葡萄糖亞適量流加對(duì)谷氨酸棒桿菌產(chǎn) L-異亮氨酸的影響

熊海波，劉景陽(yáng)，徐慶陽(yáng),2,

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

L-異亮氨酸屬于分支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一，L-異亮氨酸用途廣泛，是人體激素、蛋白質(zhì)合成和能量生成的原料，能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成并抑制其分解[1-4]； 隨著人們對(duì)L-異亮氨酸認(rèn)知越來(lái)越全面，其在飼料、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[5-7]。

產(chǎn)酸率及菌種活力是評(píng)價(jià)發(fā)酵能力的重要指標(biāo)，因此隨著對(duì)L-異亮氨酸的深入研究，具有原料成本低、發(fā)酵條件溫和、發(fā)酵能力穩(wěn)定的的谷氨酸棒桿菌發(fā)酵法逐漸成為生產(chǎn)L-異亮氨酸的主要方式[8-10]。而發(fā)酵能力不僅取決于發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇，更取決于發(fā)酵方法的控制，這包括多尺度發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)、超聲輔助發(fā)酵技術(shù)、循環(huán)發(fā)酵技術(shù)、半連續(xù)發(fā)酵技術(shù)等。目前L-異亮氨酸發(fā)酵方法主要采用低殘?zhí)橇骷庸に嚕@種方法主要面臨糖酸轉(zhuǎn)化率低、發(fā)酵溶氧供應(yīng)不足、副產(chǎn)物積累過(guò)多等問(wèn)題，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵周期縮短以及L-異亮氨酸提取困難[11-12]。

本研究通過(guò)分析菌體發(fā)酵不同階段對(duì)葡萄糖需求能力的不同，采用多階段葡萄糖控制工藝，即將菌體分為適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、產(chǎn)酸高峰期及衰亡期4 個(gè)階段，對(duì)菌體攝糖能力的差異進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，實(shí)現(xiàn)菌體的“發(fā)酵轉(zhuǎn)換”[13]，將發(fā)酵工藝精細(xì)化、合理化，達(dá)到發(fā)酵產(chǎn)酸的最優(yōu)條件。這種方法不僅解決菌體適應(yīng)期長(zhǎng)、產(chǎn)酸高峰期短、菌體提前進(jìn)入衰亡期等問(wèn)題，還可有效降低能源消耗、提升發(fā)酵液質(zhì)量，為后續(xù)的產(chǎn)物提取降低 難度[14]。同時(shí)應(yīng)用代謝流分析原理測(cè)定胞外的產(chǎn)物濃度，計(jì)算菌體穩(wěn)定期各途徑的反應(yīng)速率，得到代謝流量分布，并對(duì)流量分配進(jìn)行對(duì)比與分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）YILM1504，由天津科技大學(xué)代謝工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖30 g/L，豆粕粉10 g/L，酵母粉8 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米漿5 g/L，KH2PO44 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH 0.1 mg/L，賴氨酸1 g/L，蛋氨酸1g/L，谷氨酸1g/L，消泡劑0.2 g/L，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 4.5～5.0，種子發(fā)酵罐培養(yǎng)用氨水調(diào)節(jié)并維持pH 6.7～7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖60 g/L，MgSO40.8 g/L，KH2PO41.5 g/L，玉米漿5 g/L，VB11 g/L，蛋白胨2 g/L，豆餅水解液10 mL/L，賴氨酸1 g/L，蛋氨酸0.3 g/L，谷氨酸3 g/L，甜菜堿0.3 g/L，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 4.5～5.0，發(fā)酵罐培養(yǎng)用氨水調(diào)節(jié)并維持pH 6.7～7.0。

葡萄糖 山東西王藥業(yè)公司；玉米漿 內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司；其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZH-100KBS型全自動(dòng)立式蒸汽滅菌器 天津博鑫生物科技有限公司；5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；1200高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；KQ-C高壓蒸汽發(fā)生器 上海奉賢協(xié)新機(jī)電廠；752分光光度計(jì) 上海分析儀器廠；生物顯微鏡 日本Olympus會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

谷氨酸棒桿菌YILM1504在－80 ℃條件下保存在20%的甘油管中，接種于斜面試管活化24 h，再?gòu)男泵嫒? 環(huán)一代活化菌種接種于200 mL茄形瓶固體斜面培養(yǎng)20 h。

