郭亞蕓, 覃冬云, 史紅梅, 吳新穎, 于 毅, 李廷剛,*, 高歡歡,,*
(1. 山東省葡萄研究院, 濟(jì)南 250100; 2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 濟(jì)南 250100)
斑翅果蠅Drosophilasuzukii隸屬雙翅目(Diptera)果蠅科(Drosophilidae),可在櫻桃、楊梅、葡萄等60多種水果剛剛成熟時(shí)產(chǎn)卵于果皮下,卵孵化后以幼蟲(chóng)蛀食為害,果實(shí)逐漸軟化以致變褐腐爛,導(dǎo)致產(chǎn)量下降,是較為重要的果樹(shù)害蟲(chóng)(Goodhueetal., 2011; Milanetal., 2012)。由于斑翅果蠅在世界分布廣泛,于2013年被列為檢驗(yàn)檢疫害蟲(chóng),因此該蟲(chóng)的防治亟待解決。
腸道微生物在昆蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)發(fā)育以及適應(yīng)性方面均有重要的作用(Amietal., 2010; Gavrieletal., 2011; Engel and Moran, 2013)。通過(guò)宏基因組微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn),果蠅腸道中的核心菌群主要包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、醋桿菌科(Acetobacteraceae)和乳桿菌科(Lactobacillaceae)的細(xì)菌。如黑腹果蠅腸道中的植物乳桿菌Lactobacillusplantarum和醋酸菌Acetobactermalorum可增加黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的產(chǎn)卵量、取食量以及體重(Qiaoetal., 2019);斑翅果蠅腸道中的乳酸菌屬Lactobacillus, 明串珠菌屬Leuconostoc, 乳球菌屬Lactococcus, 叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)可為斑翅果蠅提供生長(zhǎng)發(fā)育所需要的關(guān)鍵蛋白質(zhì)(Bingetal., 2018)。通過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),斑翅果蠅腸道內(nèi)比較穩(wěn)定的細(xì)菌種類(lèi)包括產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca、弗氏檸檬酸桿菌Citrobacterfreundii、金黃桿菌屬Chryseobacteriumsp.、形賴(lài)氨酸芽孢桿菌Lysinibacillusfusiformis(高歡歡等, 2017),其中產(chǎn)酸克雷伯氏菌和弗氏檸檬酸桿菌與斑翅果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育以及氨基酸、糖原等物質(zhì)的代謝密切相關(guān)(高歡歡等, 2020)。
在長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中,昆蟲(chóng)對(duì)有利于自身生長(zhǎng)發(fā)育的腸道微生物產(chǎn)生了一定的趨向性,具體表現(xiàn)為取食和產(chǎn)卵等行為的變化。如,黑腹果蠅成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)對(duì)添加腸道微生物的培養(yǎng)基具有更強(qiáng)烈的趨性(Qiaoetal., 2019);桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis腸道細(xì)菌蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus、糞腸球菌Enterococcusfaecalis、陰溝腸桿菌Enterobactercloacae和弗氏檸檬酸桿菌均對(duì)桔小實(shí)蠅成蟲(chóng)具有吸引作用(Wangetal., 2013);將產(chǎn)酸克雷伯氏菌與棕櫚糖混合后作為食誘劑可吸引更多的瓜實(shí)蠅Bactroceracucurbitae和南瓜實(shí)蠅B.tau(Soodetal., 2010)。多項(xiàng)研究表明,腸道微生物之所以具有吸引寄主昆蟲(chóng)的作用,是因?yàn)槠洚a(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物質(zhì)可以調(diào)控寄主昆蟲(chóng)的化學(xué)通訊(Sacchettietal., 2014)。例如,腸道微生物肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae和弗氏檸檬酸桿菌釋放的3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、苯酚和2,5-二甲基吡嗪等物質(zhì)對(duì)墨西哥果蠅Anastrephaludens具有明顯的吸引作用;變形桿菌屬細(xì)菌Proteussp.釋放的正丁醇和丁酮可吸引昆士蘭實(shí)蠅Bactroceratryoni取食和產(chǎn)卵(Leroyetal., 2011)。
