益生菌契達(dá)干酪抗氧化肽的結(jié)構(gòu)及其體內(nèi)代謝穩(wěn)定性

李曉東，張更旭，王宇鑫，郝欣悅，劉 璐，趙銘琪，倪晨宇，姜 欣

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

干酪不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，成熟期間還會(huì)生成抗氧化肽等生物活性肽[1-4]。Giacomo等從干酪中提取了EAMAPK和AVPYPQ兩種抗氧化肽[5]。Gupta等從契達(dá)干酪中提取了5 種分子質(zhì)量小于3 kDa的短肽，其中序列為VKEAMAPK的短肽與天然抗氧化劑丁基羥基茴香醚、特丁基對(duì)苯二酚的抗氧化性接近，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率達(dá)到74.76%[6]。酪蛋白，尤其β-酪蛋白是生物活性肽的重要來(lái)源，目前很多關(guān)于酪蛋白源活性肽的研究是利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等對(duì)酪蛋白進(jìn)行酶解，已知的這些酶有固定的酶切位點(diǎn)，得到的活性肽種類(lèi)比較單一。而干酪由于其特殊加工工藝，幾乎含有乳中全部酪蛋白，并含有大量乳酸菌，在干酪特有的成熟期間對(duì)酪蛋白進(jìn)行多樣化水解，能夠產(chǎn)生豐富多樣的活性肽，是制備生物活性肽的良好基質(zhì)[7-10]。為了進(jìn)一步促進(jìn)干酪生物活性肽的生成，也需要向其中添加高水解活性的益生菌等附屬發(fā)酵劑。一些益生菌如瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等，除具有一定的生理功能外，還具有不同的底物特異性和高蛋白水解和分解肽的活性，在較長(zhǎng)的成熟過(guò)程中，它們的蛋白水解系統(tǒng)會(huì)分泌胞外蛋白酶和肽酶，對(duì)干酪中的酪蛋白進(jìn)行不同程度的水解，生成豐富的生物活性肽[11-14]。

干酪成熟期間產(chǎn)生的活性肽在攝入體內(nèi)后是否仍具有活性還受消化道、吸收和血液轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)境的影響[15-16]，如Basiricò等針對(duì)帕馬森干酪血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制肽LHLPLP的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該肽段被腸肽酶水解成HLPLP，再以細(xì)胞旁路途徑轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞[17]。但也有一些肽段可抵抗胃腸道消化酶以及小腸上皮刷狀緣膜酶的降解，被小腸上皮細(xì)胞完整吸收[18-19]。因此，本研究以契達(dá)干酪為研究對(duì)象，向其中添加益生菌，分析益生菌干酪的體內(nèi)抗氧化活性，并對(duì)高抗氧化活性契達(dá)干酪的抗氧化肽進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，對(duì)鑒定出的高活性肽段進(jìn)行合成和FITC熒光標(biāo)記，喂養(yǎng)小鼠，通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記跟蹤該肽段進(jìn)入體內(nèi)后各臟器及血液中的變化趨勢(shì)，分析活性肽在小鼠腸道內(nèi)的代謝穩(wěn)定性，以期為功能性干酪的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小鼠、菌株與試劑

雄性KM小鼠購(gòu)買(mǎi)于吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2018-0007，使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2018-0001，體質(zhì)量為20～25 g。

商業(yè)發(fā)酵劑乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）和乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris）混合菌種、凝乳酶Stamix 1150北京科漢森公司；鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus1.0911、瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticus1.0612東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)。

過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-1冷凍干燥機(jī) 北京醫(yī)用分析儀器廠；AKTA Explore蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 德國(guó)GE公司；Q Exactive Plus液相色譜四極桿高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 益生菌契達(dá)干酪的制備

將益生菌菌株以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到10 mL 12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）復(fù)原脫脂乳中，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)兩代。再以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種到60 mL 12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）復(fù)原脫脂乳中，培養(yǎng)24 h，活菌數(shù)約為10（lg（CFU/mL））。