5 L種子發(fā)酵罐，罐體滅菌后，定容種子菌種培養(yǎng)基2 L，接種，溫度32 ℃，pH值維持在6.7～7.2之間，培養(yǎng)至菌種量OD600nm為20×0.8時(shí)接發(fā)酵。初始通風(fēng) 2.0 L/min，初始罐壓小于0.05 MPa，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，罐內(nèi)溶氧保持在30%～40%之間。一般種子培養(yǎng)時(shí)間為

14～16 h。

5 L發(fā)酵培養(yǎng)，罐內(nèi)留800 mL種子液，再接入2.2 L發(fā)酵培養(yǎng)基，定容到3 L，進(jìn)入發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)。溫度32 ℃，pH 6.7～7.0，溶氧保持在30%～40%之間，轉(zhuǎn)速由 200 r/min逐步提加到930 r/min；通風(fēng)由2.0 L/min逐步提升到6.0 L/min，后根據(jù)溶氧變化逐步降低轉(zhuǎn)速與通風(fēng)。16 h后測(cè)殘?zhí)?，流?00 g/L的葡萄糖，維持罐內(nèi)殘?zhí)窃?～20 g/L之間。中間添加適量消泡劑消除泡沫。

1.3.2 分析檢測(cè)

1.3.2.1 高效液相色譜法檢測(cè)L-異亮氨酸及副產(chǎn)物

發(fā)酵液中檢測(cè)到除L-異亮氨酸外多種副產(chǎn)物，需要配制多梯度濃度L-異亮氨酸和副產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品。發(fā)酵液中L-異亮氨酸和副產(chǎn)物濃度用高效液相色譜法測(cè)定。采用Agilent C18色譜柱（15 mm×4.6 mm，3.5 μm），衍生劑為2,4-二硝基氟苯，柱前衍生，流動(dòng)相為50%乙腈、 4.1 g/L乙酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm[15]。

1.3.2.2 pH值的測(cè)定

采用pH 6.4～8.0精密pH值試紙測(cè)定。

1.3.2.3 葡萄糖含量檢測(cè)

每2 h取樣，離心，留上清液。用SBA生物傳感分析儀檢測(cè)葡萄糖含量。

1.3.2.4 菌體生物量檢測(cè)

每隔2 h取樣，分別稀釋10、20、100、200 倍，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量樣品在600 nm波長(zhǎng)處OD值。OD值范圍在0.2～0.8，超過(guò)量程后需換下一個(gè)稀釋倍數(shù)。菌體生物量計(jì)算如式（1）所示：

1.3.2.5 pH值在線檢測(cè)

發(fā)酵罐自帶梅特勒pH值在線檢測(cè)，用pH值試劑進(jìn)行放液驗(yàn)證檢測(cè)。培養(yǎng)基pH值控制可用梅特勒電導(dǎo)率儀精密檢測(cè)。

1.3.2.6 溶氧測(cè)定

發(fā)酵罐自帶瑞士哈美頓VisiFerm DO電極，溶氧校正，0點(diǎn)是飽和亞硫酸鈉溶液中的穩(wěn)定值，100%點(diǎn)是發(fā)酵液滅菌后的冷卻溶液中穩(wěn)定值。

1.3.3 指標(biāo)計(jì)算

1.3.3.1 糖酸轉(zhuǎn)化率計(jì)算

糖酸轉(zhuǎn)化率計(jì)算[16]如式（2）所示：

式中：ρ為L(zhǎng)-異亮氨酸質(zhì)量濃度/（g/L）；V為發(fā)酵液總體積/L；m為總耗糖量/g。

1.3.3.2 最大補(bǔ)糖速率計(jì)算

在流加葡萄糖過(guò)程中，達(dá)到最大補(bǔ)糖速率表現(xiàn)方式是，發(fā)酵控制器中溶氧曲線圍繞著某個(gè)定值上下波動(dòng)，其原因是流加葡萄糖隨蠕動(dòng)泵打入發(fā)酵罐內(nèi)，存在一個(gè)蠕動(dòng)速率（如12/1，表示蠕動(dòng)泵關(guān)12 s，轉(zhuǎn)動(dòng)1 s），在蠕動(dòng)期間，葡萄糖進(jìn)入罐內(nèi)，溶氧下降，當(dāng)停止蠕動(dòng)，隨著加入的葡萄糖逐漸消耗，溶氧逐漸上升，如此反復(fù)，溶氧曲線波動(dòng)前進(jìn)。此時(shí)葡萄糖對(duì)菌體供給平衡，電子天平上補(bǔ)料瓶葡萄糖減少量為期間菌體剛好消耗葡萄糖的量，此時(shí)補(bǔ)糖速率為最大補(bǔ)糖速率。再增大補(bǔ)糖速率，也不會(huì)增加菌體耗糖速率，多余補(bǔ)充的葡萄糖以罐內(nèi)殘?zhí)切问酱嬖冢踔習(xí)黾影l(fā)酵液黏稠度與滲透壓，降低菌體活力，減弱葡萄糖吸收能力。通過(guò)實(shí)時(shí)計(jì)算不同時(shí)期補(bǔ)糖速率，繪制補(bǔ)糖速率曲線。

