貯藏時(shí)間及繅絲工藝對桑蠶蛹蛋白質(zhì)和脂肪酸組成及蛹油體外抗氧化活性的影響

吳寶祥，梁舒韻，朱立宏，江虹銳，劉小玲，姜 毅

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

蠶發(fā)育包括卵、幼蟲、蠶蛹及蠶蛾4 個(gè)階段，桑蠶蛹是鱗翅目蠶蛾科家蠶（Bombyx moriL.）的蛹，當(dāng)五齡幼蟲進(jìn)入熟蠶階段后停止進(jìn)食，熟蠶吐絲結(jié)繭后變態(tài)成蛹，該過程中，蠶貯藏了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以供蛹期發(fā)育[1-2]。我國年產(chǎn)桑繭約65萬 t，占世界總產(chǎn)繭量的70%以上，鮮蠶蛹年產(chǎn)量約50萬 t，是蠶業(yè)加工主要副產(chǎn)品之一[3]，通常被當(dāng)成廢棄物或作為價(jià)格低廉的飼料[4]。2004年，蠶蛹被我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)列入“作為普通食品管理的食品新資源名單”，其在食品工業(yè)上的開發(fā)應(yīng)用逐漸受到人們的重視[5-6]。蠶蛹油脂中的α-亞麻酸和蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸評(píng)分符合聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)蛋白模式值。近年來，我國鮮繭繅絲的蠶蛹主要以食品級(jí)蠶蛹形式出口日本、韓國，僅少數(shù)研究報(bào)道了將蠶蛹開發(fā)為蠶蛹罐頭[7]、蠶蛹蛋白飲料[8]，以及將蠶蛹粉添加至面食中提升面食的營養(yǎng)度[9]或作為高能量餅干的蛋白質(zhì)來源[10]。

蛋白質(zhì)、脂肪酸的生物活性對于開發(fā)蠶蛹功能性食品的價(jià)值有重要影響。Long Xingyao等[11]發(fā)現(xiàn)蠶蛹油對于鹽酸/乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍小鼠具有一定的保護(hù)作用。Hu Bin等[12]發(fā)現(xiàn)桑蠶蛹油的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率與蛹油中的總酚含量有關(guān)。Felix等[13]通過鐵離子還原能力法分析發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白濃縮物在pH 8.0時(shí)具有較高的抗氧化活性。目前，為提高蠶絲的品質(zhì)和蠶蛹的附加值，工業(yè)化的繅絲工藝已逐漸由傳統(tǒng)的干繭繅絲改進(jìn)為鮮繭繅絲。由于收繭具有季節(jié)性和批量大的特點(diǎn)，工廠將鮮繭收集后，需經(jīng)歷選繭、煮繭、繅絲等加工程序，而關(guān)于收繭繅絲過程中繭的貯藏時(shí)間、繅絲煮繭工藝對蛹蟲的營養(yǎng)價(jià)值及活性還鮮見報(bào)道。

本研究通過采集不同貯藏時(shí)間的桑蠶蛹和鮮繭繅絲后桑蠶蛹，分析貯藏時(shí)間和繅絲工藝對蛹的基本化學(xué)成分、脂肪酸組成、蛋白質(zhì)組成等的影響；并探討桑蠶蛹油的體外抗氧化活性。通過對比貯藏期桑蠶蛹與繅絲鮮蛹之間的營養(yǎng)組成的變化、蛹油體外抗氧化活性的差異，為桑蠶蛹功能活性產(chǎn)品工業(yè)的樣品采集提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘兩廣二號(hào)’桑蠶繭 廣西宜州茂源繭絲有限公司；繅絲蠶蛹 廣西壯歌絲綢有限公司。