契達(dá)干酪的制備在Liu Lu等[20]方法的基礎(chǔ)上略作調(diào)整。原料乳→過(guò)濾、巴氏殺菌（63 ℃，30 min）→冷卻（32 ℃）→添加發(fā)酵劑和益生菌→發(fā)酵（32 ℃，60 min）→調(diào)整酸度→加氯化鈣→添加凝乳酶→凝乳（32 ℃，90 min）→切割（1 cm3）→攪拌升溫至42 ℃（每3～5 min升高1 ℃）→保溫?cái)嚢瑁?0 min）→靜置→排乳清→凝乳堆砌（每15 min反轉(zhuǎn)堆積一次，反轉(zhuǎn)7 次）→加鹽→成型壓榨→包裝→成熟（6 個(gè)月）。

發(fā)酵劑和益生菌的添加量：B-0組：發(fā)酵劑添加量為0.01%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；B-1組：發(fā)酵劑添加量為0.01%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、鼠李糖乳桿菌的添加量為12%（體積分?jǐn)?shù)）；B-2組：發(fā)酵劑添加量為0.01%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、瑞士乳桿菌的添加量為12%（體積分?jǐn)?shù)）。

1.3.2 益生菌契達(dá)干酪提取液的制備

干酪提取液的制備參考文獻(xiàn)[21]并略作調(diào)整。在干酪成熟過(guò)程中，每30 d進(jìn)行一次蛋白質(zhì)的提取，即分別取干酪樣品10 g溶于100 mL去離子水中，用勻漿機(jī)勻漿2 min。過(guò)濾、離心（4 000×g、20 min、4 ℃），取上清液即水溶性提取物，再對(duì)其進(jìn)行冷凍干燥，凍干后的樣品在－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 益生菌契達(dá)干酪體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定

選取雄性KM小鼠48 只，干預(yù)前將各組小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。將小鼠隨機(jī)分成6 組（正常對(duì)照組、衰老模型組、VC組以及3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組），每組8 只。喂養(yǎng)時(shí)給小鼠相同的飼料，自由飲水、進(jìn)食，并控制相同的相對(duì)濕度及溫度。正常對(duì)照組每天按照0.1 mL/10 gmb的劑量注射生理鹽水，其他組每天注射相同體積且質(zhì)量濃度為50 mg/mL的D-半乳糖溶液。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行28 d，每7 d記錄一次小鼠的體質(zhì)量。具體的注射及灌胃方式如表1所示，其中灌胃的干酪提取液及VC溶液的質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL。

表1 各組小鼠的處理方式Table1 Grouping of experimental animals

將各組小鼠干預(yù)28 d后，對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血（0.5 mL），并以脫頸法處死。取出的血液樣本靜置30 min后，6 000 r/min離心10 min，收集上清液獲得血清，將血清置于液氮中速凍，在放入－80 ℃冰箱中待測(cè)。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中SOD、CAT、GSH-Px和MDA的水平。

1.3.4 益生菌干酪抗氧化肽的結(jié)構(gòu)特征鑒定

1.3.4.1 超濾分離

根據(jù)1.3.3節(jié)結(jié)果確定抗氧化活性最高的益生菌干酪提取液，將其凍干樣品溶于蒸餾水中，使質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL，選用截留分子質(zhì)量為3、5、8、10 kDa的超濾膜對(duì)益生菌干酪提取液進(jìn)行分離，得到4 個(gè)不同的多肽組分：ULTR-1：分子質(zhì)量＜3 kDa；ULTR-2：分子質(zhì)量3～5 kDa；ULTR-3：分子質(zhì)量5～8 kDa；ULTR-4：8～10 kDa；ULTR-5：分子質(zhì)量＞10 kDa。收集各組分后，冷凍干燥備用，以DPPH自由基清除率、羥自由基清除能力以及還原能力為考察指標(biāo)，參考文獻(xiàn)[22]測(cè)定各組分的抗氧化活性，選擇抗氧化活性最高的組分進(jìn)行后續(xù)的多肽純化。

