及神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病者；③細(xì)菌、病毒及衣原體等其他原因引起的肺部感染。所有患兒家屬均對本研究知情同意。

1.2 分組 患兒入院后接受標(biāo)準(zhǔn)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療，并根據(jù)RMPP標(biāo)準(zhǔn)[6](經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯抗生素正規(guī)治療7 d以上，臨床征象加重，仍持續(xù)發(fā)熱，肺部影像學(xué)顯示加重等)分為普通MPP組和RMPP組。再根據(jù)住院期間是否發(fā)生肺外損傷，將RMPP患兒分為肺外損傷組和無肺外損傷組。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料 統(tǒng)計患兒年齡、性別、熱程、熱峰等一般臨床資料。

1.3.2 實驗室指標(biāo) 患兒入院24 h內(nèi)采集外周靜脈血5 mL送檢驗科，①采用全自動五分類血液分析儀檢測白細(xì)胞計數(shù)(WBC)和中性粒細(xì)胞比例(N%)，采用Westergren法測定紅細(xì)胞沉降率(ESR)，采用免疫比濁法測定C反應(yīng)蛋白(CRP)，采用全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶(LDH)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。②采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定γ干擾素(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)水平，并計算IFN-γ/IL-4比值。③采用qRT-PCR檢測外周血漿中miR-155的表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參。

1.3.3 影像學(xué)檢查 對所有患兒進(jìn)行肺部CT或X線檢查，確定肺部病變情況，包括病變部位(雙側(cè)或單側(cè))及有無胸腔積液、肺實變等。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 2016年12月—2019年6月在河南省兒童醫(yī)院住院治療的MPP患兒共136例。普通MPP組80例，RMPP組56例；RMPP患兒中肺外損傷組25例，無肺外損傷組31例。

2.2 普通MPP與RMPP一般資料及實驗室指標(biāo)比較 兩組患兒一般資料及實驗室指標(biāo)比較結(jié)果顯示，RMPP組熱程、WBC、N%、ESR、CRP、LDH、AST、ALT、IFN-γ、IL-4、miR-155水平以及影像學(xué)胸腔積液、肺實變的發(fā)生比率均高于普通MPP組，IFN-γ/IL-4低于普通MPP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 普通MPP與RMPP組患兒一般臨床資料及實驗室指標(biāo)比較

2.3 RMPP患兒miR-155水平與Thl/Th2及炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示：RMPP患兒miR-155水平與IFN-γ/IL-4比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.307，P<0.05)，與ESR、CRP、WBC呈正相關(guān)(r值分別為0.273、0.409、0.322，均P<0.05)，與其他指標(biāo)無相關(guān)性(均P>0.05)。見表2和圖1。

圖1 RMPP患兒miR-155與Thl/Th2及炎癥指標(biāo)的相關(guān)性

表2 RMPP患兒miR-155與Thl/Th2及炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 RMPP患兒多因素logistic回歸分析 以患兒是否為RMPP為因變量，納入表1中有差異的指標(biāo)(熱程、WBC、N%、ESR、CRP、LDH、AST、ALT、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4、miR-155、影像學(xué)胸腔積液、肺實變，連續(xù)變量按照中位值轉(zhuǎn)化為二分類變量)為自變量，進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示熱程、CRP、LDH、IL-4、miR-155、胸腔積液及肺實變是RMPP的獨立危險因素(均P<0.05)。見表3。

表3 RMPP患兒多因素logistic回歸分析

2.5 miR-155對RMPP的診斷價值 采用ROC曲線分析miR-155對RMPP的診斷價值，結(jié)果顯示：miR-155診斷RMPP的曲線下面積(AUC)為0.742，尤登指數(shù)為0.411，最佳截斷值為1.2，特異度和靈敏度分別為78.57%、62.50%，提示miR-155對RMMP具有一定的診斷價值。見圖2。

圖2 miR-155鑒別普通MPP和RMPP的ROC曲線分析

2.6 RMPP患兒是否合并肺外損傷的一般及臨床資料對比 合并及非合并肺外損傷RMPP患兒的一般資料及實驗室指標(biāo)比較結(jié)果顯示，肺外損傷組患兒WBC、N%、ESR、CRP、IL-4、miR-155水平以及影像學(xué)肺實變的發(fā)生比例均高于無肺外損傷組患兒，IFN-γ/IL-4低于無肺外損傷組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表4。

表4 RMPP合并肺外損傷組與非合并肺外損傷組患兒資料比較

2.7 RMPP合并肺外損傷患兒miR-155水平與Thl/Th2及炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示：RMPP合并肺外損傷患兒miR-155水平與Thl/Th2及炎癥指標(biāo)無相關(guān)性(均P>0.05)。見表5。

表5 RMPP合并肺外損傷患兒miR-155與Thl/Th2及炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.8 RMPP合并肺外損傷患兒多因素logistic回歸分析 以RMPP患兒是否合并肺外損傷為因變量，納入表4中有差異的指標(biāo)(WBC、N%、ESR、CRP、IL-4、IFN-γ/IL-4、miR-155、肺實變，計量資料按照中位值轉(zhuǎn)化為二分類變量)為自變量，進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示N%、IL-4、miR-155是RMPP合并肺外損傷的獨立危險因素(均P<0.05)。見表6。

表6 RMPP合并肺外損傷患兒多因素logistic回歸分析

2.9 miR-155對RMPP肺外損傷的診斷價值 miR-155對RMPP肺外損傷診斷價值的ROC曲線分析結(jié)果顯示：miR-155診斷RMPP肺外損傷的AUC為0.724，尤登指數(shù)為0.470，最佳截點值為1.41，特異度和靈敏度分別為76.00%，70.97%，提示miR-155水平對RMMP肺外損傷具有一定提示意義。見圖3。