DPPH、14%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氟化硼-甲醇溶液上海麥克林生化科技有限公司；α-生育酚、磷酸鹽緩沖液（0.15 mol/L、pH 7.0）、Folin-Ciocalteu試劑 北京索萊寶公司；BCA試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)公司；2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、正己烷（色譜級(jí)）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；正己烷、無水乙醇、甲醇、硫酸銨、無水碳酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉、過硫酸鉀均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B/5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 美國安捷倫公司；CR21N高速冷凍離心機(jī) 日本Hitach公司；Infinite M200 PRO光柵型多功能微孔板檢測儀 瑞士Tecan公司；UV1102II紫外-可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；PowerPac Basic電泳儀、Mini-Protean Tetra Cell電泳槽、CHEMIDOC XRS凝膠成像系統(tǒng)美國伯樂公司；FD-1D-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司；SH220F石墨消解儀、K9840自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器公司；SZF-06A粗脂肪測定儀上海新嘉電子有限公司；SX2-10-13箱式電阻爐 上海實(shí)研電爐有限公司；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、N100氮吹儀上海精密儀器儀表有限公司；EMS-40數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州愛華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑蠶蛹樣品的采集與形態(tài)觀察

取結(jié)繭6 d的蠶繭置于通風(fēng)條件良好的貯藏室中，于（22±1）℃的條件下避光貯藏。每天定時(shí)隨機(jī)采集繭樣品20 只，記錄質(zhì)量后破繭取蛹，對蠶蛹樣品進(jìn)行形態(tài)觀察并記錄質(zhì)量及體長。樣品按照蠶蛹發(fā)育過程中歷經(jīng)復(fù)眼未著色、復(fù)眼著黑色、觸角著色以及體軟皮皺呈土色4 個(gè)主要形態(tài)變化[14]分為不同貯藏階段，并記錄為階段I、階段II、階段III和階段IV。為減少組內(nèi)樣品間差異，采集時(shí)剔除死蛹以及與同時(shí)期蛹發(fā)育有顯著差異的樣品。將采集到的鮮繭蠶蛹、繅絲后的蠶蛹樣品于－20 ℃冰箱保存，一周內(nèi)完成分析。

1.3.2 基本化學(xué)成分分析

蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)依據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[15]中凱氏定氮法進(jìn)行檢測；脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)依據(jù)GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》[16]中索氏抽提法進(jìn)行檢測；灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)依據(jù)GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》[17]中第一法食品中總灰分的測定進(jìn)行檢測。

1.3.3 蠶蛹蛋白質(zhì)的提取

將采集到的貯藏階段蠶蛹、繅絲蠶蛹經(jīng)蒸餾水沖洗3 遍后，參考Chen Jianqing等[18]的方法稍作修改提取蛋白。取適量蠶蛹按質(zhì)量體積比1∶1加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液于4 ℃下以10 000 r/min均質(zhì)至無明顯大顆粒。勻漿液經(jīng)8 層紗布過濾蛹?xì)?，濾液于4 ℃、12 000 r/min下離心30 min，棄去油脂層，收集上清液，重復(fù)離心兩次，將合并收集的上清液加入硫酸銨至硫酸銨飽和度為70%，4 ℃靜置2 h后，經(jīng)5 000 r/min離心20 min，收集蛋白質(zhì)沉淀。將硫酸銨沉淀得到的蛋白質(zhì)復(fù)溶于磷酸鹽緩沖液，經(jīng)7 000 Da透析膜透析脫鹽，經(jīng)冷凍干燥后于4 ℃密封保存。樣品的蛋白質(zhì)量濃度使用BCA法[19]進(jìn)行測定。

1.3.4 蠶蛹油的提取

將1.3.1節(jié)中采集到的各貯藏階段蠶蛹及繅絲蠶蛹經(jīng)冷凍干燥后粉碎，經(jīng)100 目過篩后，于4 ℃下密封貯存?zhèn)溆?。蠶蛹油的提取參照魏兆軍等[20]的方法并稍作修改，將蠶蛹與正己烷以質(zhì)量體積比1∶8混合，經(jīng)38 ℃恒溫水浴攪拌2 h后，將混合液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清；沉淀以相同條件再次提取上清液，合并兩次提取獲得的上清液。使用氮吹儀將上清液中有機(jī)溶劑去除，獲得蠶蛹油，于4 ℃密封貯存。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

將1.3.3節(jié)獲得的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠和12%分離膠檢測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布，電泳條件：樣品上樣量10 μL，樣品蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，溴酚藍(lán)指示條帶位于濃縮膠時(shí)電壓為80 V，待指示條帶遷移至分離膠時(shí)電壓調(diào)整至120 V。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色30 min，使用脫色液脫色至背景清晰后使用凝膠成像儀拍照，使用Image Lab軟件分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。