1.3.4.2 多肽純化

利用AKTA Explore蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)及凝膠色譜柱（分子質(zhì)量1～20 kDa）對(duì)1.3.4.1節(jié)超濾分離后抗氧化活性最高的多肽組分進(jìn)行進(jìn)一步純化。具體參照馬穗[23]的方法進(jìn)一步修改。平衡系統(tǒng)：清洗進(jìn)樣口和上樣環(huán)，設(shè)定流速為0.5 mL/min，壓力上限為1.8 MPa，所用溶劑為超純水。當(dāng)流量達(dá)到48 mL時(shí)（約2 倍柱體積）準(zhǔn)備進(jìn)樣；進(jìn)樣：將排凈氣泡的1 mL 20 mg/mL樣品吸入1 mL注射器中，緩慢勻速推動(dòng)注射器，將樣品注入上樣環(huán)中；切換系統(tǒng)管路：運(yùn)行系統(tǒng)，將樣品倒入凝膠色譜柱中，觀察系統(tǒng)壓強(qiáng)；樣品收集：通過(guò)觀察的峰型圖，對(duì)分離后不同峰對(duì)應(yīng)的組分進(jìn)行收集，而后將樣品置于4 ℃保存。

參考文獻(xiàn)[22]測(cè)定各個(gè)色譜峰組分的DPPH自由基清除率、羥自由基清除能力以及還原能力，確定抗氧化活性最強(qiáng)的色譜峰組分以進(jìn)行后續(xù)結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.4.3 利用液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

選取1.3.4.2節(jié)純化出的活性最高的組分，利用Q Exactive Plus-Orbitrap液相色譜（配備Acclaim PepMap 100A C18色譜柱）四極桿高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀分析其多肽的序列。流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%乙腈水溶液。進(jìn)樣量為2 μL，柱溫為35 ℃，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。質(zhì)譜條件中離子掃描模式為正離子模式，掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍：35～1 800m/z，離子源溫度：280 ℃，數(shù)據(jù)利用Proteome Discoverer 2.1軟件進(jìn)行分析。

表2 梯度洗脫程序Table2 Gradient elution procedure

確定肽段序列后委托南京源肽生物科技有限公司進(jìn)行多肽的合成，參考文獻(xiàn)[22]測(cè)定不同合成肽的抗氧化活性。選取抗氧化活性最高的肽段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 抗氧化肽在小鼠體內(nèi)代謝途徑的測(cè)定

1.3.5.1 熒光標(biāo)記肽的合成

選取1.3.4.3節(jié)中抗氧化活性最高的肽段進(jìn)行熒光標(biāo)記肽的合成（委托南京源肽生物科技有限公司完成）。主要流程為：樹(shù)脂溶脹→接第一個(gè)氨基酸→脫保護(hù)→檢測(cè)（變深藍(lán)色為陽(yáng)性反應(yīng)）→洗（分別用二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）、甲醇和DMF洗滌兩次）→縮合→洗（DMF一次、甲醇兩次、DMF兩次）→脫保護(hù)→檢測(cè)（變深藍(lán)色為陽(yáng)性反應(yīng)）→洗（分別用DMF、甲醇和DMF洗滌兩次）→縮合→洗（DMF一次、甲醇兩次、DMF兩次）→檢測(cè)（茚三酮檢測(cè)陰性）→洗（用甲醇洗滌3 次）→從樹(shù)脂上切割多肽→吹干洗滌→用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）純化多肽。最后將純化后的溶液凍干，既得到成品。將粉末狀的多肽，密封包裝，－20 ℃保存。經(jīng)過(guò)HPLC鑒定，根據(jù)峰面積計(jì)算純度為95.8%，色譜圖如圖1所示。

圖1 熒光標(biāo)記肽的HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatogram of fluorescently labeled peptide

1.3.5.2 血清中熒光標(biāo)記肽質(zhì)量濃度的測(cè)定

具體操作參考文獻(xiàn)[24]的方法略作修改。

血液樣本的制備：雄性KM鼠給藥前禁食12 h，自由飲水，單次灌胃給藥0.1 mL（質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL），劑量為2 mg/kgmb，分別在給藥后每隔1 h，選擇一組小鼠（3 只）取眼球血0.5 mL，并以脫頸法處死。取出的樣本靜置30 min后，于6 000 r/min離心10 min，取出血清后，置于液氮中速凍，在放入－80 ℃冰箱中待測(cè)。