對(duì)寄主昆蟲(chóng)具有引誘作用的腸道微生物可用于害蟲(chóng)的防治(Soodetal., 2010),但目前斑翅果蠅腸道中的微生物對(duì)其是否具有吸引作用以及何種揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)揮作用均未有相關(guān)報(bào)道。因此,本研究以斑翅果蠅的腸道細(xì)菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌作為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)斑翅果蠅成蟲(chóng)的趨性研究以及菌液中揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè),尋找對(duì)斑翅果蠅成蟲(chóng)具有吸引作用的化學(xué)物質(zhì),為斑翅果蠅的防治提供重要的指導(dǎo)。
斑翅果蠅來(lái)源于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的實(shí)驗(yàn)室種群,該種群飼養(yǎng)于溫度25±0.5℃、相對(duì)濕度70%±0.5%、光周期16L∶8D的人工氣候室中。飼喂以香蕉、蘋(píng)果、玉米粉、蔗糖、酵母、防腐劑為主要成分的人工飼料,此為正常飼養(yǎng)的斑翅果蠅品系。產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株為山東省葡萄研究院自存的菌株。
將產(chǎn)酸克雷伯氏菌劃線活化后,挑取單菌落置于裝有100 mL NB培養(yǎng)液的250 mL的三角瓶中25℃搖菌72 h,使菌體進(jìn)行充分的生長(zhǎng)和代謝。取80 mL菌懸液5 000 r/min離心10 min,經(jīng)0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾,其上清液用于誘集斑翅果蠅成蟲(chóng);以無(wú)菌的NB培養(yǎng)基上清液為對(duì)照。
將1 mL產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液和NB培養(yǎng)基的上清液分別滴在雙層濾紙紙盤(pán)上(直徑為9 cm),放置于長(zhǎng)×寬×高=45 cm×45 cm×45 cm籠子的兩個(gè)對(duì)角處。將200頭斑翅果蠅成蟲(chóng)饑餓12 h后釋放至籠子中心,雌雄比例為1∶1,10 min后記錄濾紙上引誘的斑翅果蠅的成蟲(chóng)數(shù)量及雌雄比例,重復(fù)3次,此為無(wú)寄主植物時(shí)的選擇性試驗(yàn)。另吸取1 mL產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液和培養(yǎng)基上清液分別滴在放置有半個(gè)巨峰葡萄的塑料培養(yǎng)皿(直徑為3.5 cm)中,方法同上,此為有寄主植物作為介質(zhì)時(shí)的選擇性試驗(yàn)。
將產(chǎn)酸克雷伯氏菌劃線活化后,挑取單菌落置于裝有100 mL NB培養(yǎng)液的250 mL的三角瓶中25℃搖菌72 h,取菌懸液5 000 r/min離心10 min,經(jīng)0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾,得到上清液后利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-2010 ULTRA及工作站(Shimadzu 公司,日本)進(jìn)行固相微萃取實(shí)驗(yàn),以NB培養(yǎng)基的上清液為對(duì)照。取8 mL產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液放置于15.0 mL樣品瓶中,加入磁力攪拌子、2.0 g氯化鈉和1 μL濃度為2.01 mg/L 99.99%的2-辛醇(Sigma,美國(guó))作為內(nèi)標(biāo),用帶聚四氟乙烯膠墊的瓶蓋封閉,啟動(dòng)磁力攪拌器(PC-420D型,Supelco公司,美國(guó)),設(shè)定轉(zhuǎn)速為850 r/min,在30℃下平衡10 min,通過(guò)隔墊插入萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS, Supelco 公司,美國(guó)),萃取30 min,插入GC-MS進(jìn)樣口解吸10 min,進(jìn)行GC-MS分析,重復(fù)5次。
GC條件:高純氦氣,不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣口溫度250℃,柱溫采用程序升溫:起始柱溫40℃,以5℃/min升至170℃,保持3 min,以8℃/min升溫至230℃,保持4.5 min,恒流模式,流量: 1.8 mL/min。MS條件:色譜-質(zhì)譜接口溫度:250℃,離子源溫度:200℃,電離模式:電子轟擊源(EI),轟擊能量:70 eV,全掃描模式,質(zhì)量數(shù)范圍m/z 30~500。
通過(guò)質(zhì)譜譜庫(kù)檢索與NIST 11和NIST 11S質(zhì)譜庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比對(duì)定性,匹配度大于80%的物質(zhì)作為化合物定性結(jié)果,采用半定量方法對(duì)各組分進(jìn)行定量分析(陶永勝等, 2008)。
選擇1.3節(jié)鑒定到的4種含量較高的產(chǎn)酸克雷伯氏菌揮發(fā)性物質(zhì)用于斑翅果蠅的趨性實(shí)驗(yàn)。用Y型嗅覺(jué)儀(主臂15 cm,側(cè)臂10 cm,內(nèi)經(jīng)2 cm,兩側(cè)臂間夾角30°)對(duì)斑翅果蠅趨性反應(yīng)進(jìn)行觀察。兩側(cè)臂端分別接200 mL廣口瓶,分別用特氟龍軟管連接大氣采樣儀,進(jìn)行送氣處理。光強(qiáng)度:1 500 lx;流速:200 L/min;溫度: 24±1℃;相對(duì)濕度:60%~70%(劉燕等, 2018)。吸取10 μL揮發(fā)性物質(zhì)滴于圓形濾紙片(直徑1.5 cm)上,置入Y型嗅覺(jué)儀其中一個(gè)側(cè)臂廣口瓶?jī)?nèi),另一側(cè)臂廣口瓶?jī)?nèi)以水滴于圓形濾紙片作為對(duì)照,將20頭斑翅果蠅成蟲(chóng)(雌雄比為1∶1)置于主臂端,在側(cè)臂端進(jìn)行送氣(100 mL/min),30 min后統(tǒng)計(jì)兩側(cè)臂成蟲(chóng)數(shù)量。重復(fù)10次。