1.3.6 蠶蛹油脂肪酸含量的測定

1.3.6.1 蠶蛹油的甲酯化

蠶蛹油的甲酯化參照路萍等[21]的方法。將3 mL 0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液加入0.10 g的蠶蛹油，于60 ℃水浴30 min后冷卻。將冷卻后的溶液加入14%三氟化硼-甲醇溶液2 mL，60 ℃水浴5 min，流動(dòng)水冷卻后再加入正己烷2 mL、飽和NaCl溶液2 mL，取上層溶劑層，加入無水Na2SO4脫水后，使用0.22 μm有機(jī)相針頭過濾器過濾甲酯化蠶蛹油至樣品瓶中，待測。

1.3.6.2 GC-MS分析條件

GC條件：使用DB-Wax毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃、載氣He、載氣流速1 mL/min、進(jìn)樣量1 μL、分流比50∶1；升溫程序：170 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至195 ℃，再以3 ℃/min升至230 ℃并保持3 min。

MS條件：電離方式為電子電離，質(zhì)譜傳輸線溫度260 ℃、離子源溫度230 ℃、MS四極桿溫度150 ℃、質(zhì)量掃描范圍m/z40～500、溶劑延遲時(shí)間2 min，監(jiān)測模式為全掃描模式。

1.3.6.3 GC-MS定性及定量分析

采用GC-MS全掃描模式分析得到蠶蛹油脂肪酸總離子流圖；使用安捷倫化學(xué)工作站的增強(qiáng)型數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)NIST 14.L質(zhì)譜庫對總離子流色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖進(jìn)行解析，根據(jù)質(zhì)譜庫中質(zhì)譜數(shù)據(jù)匹配度及脂肪酸甲酯質(zhì)譜斷裂規(guī)律進(jìn)行定性分析，飽和脂肪酸特征離子質(zhì)荷比m/z74，單不飽和脂肪酸m/z55，雙不飽和脂肪酸m/z67，多不飽和脂肪酸m/z79；通過安捷倫化學(xué)工作站的增強(qiáng)型數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算蠶蛹油中各脂肪酸組分的特征離子響應(yīng)值，通過面積歸一化法計(jì)算脂肪酸組分的相對含量。

1.3.7 油脂中總酚含量的測定

蠶蛹油中總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu比色法[22]。將2.5 mL正己烷加入0.120 g蠶蛹油中，漩渦振蕩溶解1 min，油相加入2.5 mL體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液后超聲萃取10 min，混合液經(jīng)10 000 r/min離心10 min。取2 mL甲醇溶液萃取相至10 mL容量瓶中，加入500 μL的Folin-Ciocalteul試劑，混勻1 min后加入2 mL 10% Na2CO3溶液，使用蒸餾水定容，于室溫下避光反應(yīng)1 h，于765 nm波長處測定吸光度。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Na2CO3溶液為對照組。配制100 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0、100、200、300、400、500、600 μL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（蒸餾水定溶至10 mL）對應(yīng)的吸光度得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程y＝0.009 2x＋0.034 6（R2＝0.994 5），蠶蛹油總酚含量以每千克蠶蛹油中所含沒食子酸質(zhì)量表示，單位為mg/kg。

1.3.8 DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的測定

使用無水乙醇將蠶蛹油分別配制成質(zhì)量濃度為10、20、30、50 mg/mL和70 mg/mL溶液。DPPH自由基清除率的測定參考Peixoto等[23]的方法。取2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH工作液與2 mL的樣品溶液混合，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度，DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。以α-生育酚為陽性對照組，無水乙醇為空白對照組。

式中：A1為蠶蛹油或α-生育酚組的吸光度；A0為空白對照組的吸光度。

ABTS陽離子自由基清除率測定參考Zhao Ling等[24]的方法并稍作修改。取50 μL樣品溶液與150 μL的ABTS工作液混合，25 ℃避光反應(yīng)20 min，在734 nm波長處測定吸光度，ABTS陽離子自由基清除率按式（2）計(jì)算。以α-生育酚為陽性對照組，無水乙醇為空白對照組。