最大補(bǔ)糖速率計(jì)算如式（3）所示：

式中：m1為單位時(shí)間耗糖量/g；t為單位補(bǔ)糖時(shí)間/h；V1為實(shí)時(shí)發(fā)酵液體積/L。

1.3.4 代謝流網(wǎng)絡(luò)建立

采用Vallino等[17]的方法，根據(jù)物料平衡計(jì)算代謝物的積累速率，如式（4）所示：

式中：xj（t）為第j步反應(yīng)的反應(yīng)速率/（mmol/（L·h））；xk（t）為第k步反應(yīng)的反應(yīng)速率/（mmol/（L·h））；aj為第j步反應(yīng)的反應(yīng)計(jì)量系數(shù)；ak為第k步反應(yīng)的反應(yīng)計(jì)量系數(shù)；rj（t）為中間代謝物j的積累速 率/（mmol/（L·h））。

由擬穩(wěn)態(tài)假定可得rj（t）＝0。代謝網(wǎng)絡(luò)中的m個(gè)中間代謝物構(gòu)成n個(gè)代謝流平衡方程式，寫(xiě)成矩陣形式見(jiàn)式（5）：

式中：A為m×n維矩陣；x（t）為n×1維矩陣；n為選定的速率總數(shù)目。待解決問(wèn)題自由度見(jiàn)式（6）：

建立代謝網(wǎng)絡(luò)原則[18]：1）細(xì)胞處于非生長(zhǎng)時(shí)期或細(xì)胞濃度變化不大而可以忽略；2）細(xì)胞代謝中不存在乙醛酸循環(huán)；3）還原型輔酶II（NADPH）供需平衡，即反應(yīng)途徑中消耗的NADPH與磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，HMP）、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)產(chǎn)生的NADPH總數(shù)相等；4）不考慮ATP總量平衡；5）反應(yīng)過(guò)程中無(wú)分支節(jié)點(diǎn)的反應(yīng)按一步反應(yīng)計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3 次實(shí)驗(yàn)的平均值。單因素方差分析之后Dunnett-t檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)差異的顯著性（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始葡萄糖添加量對(duì)L-異亮氨酸發(fā)酵的影響

2.1.1 初始葡萄糖添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)及L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響

分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加30、60、90、120 g/L的初始葡萄糖，以初始葡萄糖添加量30 g/L為對(duì)照組，考察初始葡萄糖添加量對(duì)菌體生物量及L-異亮氨酸等發(fā)酵參數(shù)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 初始葡萄糖添加量對(duì)菌體生物量及L-異亮氨酸合成的影響Fig. 1 Effects of different initial glucose concentrations on bacterial biomass and L-isoleucine synthesis

隨著底物葡萄糖添加量的提升，菌體生長(zhǎng)速率加快，底物葡萄糖添加量為90 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)速率最快，生物量最高，OD600nm達(dá)到129，L-異亮氨酸達(dá)到 37 g/L，但繼續(xù)增加底物葡萄糖添加量，對(duì)谷氨酸棒桿菌菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用，且底物葡萄糖添加量越高抑制作用越強(qiáng)[19]。同時(shí)谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-異亮氨酸為生長(zhǎng)偶聯(lián)型，高生物量有利于產(chǎn)酸速率的提升，菌體生物量與產(chǎn)酸分別比對(duì)照組提高了24%和24.8%。

2.1.2 初始葡萄糖添加量對(duì)糖酸轉(zhuǎn)化率及補(bǔ)糖速率的影響

如圖2所示，以30 g/L初始葡萄糖添加量為對(duì)照組，考察初始葡萄糖添加量對(duì)起始補(bǔ)糖時(shí)間、過(guò)程補(bǔ)糖速率及糖酸轉(zhuǎn)化率的影響。