血清樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：取小鼠的血液樣本，用熒光標(biāo)記肽標(biāo)準(zhǔn)液分別配制成質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、2.0、3.0 μg/L的血清樣品，并且用相同體積的生理鹽水代替熒光標(biāo)記肽標(biāo)準(zhǔn)液的血清樣品作為對(duì)照。并分別加入生理鹽水至1.4 mL，磁力攪拌1 min，靜置10 min，并于12 000 r/min的條件下離心10 min后，取出上清液于熒光激發(fā)波長(zhǎng)480 nm、發(fā)射波長(zhǎng)515 nm處檢測(cè)出熒光強(qiáng)度。繪制出血清中熒光標(biāo)記肽的質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝18.379 6x＋12.164 8，R2＝0.998 9。

樣品中熒光標(biāo)記肽質(zhì)量濃度的測(cè)定：取血清樣品0.1 mL，置于2 mL生理鹽水中，混勻后靜置10 min，于12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液在相同熒光條件下，測(cè)定血清樣品的熒光強(qiáng)度。并根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中熒光標(biāo)記肽的質(zhì)量濃度。

1.3.5.3 熒光標(biāo)記肽在小鼠組織中分布情況測(cè)定

組織樣品的制備：與血液樣本的制備略有不同，給藥后每隔1 h以脫頸法將其處死一組小鼠，迅速取出小鼠的內(nèi)臟及腦組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗后，并用濾紙吸干稱(chēng)質(zhì)量。用錫箔紙將樣品包裹后，置于液氮中迅速冷凍并轉(zhuǎn)置于－80 ℃冰箱中待測(cè)。

組織樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：取正常對(duì)照組小鼠的組織樣本勻漿，離心后取上清液，用熒光標(biāo)記肽的標(biāo)準(zhǔn)液配制成不同質(zhì)量濃度的組織樣品中，并其用相同體積的生理鹽水代替熒光標(biāo)記肽標(biāo)準(zhǔn)液的樣品作為對(duì)照。分別取不同質(zhì)量濃度的組織樣品和對(duì)照樣品0.2 mL，按照1.3.5.2節(jié)方法繪制出組織樣本中熒光標(biāo)記肽的質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

各組織中熒光標(biāo)記肽質(zhì)量濃度的測(cè)定：將組織樣品中加入生理鹽水后，于高速勻漿機(jī)下勻漿，并將勻漿液離心后取上清液，加入生理鹽水，并于12 000 r/min的條件下離心10 min后，取出上清液于上述的相同熒光條件下，記錄其熒光強(qiáng)度。并根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中熒光標(biāo)記肽的質(zhì)量濃度。熒光標(biāo)記肽在各組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及決定系數(shù)如表3所示。

表3 熒光標(biāo)記肽在各組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table3 Calibration curve equations for determination of fluorescently labeled peptide in various tissues

1.3.5.4 干酪抗氧化肽的體內(nèi)抗氧化活性

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法同1.3.3節(jié)，處理方式為注射D-半乳糖＋灌胃熒光標(biāo)記肽，灌胃劑量為0.1 mL/10 gmb。參照試劑盒提供的方法測(cè)定血清中SOD、CAT、GSH-Px和MDA的水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本研究中各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；通過(guò)Origin 2018軟件進(jìn)行作圖；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1中Linear Models程序進(jìn)行，使用Tukey HSD進(jìn)行差異顯著性分析，其中P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌契達(dá)干酪體內(nèi)抗氧化活性研究

2.1.1 干預(yù)期間小鼠體質(zhì)量變化小鼠的體質(zhì)量變化如表4所示，各組中小鼠體質(zhì)量均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，只有衰老模型組小鼠在21 d后開(kāi)始略顯消瘦，毛色光澤度較差并出現(xiàn)退毛現(xiàn)象。但5 組小鼠之間體質(zhì)量變化差異不顯著（P＞0.05），對(duì)后續(xù)干酪抗氧化肽的體內(nèi)穩(wěn)定性研究結(jié)果無(wú)影響。