式中：A1為樣品或α-生育酚與ABTS工作液的吸光度；A0為空白對照組的吸光度。

抗氧化活性結(jié)果以清除50%自由基所需的樣品質(zhì)量濃度——半抑制質(zhì)量濃度（median inhibition concentration，IC50）表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次重復(fù)。采用Image Lab軟件處理電泳圖像，Origin 2019軟件繪圖。通過SPSS 25.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方程分析-最小顯著性差異（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)，分析數(shù)據(jù)差異顯著性（以P＜0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期桑蠶蛹的形態(tài)變化

從結(jié)繭第6天起對蠶繭取樣，根據(jù)蠶蛹形態(tài)的變化，于結(jié)繭第8、11、12、13天收集蠶蛹，樣品采集時(shí)間分別記錄為貯藏期階段I、II、III和IV，各階段蠶蛹形態(tài)變化如圖1所示。

圖1 貯藏期中各階段蠶蛹形態(tài)變化Fig. 1 Change in morphology of silkworm pupa during storage

在貯藏階段I，蠶蛹表皮呈金黃色，復(fù)眼呈淡褐色（圖1A2）。階段II的蠶蛹復(fù)眼由淡褐色變?yōu)楹谏?，除?fù)眼外的其余形態(tài)特征與階段I無明顯差異（圖1B2）。階段III蠶蛹復(fù)眼著黑色，觸角呈現(xiàn)褐色，且肛門部位變?yōu)樯詈稚▓D1C2）。階段IV蠶蛹觸角的顏色變?yōu)樯詈稚?，表皮呈現(xiàn)出深土褐色（圖1D2）。階段IV的蠶繭繼續(xù)貯藏1～2 d，蠶蛹變態(tài)成蛾。蠶蛹在發(fā)育期間表皮逐漸變硬且顏色變深，與其體內(nèi)的漆酶和酪氨酸有關(guān)。蛹表皮中的酪氨酸是蠶蛹表皮鞣化過程中的色素前體物質(zhì)[25]，蠶結(jié)繭后蛹的皮膚會(huì)分泌酪氨酸的酚類衍生物，經(jīng)由漆酶作用后形成醌類物質(zhì)，表皮中的蛋白質(zhì)發(fā)生鞣化，使得蠶蛹的外表皮逐漸變硬、顏色變深，酪氨酸含量會(huì)隨著表皮顏色的變深急劇降低[26]。

本實(shí)驗(yàn)通過對不同階段蠶繭、蠶蛹的質(zhì)量以及蠶蛹的體長進(jìn)行記錄，發(fā)現(xiàn)在蠶蛹發(fā)育的過程中，蠶蛹以及蠶繭的質(zhì)量呈下降的趨勢（表1）。與階段III相比，階段IV蠶繭和蛹的質(zhì)量顯著降低了10.22%（P＜0.05），而各階段蛹的體長無顯著變化。從階段I～I(xiàn)V（羽化前），蛹體質(zhì)量下降，蛹體的顏色變深，這與其變態(tài)過程中機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)。

表1 蠶蛹貯藏期間蠶繭質(zhì)量、蠶蛹質(zhì)量及蠶蛹體長（n＝20）Table1 Silkworm cocoon mass, silkworm pupa mass and silkworm pupa body length during storage (n = 20)

2.2 貯藏期桑蠶蛹和繅絲蠶蛹的基本化學(xué)成分變化

4 個(gè)貯藏階段的蠶蛹以及繅絲蠶蛹的蛋白質(zhì)、脂肪和灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析結(jié)果如表2所示。階段II的蠶蛹蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于階段I（P＜0.05），貯藏階段III、IV蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著差異（P＞0.05）。蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值（protein/ glyceride，P/G）≥2的昆蟲為高蛋白昆蟲，而P/G＜2的昆蟲為高脂肪昆蟲[27]。本實(shí)驗(yàn)中，蠶蛹P/G在1～2之間，說明蠶蛹是一種高脂肪的食用昆蟲。隨著貯藏的時(shí)間延長，蠶蛹脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能是由于貯藏期蠶蛹的發(fā)育消耗體內(nèi)貯藏的脂肪?？壗z蠶蛹的蛋白質(zhì)和脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于階段I和階段II的鮮蛹之間，說明繅絲工藝對蠶蛹的蛋白質(zhì)和脂肪含量無顯著影響。蠶蛹屬于高脂肪昆蟲，可作為食品級(jí)昆蟲油脂的提取原料，貯藏時(shí)間會(huì)影響其基本化學(xué)成分含量。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對貯藏期桑蠶蛹、繅絲后蠶蛹進(jìn)行蛋白質(zhì)組成和油脂組成進(jìn)行分析，研究貯藏時(shí)間及繅絲工藝是否會(huì)對蠶蛹蛋白質(zhì)以及脂肪的組成有影響。