圖2 初始葡萄糖添加量對(duì)糖酸轉(zhuǎn)化率及補(bǔ)糖速率的影響Fig. 2 Effect of initial glucose concentration on glucose-to-acid conversion rate and glucose feeding rate

在發(fā)酵初期種子剛接入發(fā)酵罐時(shí)，菌體處于適應(yīng)期，以適應(yīng)新的環(huán)境，初始葡萄糖添加量造成的發(fā)酵液環(huán)境差異會(huì)對(duì)新生菌體的生長(zhǎng)造成影響。一方面提升初始葡萄糖添加量會(huì)增加發(fā)酵液黏稠度以及胞外滲透壓，造成罐內(nèi)氧傳遞能力下降及菌體抵抗外界環(huán)境刺激難度上升；另一方面提升初始葡萄糖添加量會(huì)使菌體長(zhǎng)時(shí)間處于葡萄糖過(guò)量狀態(tài)，補(bǔ)糖時(shí)間延后，從而推遲菌體進(jìn)入葡萄糖供需平衡狀態(tài)[20]。

由圖2可知，隨著初始葡萄糖添加量的增加，補(bǔ)糖時(shí)間逐漸延后，60、90、120 g/L初始葡萄糖發(fā)酵補(bǔ)糖時(shí)間分別比對(duì)照組推遲了2.6、4.5、5.6 h，其中90 g/L的初糖發(fā)酵補(bǔ)糖速率最高峰為8.3 g/（L·h），分別比其他底物葡萄糖添加量提前了6、2、8 h，最高峰補(bǔ)糖速率分別提升了13.2%、6.0%和15.7%。菌體耗糖速率與菌體產(chǎn)酸速率共同決定了糖酸轉(zhuǎn)化率的大小，由圖2可知，90 g/L初始葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)間最早，糖酸轉(zhuǎn)化率最高，且最高糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到了23.2%，平均糖酸轉(zhuǎn)化率為19.6%。

2.1.3 初始葡萄糖添加量對(duì)產(chǎn)酸影響

發(fā)酵結(jié)束后對(duì)主要副產(chǎn)物纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸最終含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3顯示，研究表明90 g/L 的初始葡萄糖發(fā)酵總產(chǎn)物（L-異亮氨酸+纈氨酸+亮氨酸+丙氨酸）、主產(chǎn)物（L-異亮氨酸）、副產(chǎn)物（纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸）都達(dá)到了最高，其L-異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸產(chǎn)量分別為37、6.7、4.3、3.7 g/L，比對(duì)照組分別提高了24.6%、34.0%、34.3%、32.1%。谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸的同時(shí)，副產(chǎn)物也會(huì)協(xié)同增長(zhǎng)，且副產(chǎn)物隨著L-異亮氨酸增多而增多，這為后續(xù)發(fā)酵提取與產(chǎn)品純化帶來(lái)困難[21]。

圖3 初始葡萄糖添加量對(duì)L-異亮氨酸及副產(chǎn)物的影響Fig. 3 Effect of initial glucose concentration on production of L-isoleucine and by-products

2.2 葡萄糖亞適量流加工藝對(duì)L-異亮氨酸的影響

2.2.1 最大補(bǔ)糖速率與葡萄糖亞適量流加工藝對(duì)比

當(dāng)葡萄糖流速率正好與菌體耗糖速率相等時(shí)為最大補(bǔ)糖速率，表觀表現(xiàn)形式為發(fā)酵罐顯示器中實(shí)時(shí)溶氧曲線圍繞一個(gè)定點(diǎn)波浪前進(jìn)，微觀表現(xiàn)形式為用SBA生物傳感分析儀檢測(cè)發(fā)酵上清液顯示葡萄糖質(zhì)量濃度不大于0.2 g/L（理論發(fā)酵上清液葡萄糖含量為0，但流加的葡萄糖不會(huì)被瞬時(shí)消耗，有一個(gè)消耗過(guò)程，會(huì)顯示0.2 g/L延遲誤差）。其最大補(bǔ)糖速率見(jiàn)圖4，為 0（0～8 h）、6.00～8.30（8～14 h）、8.30～7.78（16～24 h）、7.78～5.58 g/（L·h）（24～40 h）。