產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液和NB培養(yǎng)基上清液對(duì)斑翅果蠅的誘集比例按如下公式進(jìn)行計(jì)算:
誘集比例(%)=
本研究中所得的數(shù)據(jù)均采用T檢驗(yàn)分析,顯著水平為0.05。數(shù)據(jù)分析所用的軟件為SPSS20.0。
無(wú)論寄主是否存在,產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液對(duì)斑翅果蠅成蟲(chóng)的誘集比例均顯著高于NB培養(yǎng)基上清液的(圖1)。無(wú)寄主植物條件下,產(chǎn)酸克雷伯氏菌對(duì)斑翅果蠅成蟲(chóng)的誘集比例是NB培養(yǎng)基的5.11倍(產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液: 51.75%±6.22%; NB培養(yǎng)基上清液: 10.13%±0.03%)(T=-6.699,P=0.02)。有寄主作為介質(zhì)時(shí),產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液對(duì)斑翅果蠅成蟲(chóng)的誘集比例是35.78%±4.05%,顯著高于NB培養(yǎng)基上清液的(13.78%±0.77%)(T=-4.893,P=0.04),但與無(wú)寄主植物條件下相比差距有所減少。
圖1 產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液對(duì)斑翅果蠅成蟲(chóng)的引誘效果Fig. 1 Attractiveness of Klebsiella oxytoca supernatant to Drosophila suzukii adultsCK: NB培養(yǎng)基Nutritional broth medium. 本實(shí)驗(yàn)使用的寄主植物為半個(gè)巨峰葡萄。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;柱上星號(hào)表示產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液的引誘比例與NB培養(yǎng)基的比較差異顯著(P<0.05, T檢驗(yàn))。Half Kyoho grape was used as the host plant in this experiment. Data in this figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference in the attractive proportion between K. oxytoca supernatant and nutritional broth (NB) medium (P<0.05, T-test).
由圖2可知,無(wú)論寄主植物是否存在,產(chǎn)酸克雷伯菌對(duì)斑翅果蠅雌雄成蟲(chóng)的影響不同。無(wú)寄主植物的條件下,產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液引誘到的斑翅果蠅雄蟲(chóng)的數(shù)量為58.00±4.19頭,顯著高于引誘到的雌蟲(chóng)的數(shù)量(37.33±4.67)(T=1.57,P=0.044),而NB培養(yǎng)基引誘到的斑翅果蠅雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)數(shù)量并沒(méi)有顯著差異(P>0.05)(圖2: A)。有寄主植物的條件下,NB培養(yǎng)基和產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液對(duì)斑翅果蠅雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)的引誘均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)(圖2: B)。
圖2 產(chǎn)酸克雷伯菌上清液對(duì)不同性別斑翅果蠅雌雄成蟲(chóng)的引誘作用Fig. 2 Attractiveness of Klebsiella oxytoca supernatant to female and male adults of Drosophila suzukiiA: 無(wú)寄主植物Without host plant; B: 有寄主植物With host plant. 1: NB培養(yǎng)基(對(duì)照)Nutritional broth medium (control); 2: 產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液 K. oxytoca supernatant. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;柱上星號(hào)表示同一處理誘集到的雌雄成蟲(chóng)數(shù)量之間的差異顯著(P<0.05, T檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the number of female and male adults attracted by the same treatment (P<0.05, T-test).
