韓陽，李曉東

（沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

皮膚表面定植著大量的菌群（包括細菌、真菌、古細菌等），皮膚表面的菌群受宿主的免疫狀態(tài)、遺傳易感性、皮膚屏障狀態(tài)及菌群相互作用等多因素調(diào)控，在共生性和致病性間轉(zhuǎn)化。菌群與宿主之間的相互作用可參與多種皮膚疾病的發(fā)生與發(fā)展[1]。馬拉色菌與葡萄球菌是皮膚常住菌群，研究發(fā)現(xiàn)馬拉色菌可誘導(dǎo)多種宿主細胞分泌不同的細胞因子介導(dǎo)炎性反應(yīng)。Baroni等[2]發(fā)現(xiàn)，馬拉色菌可與角質(zhì)形成細胞表面Toll樣受體（TLR）2結(jié)合，誘導(dǎo)白細胞介素（IL）等細胞因子的分泌。不同種類的馬拉色菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞因子也不相同，其中，厚皮馬拉色菌、合軸馬拉色菌和斯洛菲馬拉色菌與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清中可測到IL-6、IL-1β、IL-8和腫瘤壞死因子（TNF）-α的表達。經(jīng)厚皮馬拉色菌刺激后，角質(zhì)形成細胞分泌的細胞因子水平最高[3]。這些細胞因子在角質(zhì)形成細胞的形態(tài)學(xué)改變和細胞調(diào)亡過程中扮演重要角色，可能參與馬拉色菌相關(guān)皮膚疾病作用的發(fā)生。葡萄球菌存在于皮膚表面，其作為一種微生物群的功能尚未得到廣泛的研究。近幾年研究表明，葡萄球菌細胞壁及細胞質(zhì)膜的成分—脂磷壁酸（Staphylococcal lipoteichoic acid，LTA）可參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[4]。磷壁酸是革蘭氏陽性菌細胞壁重要組分，是由核糖醇和甘油殘基經(jīng)由磷酸二鍵相互連接而形成的多聚物，帶有弱酸性，占細胞壁質(zhì)量的10%～50%，根據(jù)磷壁酸在細胞壁表面上的結(jié)合部位可以分為2種類型，膜磷壁酸和壁磷壁酸，膜磷壁酸又稱作LTA[5]。葡萄球菌LTA可抑制多種炎性反應(yīng)的發(fā)生[6-7]，但其對馬拉色菌誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)有無影響尚不清楚。本研究首先觀察糠秕馬拉色菌對角質(zhì)形成細胞細胞因子的表達的影響，進一步探究葡萄球菌LTA對于對糠秕馬拉色菌引起炎性因子的表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人角質(zhì)形成細胞系（HaCaT細胞）購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，糠秕馬拉色菌（ATCC?14521TM）購于美國ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰酶（美國 HyClone公司），Cell Proliferation Assay、miRNeasy Mini Kit試劑盒、GoScript?Reverse Transcription System、GoTaq?qPCR Master Mix（美國 Promega公司），RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（上海碧云天公司），預(yù)制膠、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（6×）、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、NuPAGE?MES（20×）、NuPAGE?LDS Sample Buffer（4×）、NuPAGE?Reducing Agent（10×）、半干轉(zhuǎn)膜、ECL（美國 Life Technologies公司），Protein Ladder（美國Thermo公司），10XTBST（上海生工公司），脫脂奶粉（美國BD公司），Human IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）Kit、Human IL-1β ELISA Kit（美國 R&D Systems公司），葡萄球菌LTA購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT細胞培養(yǎng) ①復(fù)蘇：液氮中取出凍存的細胞，快速放入37℃的水浴中，不?；蝿?，使其快速解凍。

②將細胞懸液移入離心管中，加等體積的DMEM培養(yǎng)基，室溫離心1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心3 min，棄上清液，重懸細胞沉淀，計數(shù)后移入培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2靜置培養(yǎng)。

③細胞長滿瓶底70%左右時，胰酶消化并傳代細胞。

④以3×105個細胞/孔接種到6孔板中，分3組，分別為對照組、糠秕馬拉色菌處理組、LTA和糠秕馬拉色菌處理組。每組3個附孔，待細胞貼壁后換液（培養(yǎng)基不含抗生素），LTA和糠秕馬拉色菌處理組細胞換含有20 μg/mL LTA的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h。