表4 干預(yù)期間小鼠的體質(zhì)量變化Table4 Changes in mouse body mass during the intervention period

2.1.2 益生菌契達(dá)干酪的體內(nèi)抗氧化活性

由表5可知，與正常對(duì)照組小鼠相比，衰老模型組小鼠血清中的SD、CAT、GSH-Px活力均顯著下降，而MDA濃度顯著上升（P＜0.05），說(shuō)明小鼠衰老模型的建立成功。與衰老模型組相比，B-0、B-1和B-2組中小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-Px活力呈現(xiàn)不同程度的顯著上升，MDA濃度均顯著下降（P＜0.05），說(shuō)明灌胃空白干酪以及益生菌干酪均可提高小鼠體內(nèi)的抗氧化水平。與衰老模型組相比，B-0和B-1組小鼠抗氧化能力雖有所改善，但變化幅度較小，B-2組小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-Px活力分別為（281.82±7.89）、（21.22±2.25）U/mL和（99.74±5.03）U/mL，與衰老模型組相比分別提升了45.98%、35.33%和37.93%，且與正常對(duì)照及VC組間的差異不顯著（P＞0.05）；其MDA的濃度下降最多，與衰老模型組相比下降了19.79%。以上結(jié)果說(shuō)明利用L.helveticus作為非發(fā)酵劑乳桿菌制備的干酪，對(duì)衰老模型組小鼠抗氧化水平的改善效果最好。這可能由于該菌株蛋白水解能力強(qiáng)，可將酪蛋白中高抗氧化活性的肽段釋放，進(jìn)而更有效地抑制衰老小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。

表5 益生菌契達(dá)干酪的體內(nèi)抗氧化能力Table5 Effect of probiotic Cheddar cheeses on antioxidant capacity in mice

2.2 超濾分離益生菌契達(dá)干酪提取液結(jié)果

鑒于B-2組體內(nèi)抗氧化活性最高，因此對(duì)B-2組干酪提取液進(jìn)行超濾分離，并測(cè)定抗氧化活性。結(jié)果如表6所示。

表6 超濾分離契達(dá)干酪提取液所得組分及其抗氧化活性Table6 Ultrafiltration fractions of water-soluble extracts from Cheddar cheeses and their antioxidant activity

由表6可知，共得到分子質(zhì)量小于3、3～5、5～8、8～10 kD和大于10 kDa共5 個(gè)組分，其中分子質(zhì)量小于3kDa的ULTR-1組分抗氧化活性最高，其DPPH自由基清除率、還原能力、羥自由基清除率可分別達(dá)到（82.63±0.27）%、0.91±0.06和（87.28±0.33）%，且所占的比例最高，達(dá)到（42.63±0.32）%。這與Zhang Chi等[25]的研究結(jié)果相似。分子質(zhì)量越小的肽段，其抗氧化活性最高，這可能是由于分子質(zhì)量大的肽段，空間位阻大，使得一些具有抗氧化活性的氨基酸無(wú)法暴露出來(lái)，進(jìn)而無(wú)法發(fā)揮其抗氧化的作用[4]。

2.3 蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)純化ULTR-1組分的結(jié)果

由圖2可知，利用蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)純化ULTR-1組分時(shí)，共得到了5 個(gè)色譜峰，并且5 個(gè)色譜峰均完全分離，并分別收集5 個(gè)色譜峰所對(duì)應(yīng)的組分，對(duì)收集后的組分進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，結(jié)果如表7所示。

圖2 ULTR-1組分的蛋白質(zhì)純化色譜圖Fig. 2 Separation chromatogram of ULTRA-1

表7 ULTR-1組分純化所得5 個(gè)組分的抗氧化活性Table7 Antioxidant activity of five subfractions purified from ULTR-1