圖4 葡萄糖亞適量補(bǔ)糖工藝的補(bǔ)糖速率曲線Fig. 4 Suboptimal glucose feeding rate curves with different peak feeding flow rates

在初始葡萄糖添加量提高到90 g/L的基礎(chǔ)上，以最大補(bǔ)糖速率為對(duì)照組，分別依次降低補(bǔ)糖速率為最大補(bǔ)糖速率的90%、80%、70%作為實(shí)驗(yàn)組，探究葡萄糖亞適量補(bǔ)糖工藝對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的影響。最大補(bǔ)糖速率的90%葡萄糖亞適量動(dòng)態(tài)補(bǔ)糖速率為 0（0～8 h）、5.40～7.47（8～14 h）、7.47～7.00（16～24 h）、7.00～5.20 g/（L·h）（24～40 h）。

2.2.2 葡萄糖亞適量流加工藝對(duì)菌體生物量及產(chǎn)酸的影響

由圖5可知，在以最大補(bǔ)糖速率發(fā)酵培養(yǎng)32 h后，菌體死亡率大于存活率，菌體生物量下降，但在3 組葡萄糖亞適量補(bǔ)糖策略下，發(fā)酵后期，菌體生物量一直緩慢增長(zhǎng)，菌體活力旺盛[22]。由菌體生長(zhǎng)曲線可知，0～20 h，飽和葡萄糖消耗有利于菌體生長(zhǎng)，以最大補(bǔ)糖速率發(fā)酵生物量增長(zhǎng)最快，20 h后，最大補(bǔ)糖速率發(fā)酵比生長(zhǎng)速率負(fù)增長(zhǎng)，而90%最大補(bǔ)糖速率發(fā)酵菌體比生長(zhǎng)速率不變，菌體生物量反超，OD600nm達(dá)到了146，比最大補(bǔ)糖速率發(fā)酵最高菌體生物量高了13.26%，最終菌體量提高了30.32%。由L-異亮氨酸過(guò)程增長(zhǎng)曲線可知，隨著補(bǔ)糖速率的降低，菌體產(chǎn)酸量逐漸上升，最終在90%最大補(bǔ)糖速率下達(dá)到了最高，為43.0 g/L；因此，略低的補(bǔ)糖速率有利于菌體產(chǎn)酸，但過(guò)低的補(bǔ)糖速率制約L-異亮氨酸的生成，由產(chǎn)酸曲線可知，亞適量補(bǔ)糖工藝產(chǎn)酸量分別比對(duì)照組提升了16.02%、11.12%、0.05%。

圖5 葡萄糖亞適量流加工藝對(duì)菌體生物量及產(chǎn)酸的影響Fig. 5 Effects of suboptimal glucose feeding on bacterial biomass and acid production

2.2.3 葡萄糖亞適量流加工藝對(duì)副產(chǎn)物生成的影響

谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸中副產(chǎn)物纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸較多，且隨著發(fā)酵時(shí)間推移不斷增長(zhǎng)，超出菌體耐受水平，對(duì)發(fā)酵造成不利的影響。纈氨酸、亮氨酸與L-異亮氨酸同為分支鏈氨基酸，共用多種脫水酶、轉(zhuǎn)氨酶，產(chǎn)酸協(xié)同。圖6為最大補(bǔ)糖速率下副產(chǎn)物過(guò)程曲線，發(fā)酵16 h后，纈氨酸、亮氨酸同時(shí)產(chǎn)生，前期增長(zhǎng)迅速，后期略微減慢，結(jié)束時(shí)分別達(dá)到了6.72、 4.33 g/L；丙氨酸從發(fā)酵開(kāi)始就不斷增長(zhǎng)，且隨著時(shí)間推移，產(chǎn)酸速率逐漸上升。分析發(fā)現(xiàn)，以最大補(bǔ)糖速率發(fā)酵，3 種副產(chǎn)物氨基酸較多，且隨著時(shí)間推移都不斷增長(zhǎng)，不利于長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間的縮短會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵周期短，L-異亮氨酸產(chǎn)量低，但發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，副產(chǎn)物氨基酸增多，轉(zhuǎn)化率下降，提取困難，不利于產(chǎn)品商業(yè)化競(jìng)爭(zhēng)[23]。

圖6 最大補(bǔ)糖速率下副產(chǎn)物速率曲線Fig. 6 Byproduct production at maximum glucose feeding rate