⑤棄上清，PBS洗2次，準(zhǔn)備與糠秕馬拉色菌共培養(yǎng)，對照組直接加入細胞培養(yǎng)基。

1.2.2 糠秕馬拉色菌與HaCaT細胞共培養(yǎng) 將糠秕馬拉色菌接種于改良Dixon培養(yǎng)基，傳代后培養(yǎng)72 h用血細胞計數(shù)儀計數(shù)，無菌PBS洗2次后，用細胞培養(yǎng)基重懸糠秕馬拉色菌，按細胞與糠秕馬拉色菌（10∶1）比例將糠秕馬拉色菌加入到LTA和糠秕馬拉色菌處理和糠秕馬拉色菌處理組中，與HaCaT細胞共培養(yǎng)。

1.2.3 單溶液細胞增殖檢測試劑盒（MTS）檢測細胞活性 ①取對數(shù)生長期的HaCaT細胞，接種于96孔板中，每孔約為5×103個細胞，共4組，每組細胞5個復(fù)孔。重復(fù)4次，即共接種于4塊96孔板中，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜。細胞貼壁后，加入不同濃度比例（糠秕馬拉色菌與HaCaT細胞的比例為 20∶1、10∶1、5∶1）的糠秕馬拉色菌。分別于培養(yǎng)后的第0、1、2、3天進行檢測，加入MTS溶液20μL，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。

②另取對數(shù)生長期的HaCaT細胞，接種于96孔板中，每孔約為5×103個細胞，共2組，每組細胞5個復(fù)孔。重復(fù)4次，即共接種于4塊96孔板中，與5%CO2，37℃常規(guī)培養(yǎng)過夜，細胞貼壁后，實驗組每孔加入20 μg/mL LTA。分別于培養(yǎng)后的第0、6、12、24 h 進行檢測，加入 MTS 溶液 20 μL，5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。

③檢測吸光度OD490nm值。

1.2.4 RNA的提取 ①向?qū)φ战M、糠秕馬拉色菌處理組、LTA和糠秕馬拉色菌處理組細胞中加入QIAzol?lysis裂解液，每孔 700 μL，震蕩混勻后室溫靜置5 min。

②繼續(xù)加入140 μL氯仿，渦旋混合震蕩15 s，室溫孵育靜置3 min。

③4℃ 12 000 r/min，離心半徑 10 cm，離心15 min。

④將上層水相移入另一個新的EP管中，加入525 μL無水乙醇，充分混勻。

⑤吸取700 μL液體移置RNeasy Mini柱中，室溫離心8 000 r/min，離心半徑10 cm，離心15 s，棄廢液。

⑥重復(fù)上述步驟，將剩余樣品全部轉(zhuǎn)移至過濾柱內(nèi)。

⑦加入700 μL Buffer RWT，室溫離心10 000 r/min，離心半徑10 cm，離心15 s，棄廢液。

⑧加入500μL Buffer RPE，室溫離心8000r/min，離心半徑10 cm，離心15 s，棄廢液。

⑨重復(fù)步驟⑧，室溫離心1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心 2 min。

⑩將離心柱放入新的收集管，12 000 r/min，離心半徑10 cm，離心1 min。

[11]將離心柱置入新的去RNA酶EP管，加40μL RNase free H2O，10 000 r/min，離心半徑 10 cm，離心1 min。

[12]測定其濃度及純度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ①逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表1。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

RT-Mix配好后，混勻，每份RNA樣本加入12μL RT-Mix，用Nuclease-Free Water將體系補足至20μL。

②反應(yīng)條件：

延伸 42℃ 15 min

反轉(zhuǎn)錄酶滅活 70℃ 15 min

cDNA臨時存儲 4℃

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Rt-PCR） 采用SYBR-Green法進行RT-PCR擴增。

①引物設(shè)計見表2。

表2 引物序列

②熒光實時定量反應(yīng)體系見表3。

表3 PCR反應(yīng)體系

③RT-PCR反應(yīng)條件：

95℃ 2 min

95℃ 15 s 40個循環(huán)

60℃ 2 min

④溶解曲線。

1.2.7 ELISA ①從已經(jīng)平衡至室溫的密封袋中取出微孔板。

②先將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度的工作液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線中的濃度加入孔中。分別將對照組、糠秕馬拉色菌處理組、LTA和糠秕馬拉色菌處理組細胞的培養(yǎng)上清加入孔中，每組3個附孔，每孔100 μL，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2 h。

③將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌劑400 μL，然后板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作4次。