由表7可知，色譜峰P2對(duì)應(yīng)組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為（62.77±0.36）%；色譜峰P3對(duì)應(yīng)組分的抗氧化活性最高，DPPH自由基清除率為（91.03±0.31）%、還原能力為0.97±0.04、羥自由基清除率為（93.22±0.22）%。根據(jù)色譜柱分離原理，當(dāng)混合物隨流動(dòng)相經(jīng)凝膠柱時(shí)，分子質(zhì)量較大肽段的分子不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受到排阻，它們將與流動(dòng)相一起首先流出，而根據(jù)所選擇的凝膠色譜柱的規(guī)格，ULTR-1組分理論上應(yīng)全部進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，這部分肽段中較大的先流出凝膠網(wǎng)孔，較小的分子后流出。因此，其后流出的P4、P5組分抗氧化活性較低的原因可能是由于肽段在酶的作用下水解成一些不具抗氧化活性的氨基酸。

2.4 干酪抗氧化肽結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

利用液相四極桿高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)分離的到的P3組分進(jìn)行肽段結(jié)構(gòu)的鑒定。經(jīng)過(guò)液相色譜儀時(shí)將樣品進(jìn)行分離，通過(guò)質(zhì)譜儀將分離的成分逐個(gè)打碎成離子碎片，并根據(jù)離子碎片鑒定出氨基酸序列，通過(guò)與已知的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后，確定了酪蛋白源的抗氧化肽共6 種，具體結(jié)果如表8所示。由表8可知，P3組分中具有抗氧化活性的肽段為5～17肽不等。與前人研究的干酪中的生物活性肽結(jié)果[4,26]相比，添加了瑞士乳桿菌的干酪水溶性提取物所獲得的肽段更短。在所得的6 個(gè)肽段中，分子質(zhì)量相對(duì)較大的，其抗氧化活性相對(duì)較低，這可能是因?yàn)殡逆溳^長(zhǎng)，空間位阻較大，影響生物活性[4]。從所獲得的肽段來(lái)看，大部分來(lái)自于β-酪蛋白，只有一條肽鏈來(lái)自于αs1-酪蛋白。本研究所獲得的6 種肽段中，有4 種都含有Pro（P），且均處于N末端的第二位。除此之外，所獲得的肽鏈中，疏水性氨基酸Leu（L）、Phe（F）和芳香族氨基酸Tyr（Y）含量較高，這是因?yàn)槔野彼岱恿u基上的氫是優(yōu)良的氫供體，可清除原有的自由基[27-29]。其抗氧化活性最高的肽段QPHQP來(lái)自于β-酪蛋白（146～150），同時(shí)也是分子質(zhì)量最小的一個(gè)，并且N末端倒數(shù)第二位為Pro（P），且肽鏈中含有一個(gè)組氨酸His（H），內(nèi)部含有咪唑基，可通過(guò)鰲合金屬離子來(lái)增加肽鏈的抗氧化活性，Saito等[30]得到了同樣的結(jié)論。本研究中喂養(yǎng)肽段QPHQP小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-Px活力分別為（301.12±6.12）、（23.42±1.56）、（112.93±3.29）U/mL，MDA濃度為（236.73±4.32）nmol/mL。

表8 P3組分的肽段序列及其抗氧化活性Table8 Peptide sequences and antioxidant activity of antioxidant peptides identified in P3

2.5 益生菌契達(dá)干酪抗氧化肽體內(nèi)代謝穩(wěn)定性研究結(jié)果

2.5.1 熒光標(biāo)記肽在血清中的分布情況

由圖3可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠血清中的熒光標(biāo)記肽的質(zhì)量濃度逐漸上升，在2 h后達(dá)到峰值（2.56±0.06）μg/mL。隨后開(kāi)始下降，在8 h后開(kāi)始逐漸趨于穩(wěn)定，此時(shí)質(zhì)量濃度僅為（0.89±0.05）μg/mL，與質(zhì)量濃度峰值（2 h時(shí)）相比下降了65.23%，這是由于熒光標(biāo)記肽在這段時(shí)間內(nèi)，隨血液循環(huán)逐漸轉(zhuǎn)移至靶器官而發(fā)揮其抗氧化的作用。在8 h后逐漸趨于平穩(wěn)，在12 h后仍有部分殘留，是因?yàn)椴糠挚寡趸牧粼诹搜褐?，可能與血清中的某一成分相結(jié)合或發(fā)揮了作用，這與尹天旸[24]的結(jié)果相似，均在2 h達(dá)到了峰值，而后隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。