由圖7可知，最大補(bǔ)糖速率由100%降低至70%，各副產(chǎn)物氨基酸積累都有小幅下降。90%、80%、70%最大補(bǔ)糖速率對(duì)比對(duì)照組纈氨酸分別下降了40.05%、52.22%、66.46%，亮氨酸分別下降了40.17%、52.35%、66.22%，丙氨酸分別下降了50%、65%、20%。從發(fā)酵控制方面使副產(chǎn)物氨基酸的生成減少，能達(dá)到代謝流遷移的目的，從而增大合成異亮氨酸的代謝流[24]。

圖7 葡萄糖亞適量工藝產(chǎn)副產(chǎn)物纈氨酸（a）、亮氨酸（b）、 丙氨酸（c）的過(guò)程曲線Fig. 7 Time-course curves of production of by-products including Val (a), Leu (b) and Ala (c) with suboptimal glucose feeding at different peak feeding rates

2.3 葡萄糖添加量與葡萄糖亞適量工藝的協(xié)調(diào)

為協(xié)調(diào)菌體生物量與開(kāi)始產(chǎn)酸時(shí)間對(duì)菌體產(chǎn)酸能力的影響，通過(guò)調(diào)節(jié)初始葡萄糖添加量達(dá)到提前進(jìn)入產(chǎn)酸期的目的，對(duì)初始葡萄糖添加量進(jìn)一步微調(diào)。由圖8可知，在一定范圍內(nèi)，隨著底物葡萄糖添加量的上升，菌體生長(zhǎng)速度加快。在發(fā)酵40 h后，菌體OD600nm分別達(dá)到了130.32、140.25、146.21、153.32，這表示初期高質(zhì)量濃度初始葡萄糖有利于菌體的生長(zhǎng)；由產(chǎn)酸速率可知，在一定范圍內(nèi)，隨著初始葡萄糖添加量的下降，產(chǎn)酸速率逐漸上升，從100 g/L的底物葡萄糖降到80 g/L發(fā)酵，最終產(chǎn)酸達(dá)到44.32 g/L，提高了5.53%。

圖8 90%最大補(bǔ)糖速率下不同初始葡萄糖添加量對(duì)菌體生物量及 L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響Fig. 8 Effects of different initial glucose concentrations on biomass and L-isoleucine yield at glucose feeding rate equal to 90% of maximum feeding rate

谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸采用高質(zhì)量濃度初始葡萄糖發(fā)酵，能夠提高設(shè)備利用率，中后期采用葡萄糖低速流加工藝，可降低滲透壓，使細(xì)胞代謝穩(wěn)定，有利于菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物分泌，特別是對(duì)高生物量發(fā)酵工藝，能提高氧的傳遞速率，提高溶氧水平[25]。

2.4 葡萄糖亞適量工藝對(duì)L-異亮氨酸合成及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的代謝流的影響

以最大補(bǔ)糖速率發(fā)酵為對(duì)照組，90%最大補(bǔ)糖速率為優(yōu)化組，對(duì)比理想代謝流，分析胞內(nèi)各途徑代謝流變化。

2.4.1 6-磷酸-葡萄糖節(jié)點(diǎn)代謝流分析

如圖9a所示，葡萄糖進(jìn)入糖酵解（Embden- Meyerhof-Parnas，EMP）途徑的代謝流為64，比對(duì)照組降低了9.28%；進(jìn)入HMP途徑的代謝流為36，比對(duì)照組提高了19.63%，是理論最大值的36%，葡萄糖經(jīng)HMP和EMP的代謝流之比為0.56。HMP產(chǎn)生的磷酸戊糖全部轉(zhuǎn)化為EMP途徑中的中間產(chǎn)物，同時(shí)為氨基酸的合成提供大量的還原力NADPH，因此提高HMP和EMP的代謝流之比有利于氨基酸的合成[26]。

圖9 L-異亮氨酸代謝流節(jié)點(diǎn)分析Fig. 9 Analysis of metabolic flow nodes for biosynthesis of L-isoleucine