④在每個微孔內(nèi)加入200 μL酶標(biāo)檢測抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2 h。

⑤重復(fù)洗板操作。

⑥在每個微孔內(nèi)加入200 μL顯色底物，室溫孵育20 min。在每個微孔內(nèi)加入50 μL終止液1，孔內(nèi)溶液顏色會藍色變?yōu)辄S色。

⑦加入終止液1后20 min內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測量OD450nm值，設(shè)定OD540nm作為校正波長。

⑧每一個標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的復(fù)孔校正吸光值（OD450nm-OD540nm）取平均值，再減去標(biāo)準(zhǔn)曲線零點的OD值。繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)曲線點的人細胞因子的濃度值，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)曲線點的OD平均值。通過樣本的OD值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到檢測樣本中細胞因子的濃度。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Priam 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析及圖表繪制，每組樣本采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）來表示，2組比較采用非配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糠秕馬拉色菌及LTA對HaCaT細胞細胞活性的影響 MTS實驗結(jié)果顯示，當(dāng)共培養(yǎng)的糠秕馬拉色菌與HaCaT細胞比例在20∶1以下時，糠秕馬拉色菌對HaCaT細胞活性無明顯影響。當(dāng)糠秕馬拉色菌與HaCaT比例達到20∶1時，會抑制HaCaT細胞的細胞活性，特別是在共培養(yǎng)后的第1天（P＜0.05），在共培養(yǎng)的第2天及第3天，HaCaT細胞活性下降（P＞0.05），見圖1A。由于糠秕馬拉色菌與HaCaT細胞比例在10∶1共培養(yǎng)時，對細胞活性無影響，筆者選擇10∶1（糠秕馬拉色菌：HaCaT）這個比例進行后續(xù)實驗。

圖1A 糠秕馬拉色菌對HaCaT細胞活的影響

通過MTS實驗發(fā)現(xiàn)，與正常培養(yǎng)的細胞相比，20 μg/mL的LTA對HaCaT細胞的細胞活性在作用的24 h內(nèi)無影響，見圖1B，故采用該濃度進行后續(xù)實驗。

圖1B 20 μg/mL的LTA對HaCaT細胞的細胞活性影響

2.2 糠秕馬拉色菌對HaCaT細胞炎性因子表達的影響 將糠秕馬拉色菌與HaCaT細胞按照10∶1的比例共培養(yǎng)后，在 1、2、4、8、12、24 h 提取 mRNA。Rt-PCR結(jié)果顯示HaCaT細胞細胞因子TNF-α mRNA表達水平在8 h下降（P＜0.05）。IL-8 mRNA表達水平在8 h升高，在24 h升高約4倍（P＜0.001）。IL-6 mRNA表達水平在1 h升高約6倍（P＜0.01），之后逐漸下降。IL-1β mRNA 表達水平在1 h（P＜0.05）和2 h升高約2倍（P＜0.01），見圖2。綜上，筆者發(fā)現(xiàn)糠秕馬拉色菌可在1 h內(nèi)誘導(dǎo)HaCaT細胞細胞因子IL-6及IL-1β mRNA表達上調(diào)。

圖2 糠秕馬拉色菌對HaCaT細胞細胞因子（TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β）mRNA表達的影響

2.3 葡萄球菌LTA抑制糠秕馬拉色菌誘導(dǎo)的IL-6及IL-1β mRNA表達 HaCaT細胞經(jīng)過LTA預(yù)處理12 h后，將糠秕馬拉色菌加入，共培養(yǎng)1h后檢測HaCaT細胞IL-6及IL-1β mRNA表達。結(jié)果顯示，與糠秕馬拉色菌處理組相比，LTA和糠秕馬拉色菌處理組HaCaT細胞IL-6及IL-1β mRNA的表達下降（P＜0.05），見圖3。

圖3 LTA對糠秕馬拉色菌誘導(dǎo)IL-6（A）及IL-1β（B）mRNA表達的影響

2.4 糠秕馬拉色菌和LTA對HaCaT細胞上清中IL-6及IL-1β分泌的影響 通過ELISA方法檢測上清細胞因子，與正常培養(yǎng)的HaCaT細胞相比，糠秕馬拉色菌可以誘導(dǎo)HaCaT細胞分泌IL-6。在糠秕馬拉色菌與HaCaT細胞共培養(yǎng)的第4 h，IL-6濃度最高（P＜0.001）。經(jīng)過LTA預(yù)處理的HaCaT細胞，與糠秕馬拉色菌共培養(yǎng)后，與糠秕馬拉色菌處理組相比較，IL-6分泌明顯減少（P＜0.001），見圖4A。在糠秕馬拉色菌與HaCaT細胞共培養(yǎng)的多個時間點提取的上清中，前12 h未能檢測到IL-1β的分泌。在共培養(yǎng)24 h后，可以檢測到IL-1β低濃度的分泌，見圖4B。