圖3 小鼠血清中熒光標(biāo)記肽質(zhì)量濃度Fig. 3 Concentration of fluorescently labeled peptide in mouse serum

2.5.2 熒光標(biāo)記肽在小鼠體內(nèi)的分布情況

由圖4可知，相同時(shí)間段內(nèi)，胃部熒光標(biāo)記肽含量均高于其他組織，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量快速下降。然而其他組織中，熒光標(biāo)記肽的含量均隨著時(shí)間延長(zhǎng)先逐漸上升，在2 h后，腸、腎、肝、肺中均達(dá)到了最大值，分別為（86.42±1.56）、（5.58±0.09）、（15.47±0.44）、（10.88±0.59）μg/kg；而在4 h后熒光標(biāo)記肽含量在心臟和脾臟達(dá)到最大值，分別為（7.16±0.29）、（4.32±0.13）μg/kg；在8 h后，腦中的抗氧化肽含量達(dá)到了最大值，為（4.23±0.11）μg/kg。

圖4 小鼠各組織中熒光標(biāo)記肽含量隨時(shí)間變化Fig. 4 Changes in fluorescently labeled peptide contents in mouse tissues over time

灌胃1 h后，胃內(nèi)熒光標(biāo)記肽含量含量最高，為（138.52±1.84）μg/kg。在灌胃2 h后，主要集中在胃腸道內(nèi)，同時(shí)在腸、腎、肝、肺中也逐漸達(dá)到了最大值，并且除胃腸道外，在肝臟中的含量最高。這說(shuō)明在前2 h，熒光標(biāo)記肽大部分隨血液流向了肝臟，并且肝臟對(duì)這一抗氧化肽的利用度最高。4 h后，消化道內(nèi)的熒光標(biāo)記肽含量仍然高于其他組織，并且隨著血液的循環(huán)心臟和脾達(dá)到的峰值。8 h后，在腦組織中的熒光標(biāo)記肽含量達(dá)到的最大值，且在腦組織中的含量始終低于其他組織，這說(shuō)明該抗氧化肽只有一小部分可通過(guò)腦組織屏障。大部分肽在8 h內(nèi)均隨血液循環(huán)到達(dá)了靶器官，且消化道內(nèi)的抗氧化肽含量下降至不到灌胃1 h時(shí)的30%，且所有器官內(nèi)的熒光強(qiáng)度均開(kāi)始逐漸下降。而后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，所有組織器官中肽的含量均逐漸下降。在整個(gè)代謝過(guò)程中，除消化道外，肝臟中的抗氧化肽含量始終高于其他組織，這說(shuō)明抗氧化肽主要在蓄積在肝臟中，并參與其中的氧化代謝反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮其抗氧化作用。

3 結(jié) 論

益生菌契達(dá)干酪提取液可顯著提高衰老小鼠血清中抗氧化酶的活性，顯著降低氧化產(chǎn)物丙二醛的濃度，與相同質(zhì)量濃度VC的抗氧化能力相當(dāng)。從添加了瑞士乳桿菌的契達(dá)干酪提取液中共鑒定出6 種抗氧化肽，分別為MPFPKYPVEPFTESQSL、YPFPGPIPN、QPHQP、QTEDELQDK、YFYPEL、MPIQAFLLY，其中QPHQP抗氧化活性最高。干酪抗氧化肽可隨血液循環(huán)遍布動(dòng)物各個(gè)器官，但主要蓄積在肝臟并參與其中的氧化代謝反應(yīng)，進(jìn)而起到抗氧化的作用，提高機(jī)體的抗氧化能力。