產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液中檢測(cè)到21種揮發(fā)性物質(zhì)(表1)。在對(duì)照NB培養(yǎng)基上清液中檢測(cè)到12種與產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液中相同的揮發(fā)性物質(zhì),其中吲哚、乙酸異戊酯、乙醇、2,4-二叔丁基苯酚、苯甲醛、甲氧基苯肟、乙酸、1-辛醇、1-己醇和苯酚等10種揮發(fā)性物質(zhì)的濃度均顯著低于產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液中的濃度,另外2種揮發(fā)性物質(zhì)2,5-二甲基吡嗪和2,4-二甲基苯甲醛的濃度在產(chǎn)酸克雷伯氏上清液和對(duì)照NB培養(yǎng)基上清液中差異不顯著,但濃度均較低(表1)。而在產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液特有的揮發(fā)性物質(zhì)中,濃度較高的為3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇。因此,選擇3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇以及與培養(yǎng)基中的濃度差異較為顯著的吲哚和乙酸異戊酯這4種物質(zhì)作為產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液的主要揮發(fā)性物質(zhì),用于檢驗(yàn)對(duì)斑翅果蠅的趨性。
表1 產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液和NB培養(yǎng)基上清液中的揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 1 The contents of volatile substances in the supernatant of Klebsiella oxytoca and NB medium
斑翅果蠅對(duì)4種產(chǎn)酸克雷伯氏菌揮發(fā)性物質(zhì)中的3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇和吲哚均有一定的趨向性,其中吲哚引誘到的斑翅果蠅比例最高,為50.00%±12.25%(T=3.06,P=0.02),3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇引誘到的斑翅果蠅分別為總數(shù)的28.33%±4.77%和23.33%±6.67%,均顯著高于水引誘的(3-甲基-1-丁醇:T=-3.15,P=0.01; 2-苯乙醇:T=2.28,P=0.04)。乙酸異戊酯對(duì)斑翅果蠅則具有驅(qū)避作用,引誘到斑翅果蠅的比例為21.11%±3.09%,而35.71%±6.12%的斑翅果蠅選擇了水端口(圖3: A)。3-甲基-1-丁醇吸引到的雄蟲(chóng)數(shù)量是吸引到雌蟲(chóng)數(shù)量的2.4倍,2-苯乙醇、吲哚和乙酸異戊酯對(duì)斑翅果蠅雌雄蟲(chóng)的引誘作用沒(méi)有明顯的差別,雌雄蟲(chóng)比例均在50%左右(圖3: B)。
圖3 產(chǎn)酸克雷伯氏菌4種揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)斑翅果蠅成蟲(chóng)的引誘作用(A)和被引誘成蟲(chóng)的雌雄比例(B)Fig. 3 Attractiveness (A) of four volatile substances of Klebsiella oxytoca to Dlebsiella suzukii adults and the proportions of female and male adults attracted (B)1: 3-甲基-1-丁醇3-Methyl-1-butyl alcohol; 2: 2-苯乙醇2-Phenethyl alcohol; 3: 乙酸異戊酯Isoamyl acetate; 4: 吲哚Indole. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;柱上星號(hào)表示揮發(fā)性物質(zhì)處理組與水處理組(對(duì)照)之間差異顯著(P<0.05, T檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the volatile substance treatment group and the water treatment group (control)(P<0.05, T-test).