2.4.2 丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點(diǎn)代謝流分析

磷酸烯醇式丙酮酸通過(guò)CO2固定反應(yīng)生成草酰乙酸，而草酰乙酸是合成其他氨基酸的前體，圖9b中，有34.5的磷酸烯醇式丙酮酸通過(guò)CO2固定反應(yīng)形成草酰乙酸，所以有必要增強(qiáng)TCA循環(huán)的回補(bǔ)途徑增強(qiáng)L-異亮氨酸的合成。丙酮酸節(jié)點(diǎn)是一關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，幾種氨基酸的合成以及TCA循環(huán)均需丙酮酸的直接或間接參與。因此，改變丙酮酸節(jié)點(diǎn)外的代謝流分布，使代謝流向L-異亮氨酸的合成方向遷移對(duì)高產(chǎn)L-異亮氨酸具有重要意義[27-29]。從圖9b可以看出，優(yōu)化組丙酮酸流向主代謝途徑乙酰輔酶A代謝流108.6，比對(duì)照組增強(qiáng)了4.1%，流向其他途徑的代謝流，如α-乙酰乳酸、丙氨酸、α-酮異戊酸代謝流分別為38.2、3.0和3.7，比對(duì)照組減弱了5.9%、33.3%和69.2%。

2.4.3 蘇氨酸節(jié)點(diǎn)代謝流分析

如圖9c所示，蘇氨酸作為L(zhǎng)-異亮氨酸的直接前體，優(yōu)化組天冬氨酸進(jìn)入蘇氨酸的代謝流比對(duì)照組增強(qiáng)了18.92，并全部流向L-異亮氨酸的生成，無(wú)蘇氨酸流出。由于TCA循環(huán)的回補(bǔ)途徑的增強(qiáng)，直接導(dǎo)致下游途徑生成天冬氨酸增強(qiáng)，有利于L-異亮氨酸的積累。

2.4.4 天冬氨酸節(jié)點(diǎn)代謝流分析

由于L-異亮氨酸的6 個(gè)碳原子中的4 個(gè)碳原子來(lái)自于天冬氨酸，同時(shí)L-異亮氨酸與蘇氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸一起被稱為天冬氨酸族氨基酸，所以有必要增強(qiáng)天冬氨酸的來(lái)源[30]。優(yōu)化組天冬氨酸進(jìn)入蘇氨酸的代謝流為34.5，比對(duì)照組增強(qiáng)了20.62%，并全部流向蘇氨酸的合成，無(wú)缺陷物質(zhì)賴氨酸積累。

2.4.5α-酮異戊酸節(jié)點(diǎn)代謝流分析

由圖9e可知，α-酮異戊酸是主要副產(chǎn)物纈氨酸、亮氨酸的直接前體，削弱合成來(lái)源，可減少纈氨酸、亮氨酸的積累。優(yōu)化組α-乙酰乳酸進(jìn)入α-酮異戊酸的代謝流為3.7，比對(duì)照組減少了69.25%，進(jìn)入合成Val的代謝流減弱了67.12%，合成亮氨酸的代謝流減弱了72.21%；主要副產(chǎn)物纈氨酸、亮氨酸在理想代謝流分布中為0，說(shuō)明纈氨酸、亮氨酸在整個(gè)代謝過(guò)程中可以完全沒(méi)有[27,31-32]。在L-異亮氨酸發(fā)酵工藝控制中，葡萄糖亞適量是關(guān)鍵因素，發(fā)酵中后期減少葡萄糖供應(yīng)有利于L-異亮氨酸的生成，同時(shí)可抑制纈氨酸、亮氨酸的產(chǎn)生。

3 結(jié) 論

為同時(shí)達(dá)到菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酸能力的最大發(fā)酵性能，需要滿足生產(chǎn)潛能所必需的條件。谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸對(duì)環(huán)境條件的波動(dòng)敏感，本實(shí)驗(yàn)所采用的葡萄糖亞適量流加工藝，可以動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)菌體的“發(fā)酵轉(zhuǎn)換”。在發(fā)酵初始葡萄糖為80 g/L，90%最大補(bǔ)糖速率的亞適量補(bǔ)糖工藝下，得到動(dòng)態(tài)補(bǔ)糖速率為0（0～8 h）、5.40～7.47（8～14 h）、7.47～7.00（16～24 h）、7.00～5.20 g/（L·h）（24～40 h），OD600nm達(dá)到146，比最大補(bǔ)糖速率發(fā)酵提高了13.22%。該工藝優(yōu)化了代謝流通量，從發(fā)酵控制方面使副產(chǎn)物氨基酸的生成減少，達(dá)到代謝流遷移的目的，從而增大合成L-異亮氨酸的代謝流，使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到了44.32 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率提升到19.63%，同時(shí)副產(chǎn)物纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸分別降低到4.02、2.58、1.85 g/L 。