表2 不同貯藏階段的蠶蛹基本化學(xué)成分（n＝ 3）Table2 Proximate composition of silkworm pupa during storage (n = 3)

2.3 貯藏期桑蠶蛹和繅絲蠶蛹的蛋白質(zhì)變化

蠶蛹體內(nèi)蛋白質(zhì)在分子質(zhì)量30、70 kDa附近含量高，隨著貯藏時(shí)間延長呈下降趨勢，180 kDa附近的蛋白含量隨著貯藏時(shí)間延長不斷增加（圖2）。與階段I和II相比，階段III在70 kDa附近的蠶蛹蛋白含量顯著降低，40～50 kDa范圍出現(xiàn)了新的蛋白質(zhì)條帶。階段IV在70 kDa和30 kDa附近的蠶蛹蛋白含量均明顯下降。與貯藏期蠶蛹相比，繅絲蠶蛹30 kDa附近的蛋白質(zhì)含量相對較低，70 kDa附近的蛋白質(zhì)含量高，且在245 kDa附近出現(xiàn)新條帶。

圖2 貯藏期中不同貯藏階段蠶蛹蛋白的分子質(zhì)量分布Fig. 2 Molecular mass distribution of silkworm pupa proteins during storage

蠶蛹的蛋白質(zhì)表達(dá)與其生長發(fā)育有密切關(guān)系。桑蠶中30 kDa附近的蛋白質(zhì)主要存在于血淋巴中，屬于鱗翅目低密度脂蛋白家族，被稱為30K蛋白。30K蛋白由桑蠶幼蟲的外周脂肪體合成并以階段性依賴的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到血淋巴，最終以顆粒的形式貯藏在內(nèi)臟脂肪體中，為非進(jìn)食的蛹提供生長發(fā)育必要的營養(yǎng)物質(zhì)[28-30]。30K蛋白的抗細(xì)胞凋亡活性是目前的研究重點(diǎn)，于威等[31]利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶卵巢培養(yǎng)細(xì)胞（BmN）中表達(dá)3 種30K蛋白，發(fā)現(xiàn)30Kc6、30Kc12p和30Kc19G1 3 種30K蛋白對H2O2誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中，‘兩廣二號(hào)’桑蠶蛹30K蛋白含量隨著蠶繭貯藏時(shí)間的延長呈下降趨勢，可能與其基因表達(dá)的時(shí)間特異性有關(guān)。Hou Yong[30]和Sun Quan[32]等均發(fā)現(xiàn)‘p50’品系的桑蠶中30K蛋白水平在化蛹前增加，化蛹后表達(dá)量下降；李擎等[33]發(fā)現(xiàn)在‘菁松’ב皓月’品系桑蠶中30K蛋白基因在5齡期幼蟲中表達(dá)量最高，在蛹期表達(dá)量次之，到蛾期表達(dá)量下降，與本實(shí)驗(yàn)中30K蛋白含量變化趨勢一致。說明蠶蛹30K蛋白表達(dá)與蠶蛹發(fā)育有關(guān)，而與蠶蛹品系無關(guān)。