3 討論

目前MPP的發(fā)病機制尚不明確，但研究[7]均認(rèn)為免疫炎癥反應(yīng)及免疫失衡與MPP的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。近年研究[8]發(fā)現(xiàn)miRNA在調(diào)控多種疾病的免疫應(yīng)答反應(yīng)及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)上發(fā)揮重要的作用。miR-155是典型的多功能miRNA之一，可參與B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答過程，在CD4+、CD25+、Th1等T淋巴細(xì)胞的免疫抑制反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，參與肺炎的發(fā)生、發(fā)展。但目前關(guān)于不同類型肺炎的研究結(jié)果不一[9-10]。陸榮耀等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-155在反復(fù)肺炎嬰幼兒血清中高表達(dá)，是影響嬰幼兒反復(fù)肺炎發(fā)生的獨立危險因素。但Yang等[12]研究表明，miR-155在肺炎患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中低表達(dá)。張薇等[13]研究表明，miR-155在MPP患兒外周血中高表達(dá)。因此，關(guān)于miR-155與肺部感染性疾病中的水平仍需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示RMPP患兒外周血miR-155水平顯著高于普通MPP，且是RMPP的獨立危險因素，與大部分研究[14-15]結(jié)果一致。同時ROC曲線分析顯示miR-155對RMPP的診斷具有較高的靈敏度(62.50%)和特異度(78.57%)，提示miR-155對RMPP具有一定的診斷價值。

CD4+、CD25+及CD8+等T淋巴細(xì)胞在肺炎支原體感染后的免疫炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。其中，CD4+按其細(xì)胞因子和生物功能的不同可分Th1和Th2兩種，Th1分泌IFN-γ因子，而Th2細(xì)胞分泌IL-4因子，因此通常用IFN-γ/IL-4比值來代表機體Th1/Th2細(xì)胞優(yōu)勢狀態(tài)。正常條件下Th1/Th2細(xì)胞處于動態(tài)平衡，以維持機體正常的免疫功能。Th1/Th2的失衡與肺炎、肺結(jié)核及MPP等多種肺部炎癥疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[16-18]。現(xiàn)有研究[19-20]已證實不同類型不同病情的MPP患兒在Th1/Th2免疫應(yīng)答上存在差異。李菁等[21]研究發(fā)現(xiàn)高菌量MPP患兒BALF中IL-4水平和IL-4/IFN-γ明顯高于低菌量患兒，說明MPP患兒BALF中高菌量可誘導(dǎo)Th2免疫炎癥因子產(chǎn)生，導(dǎo)致Th1/Th2免疫偏移?？靛鹊萚22]研究發(fā)現(xiàn)重度MPP患兒BALF和血清中IL-4/IFN-γ比值均顯著高于支氣管異物患兒，說明嚴(yán)重MPP患兒中存在Th1/Th2失衡。本研究結(jié)果顯示，RMPP患兒IFN-γ、IL-4水平明顯高于普通MPP患兒，IFN-γ/IL-4明顯低于普通MPP患兒，提示Th1和Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)可能參與RMPP的發(fā)病過程，與現(xiàn)有研究結(jié)果基本一致。有證據(jù)顯示MPP患兒外周血miR-155水平與Th1/Th2、CD3+、CD8+等淋巴細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)，與炎癥因子呈正相關(guān)，推測miR-155對T淋巴細(xì)胞亞群的調(diào)控可能是其參與炎癥疾病的機制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)RMPP患兒中miR-155與Th1/Th2呈負(fù)相關(guān)，與CRP等炎癥指標(biāo)呈正相關(guān)，因此推測miR-155可能通過影響T淋巴細(xì)胞及炎癥因子水平影響細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)而參與RMPP的發(fā)病過程中。

國內(nèi)外研究[23]報道，50%以上的MPP患兒會合并肺外損傷，包括消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)損傷等，其中RMPP患兒肺外損傷發(fā)生率明顯高于普通MPP患兒。但目前關(guān)于RMPP合并肺外損傷的發(fā)病機制尚不明確，其可能與肺炎支原體直接作用、炎性介質(zhì)引起的自身免疫功能失調(diào)有關(guān)。近年來研究[24-25]表明miR-155與肺部疾病合并肺外損傷的發(fā)生有關(guān)，但miR-155在RMPP合并肺外損傷中的作用尚不清楚。因此本研究分析了RMPP合并和不合并肺外損傷患兒的miR-155水平，結(jié)果顯示，RMPP肺外損傷患兒miR-155水平明顯高于無肺外損傷組，且是RMPP合并肺外損傷的獨立危險因素，提示miR-155與RMPP合并肺外損傷的發(fā)生密切相關(guān)。同時ROC曲線分析顯示miR-155對RMPP合并肺外損傷的診斷具有較高的靈敏度(70.97%)和特異度(76.00%)。因此，miR-155可能成為RMPP早期治療和預(yù)防RMPP患兒肺外損傷發(fā)生的新的標(biāo)志物和潛在靶點。但本研究相關(guān)性分析顯示，肺外損傷患兒的miR-155水平與Th1/Th2指標(biāo)無相關(guān)性，推測miR-155可能不是通過Th1/Th2平衡參與肺外損傷的發(fā)生，其引起肺外損傷的機制仍需進(jìn)一步研究才能獲取確切結(jié)論。

綜上所述，本研究認(rèn)為miR-155在RMPP患兒外周血中高表達(dá)，與患兒Th1/Th2平衡密切相關(guān)，對RMPP診斷及合并肺外損傷的早期識別具有一定的預(yù)測價值。但本研究為小樣本單中心研究，應(yīng)用于臨床還有一定局限性，因此還需臨床工作者進(jìn)一步擴大樣本量進(jìn)行多中心研究。