本研究以斑翅果蠅的優(yōu)勢(shì)腸道細(xì)菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌為研究對(duì)象,證明此菌對(duì)斑翅果蠅的成蟲(chóng)具有吸引作用。產(chǎn)酸克雷伯氏菌在瓜實(shí)蠅、蔥地種蠅Deliaantiqua、桔小實(shí)蠅等其他昆蟲(chóng)的腸道中均屬于豐富度相對(duì)較高的菌種,且對(duì)寄主昆蟲(chóng)具有吸引作用(Damodarametal., 2016; Hadapadetal., 2016; Guoetal., 2017),這與本研究的結(jié)果一致。腸道微生物在代謝過(guò)程中可釋放特定的揮發(fā)性物質(zhì),從而對(duì)昆蟲(chóng)具有吸引作用。在瓜實(shí)蠅腸道細(xì)菌肺炎克雷伯氏菌上清液中檢測(cè)到的3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇可吸引瓜實(shí)蠅雌蟲(chóng)完成交配行為,腸道細(xì)菌腸桿菌Enterobacteragglomerans和弗氏檸檬酸桿菌中檢測(cè)到了具有吸引作用的3-甲基-1-丁醇(Hadapadetal., 2016)。本研究中,斑翅果蠅腸道中產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液中也檢測(cè)到3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇,并且已證明對(duì)斑翅果蠅成蟲(chóng)具有引誘作用(圖3)。與已報(bào)道的研究結(jié)果不同的是,產(chǎn)酸克雷伯氏菌揮發(fā)性物質(zhì)中對(duì)斑翅果蠅具有吸引作用的還有吲哚,而乙酸異戊酯對(duì)斑翅果蠅則具有驅(qū)避作用(圖3)。由此說(shuō)明,產(chǎn)酸克雷伯氏菌對(duì)斑翅果蠅的吸引作用與3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、吲哚密切相關(guān),而本研究中3-甲基-1-丁醇可引誘更多的斑翅果蠅的雄蟲(chóng),這可能是產(chǎn)酸克雷伯氏菌能吸引更多雄蟲(chóng)的原因。
同時(shí),本研究也分析了寄主植物對(duì)斑翅果蠅吸引作用的影響,無(wú)寄主植物的條件下,產(chǎn)酸克雷伯氏菌對(duì)雄成蟲(chóng)的吸引作用強(qiáng)于對(duì)雌成蟲(chóng)的(圖2),而有寄主植物干擾的條件下,微生物對(duì)性別的影響并未有明顯差異(圖2)。這可能是因?yàn)榧闹髦参镏泻械目蓳]發(fā)性物質(zhì)會(huì)干擾斑翅果蠅對(duì)氣味的識(shí)別,寄主植物中的乙酸異戊酯可吸引斑翅果蠅產(chǎn)卵取食(Revadietal., 2015),而本研究中產(chǎn)酸克雷伯氏菌的揮發(fā)性物質(zhì)乙酸異戊酯對(duì)斑翅果蠅則具有驅(qū)避作用(圖3)。另外,果蠅的行為還可被寄主植物中的其他多種化合物影響。例如,果蠅Drosophilasechellia對(duì)桑葚中的正己酸具有強(qiáng)烈的趨向性,黑腹果蠅、擬果蠅D.simulans和伊米果蠅D.immigrans均對(duì)水果中的發(fā)酵化合物以及濃度較高的乙醇具有趨向性(Ibbaetal., 2010)。寄主水果藍(lán)莓、草莓、櫻桃等水果中的揮發(fā)性物質(zhì)己醛、2-庚酮、反式-2-己烯醛和芳樟醇可以影響斑翅果蠅雌蟲(chóng)的定向和產(chǎn)卵行為(劉燕等, 2018; 蔡普默等, 2019)。因此,斑翅果蠅腸道微生物的揮發(fā)性物質(zhì)與寄主揮發(fā)物之間是否存在互作,兩者會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用還是拮抗作用需要進(jìn)一步的研究。
已有研究證明,對(duì)昆蟲(chóng)具有吸引作用的微生物可以作為誘劑用于寄主昆蟲(chóng)的防治(Soodetal., 2010)。但目前用于誘殺斑翅果蠅的方法中主要集中于利用酵母、糖水、醋、酒精等的混合物的物理誘殺(Iglesiasetal., 2014; 王云鵬等, 2018; 馬茜, 2019),并沒(méi)有利用腸道微生物及其揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行誘殺的報(bào)道。因此,本研究的結(jié)果為斑翅果蠅的防治提供了新的誘劑,而斑翅果蠅的腸道微生物產(chǎn)酸克雷伯氏菌或者揮發(fā)性物質(zhì)3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇和吲哚作為誘劑時(shí),對(duì)斑翅果蠅的防治效果需要繼續(xù)進(jìn)行研究和驗(yàn)證。此項(xiàng)研究將為降低斑翅果蠅的為害率、提高果實(shí)品質(zhì)提供新的方法。