目前對蠶蛹的研究發(fā)現(xiàn)70 kDa附近蛋白主要是家蠶貯藏蛋白（storage protein，SP）和酚氧化酶。SP分為SP 1（分子質(zhì)量82 kDa）、SP 2（分子質(zhì)量72～76 kDa）和SP 3（分子質(zhì)量82.1 kDa）[34-36]。SP1屬于昆蟲血藍(lán)蛋白家族中的一種六聚體蛋白，是一種雌性家蠶特有蛋白，富含蛋氨酸[37]。蛋氨酸殘基能夠與機(jī)體內(nèi)氧化酶、過氧化氫等多種氧化劑反應(yīng)形成蛋氨酸亞砜，可降低氧化應(yīng)激損傷和抗哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的活性[38]。SP2蛋白不僅為家蠶的生長發(fā)育提供能量，而且對于細(xì)胞凋亡具有抑制作用[39]。SP2和SP3具有高度的序列相似性，在家蠶體內(nèi)形成穩(wěn)定復(fù)合物，該復(fù)合物降解后為蠶蛹的發(fā)育提供氨基酸來源[40]。昆蟲的酚氧化酶根據(jù)作用底物的不同可分為酪氨酸酶類型酚氧化酶和漆酶類型酚氧化酶，Yatsu[41]和Yamazaki[42]等在蠶蛹中分離到的漆酶分子質(zhì)量為70 kDa，韓宏巖等[43]從家蠶表皮分離純化得到的酪氨酸酶分子質(zhì)量約為80 kDa。酚氧化酶是黑化反應(yīng)過程中黑色素合成的關(guān)鍵因素，本實(shí)驗(yàn)中階段IV蠶蛹的黑化與70 kDa蛋白的表達(dá)相關(guān)，但該階段70 kDa附近蛋白質(zhì)表達(dá)量降低的原因未知。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，繅絲蠶蛹中70 kDa蛋白質(zhì)含量豐富，可作為70 kDa蛋白質(zhì)的提取來源。目前，關(guān)于桑蠶蛹蛋白質(zhì)組成及活性的研究較少，其組成變化與生理活性之間的聯(lián)系有待于進(jìn)一步研究。

2.4 貯藏期桑蠶蛹油及繅絲蠶蛹油脂肪酸組成的變化

貯藏期蠶蛹油中含有16 種脂肪酸，繅絲蠶蛹油含有15 種脂肪酸（表3）。在各貯藏階段，樣品含飽和脂肪酸8 種，含量最高的是棕櫚酸（30.70%～32.47%）；單不飽和脂肪酸3 種，含量最高的是油酸（15.08%～16.86%）；多不飽和脂肪酸5 種，含量最高的是α-亞麻酸（26.03%～28.49%）。階段I、階段II蛹油中ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸的含量比（ω-6/ω-3）沒有顯著變化，階段IIIω-6/ω-3顯著上升（P＜0.05），蛹油中ω-3脂肪酸含量的動(dòng)態(tài)變化可能與蠶蛹體內(nèi)的脂肪酸脫氫酶的調(diào)節(jié)有關(guān)[44]。于海彥等[45]研究發(fā)現(xiàn)在蠶蛹發(fā)育的過程中初期ω-3脂肪酸脫氫酶表達(dá)量降低，在發(fā)育后期脫氫酶表達(dá)量上升，使蛹體內(nèi)ω-6/ω-3比例上升。與貯藏期蛹油相比，繅絲蛹油未檢出二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），但α-亞麻酸含量顯著較高（P＜0.05），這可能與繅絲工藝中熱處理及脂肪酸的不飽和程度有關(guān)。鮮繭繅絲工藝中的加熱溫度低于100 ℃，能夠防止多不飽和脂肪酸的熱裂解或降低蠶蛹油脂的氧化速率，但高溫加速了EPA的氧化分解。

表3 貯藏期各階段蠶蛹油的脂肪酸組成（n＝3）Table3 Fatty acid composition of silkworm pupa oil during storage (n = 3)

目前的研究表明，富含ω-3系α-亞麻酸的蠶蛹油具有抗氧化、降血糖、降血脂和改善記憶的功效[46-47]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長，蠶蛹油中ω-3脂肪酸相對含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而繅絲蛹油中的ω-3脂肪酸相對含量高于貯藏期蠶蛹。

2.5 貯藏時(shí)間對桑蠶蛹油DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率和總酚含量的影響

蠶蛹油DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的IC50在貯藏期呈減小的趨勢（52.00～20.93 mg/mL和156.81～33.32 mg/mL），總酚含量在貯藏期呈現(xiàn)上升趨勢（15.95～77.50 mg/kg）（表4），各階段蠶蛹油及繅絲蠶蛹油對自由基的清除力與蠶蛹油質(zhì)量濃度成正比。各貯藏階段的蠶蛹油DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的IC50及油脂總酚含量有顯著性差異（P＜0.05）階段IV蠶蛹油的總酚含量最高（77.50 mg/kg），其DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率也達(dá)到最高。這一現(xiàn)象可能與蠶蛹貯藏的過程中蛹體內(nèi)的生理變化有關(guān)[43]，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明蠶蛹油體外抗氧化能力可能與蠶蛹體內(nèi)酚含量呈正相關(guān)?？壗z蠶蛹油的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的IC50分別為37.63 mg/mL和92.42 mg/mL，其DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率顯著高于貯藏期I和II階段（P＜0.05），但顯著低于貯藏期III和IV階段的蠶蛹油（P＜0.05）。Hu Bin等[12]采用微波輔助聯(lián)合乙醇-正己烷混合提取四川雅安地區(qū)桑蠶蛹油，并測定其DPPH自由基清除能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法所提蛹油DPPH自由基清除能力（IC50＝26.47 mg/mL）高于索氏抽提法得到的蠶蛹油（IC50＝34.53 mg/mL）。Manosroi等[48]使用石油醚冷浸提得到的泰國本地蠶蛹油IC50為10.08 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)采用正己烷浸提蠶蛹油，階段IV的蠶蛹油DPPH自由基清除能力高于Hu Bin等[12]提取的蠶蛹油，但低于Manosroi等[48]提取的蠶蛹油。階段IV蠶蛹油的總酚含量與Hu Bin等[12]微波輔助聯(lián)合乙醇-正己烷法提取的蠶蛹油（78.36 mg/kg）接近，而繅絲蠶蛹油總酚含量低于Hu Bin等[12]索氏抽提法提取的蠶蛹油（42.76 mg/kg），說明蠶蛹的品種、蛹的發(fā)育、提取工藝均會(huì)影響蛹油的總酚含量及其體外DPPH自由基清除能力。葛雙雙等[49]發(fā)現(xiàn)油脂的體外抗氧化活性與其含有的α-亞麻酸共軛雙鍵自由基引起的分子重排有關(guān)，該過程包括了單分子加成、碳碳雙鍵氧化及環(huán)氧化的復(fù)雜過程。本實(shí)驗(yàn)中，階段II的蠶蛹油α-亞麻酸相對含量最高（28.49%），但其DPPH自由基清除能力（IC50＝51.04 mg/mL）低于階段IV蠶蛹油的DPPH自由基清除能力（IC50＝20.93 mg/mL）。此外，本實(shí)驗(yàn)中蛹油DPPH自由基清除率的IC50遠(yuǎn)低于其ABTS陽離子自由基清除率的IC50。這可能是由于DPPH自由基與脂溶性的物質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，更適用于評(píng)價(jià)脂溶性的物質(zhì)的抗氧化活性[50]。綜上，α-亞麻酸含量與蠶蛹油的體外抗氧化活性沒有相關(guān)性，蠶蛹油的自由基清除能力可能與蠶蛹油中的酚類物質(zhì)含量有關(guān)。

表4 貯藏階段蠶蛹油自由基清除率和總酚含量Table4 Free radical scavenging capacity and total phenol content of silkworm pupa oil during storage

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)所用的‘兩廣二號(hào)’桑蠶蛹屬于高脂肪昆蟲，含有豐富的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸。貯藏時(shí)間顯著影響蠶蛹營養(yǎng)品質(zhì)及蛹油的抗氧化活性，這可能與貯藏過程中蠶蛹的發(fā)育有關(guān)。蛹油中的總酚含量與其抗氧化活性呈正相關(guān)。蠶蛹是蠶繭繅絲的副產(chǎn)品，目前工業(yè)生產(chǎn)收集蠶繭有季節(jié)性，蠶繭貯藏條件不穩(wěn)定且貯藏時(shí)間較長，這些會(huì)影響繅絲蠶蛹的營養(yǎng)品質(zhì)和生理活性。因此，繅絲蠶蛹綜合利用可根據(jù)不同貯藏時(shí)期蠶蛹樣品的營養(yǎng)價(jià)值來選擇原料對象，提高繅絲副產(chǎn)物的品質(zhì)和利用率。