圖4A LTA和糠秕馬拉色菌（10∶1）對HaCaT細胞分泌的IL-6的影響（M.furfur為糠秕馬拉色菌）

圖4B LTA和糠秕馬拉色菌（10∶1）對HaCaT細胞分泌的IL-1β的影響（M.furfur為糠秕馬拉色菌）

3 討論

馬拉色菌是人體和溫血動物皮膚表面的常住菌，也是一種條件致病菌。盡管馬拉色菌的致病機制還沒有被完全揭開，目前獲得較多支持的2種學(xué)說是：①以脂肪酶為媒介發(fā)揮致病作用。②誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生炎性因子介導(dǎo)炎性反應(yīng)。馬拉色菌可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生多種細胞因子，參與介導(dǎo)炎性反應(yīng)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，糠秕馬拉色菌可在短時間內(nèi)誘導(dǎo)HaCaT細胞IL-6和IL-1β mRNA表達上調(diào)，共培養(yǎng)8 h后可以上調(diào)IL-8 mRNA表達，共培養(yǎng)后的上清中可檢測到IL-6分泌增多。IL是一個有α螺旋結(jié)構(gòu)、22～28 kDa磷酸化和不同程度糖基化的多功能細胞因子，在疾病急性期反應(yīng)、炎性反應(yīng)、造血、骨代謝以及癌癥惡化等方面起重要作用[9]。IL-6與TNF-α和IL-1一同可引起急性炎性反應(yīng)。IL-1β是一種重要的介導(dǎo)炎性因子的細胞因子，可由人的HaCaT細胞大量表達，在皮膚的免疫應(yīng)答中處于較上游的環(huán)節(jié)，可以誘導(dǎo)多種趨化因子的合成，并可加強T細胞增殖和B細胞生長與分化，有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用[10-11]。IL-8是一種常見的炎性因子和趨化因子，其可趨化中性粒細胞或單核細胞參與局部炎性反應(yīng)[12]。筆者研究發(fā)現(xiàn)糠秕馬拉色菌與HaCaT細胞共培養(yǎng)后可誘導(dǎo)HaCaT細胞多種炎性因子表達上調(diào)。葡萄球菌是在人體皮膚表面的定植的正常菌群，其與皮膚之間存在著緊密的聯(lián)系。表皮葡萄球菌細胞壁的LTA成分，在多種疾病中發(fā)揮抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌LTA能夠激活角質(zhì)形成細胞的TLR2產(chǎn)生腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）1，其可被TLR3激活的絲氨酸蛋白酶Caspase-8切割并釋放出有活性的N端（N）-TRAF1，N-TRAF1可與TLR3信號通路中的關(guān)鍵分子Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域接頭分子（TRIF）相結(jié)合，發(fā)揮抑制TLR3信號通路的作用，從而減輕創(chuàng)傷部位TLR3引起的炎性因子[6]。Xia等[7]研究發(fā)現(xiàn)在痤瘡發(fā)病中，痤瘡丙酸桿菌通過誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞TLR2表達促進IL-6和TNF-α的表達，引起炎性反應(yīng)，而表皮葡萄球菌LTA可以在激活TLR2表達的同時，通過高表達的TLR2誘導(dǎo)miR-143表達，miR-143靶向作用于 TLR2的3’-非翻譯區(qū)（3’UTR），降低TLR2 mRNA的穩(wěn)定性，最終抑制TLR2表達，減輕痤瘡丙酸桿菌通過TLR2引起的細胞因子的表達，減輕炎性反應(yīng)。通過本研究，筆者發(fā)現(xiàn)葡萄球菌LTA可以抑制糠秕馬拉色菌誘導(dǎo)的炎性因子IL-6、IL-1β mRNA表達，抑制糠秕馬拉色菌誘導(dǎo)IL-6分泌。

在皮膚常駐菌群中，表皮葡萄球菌占細菌菌群總量最大，馬拉色菌占真菌菌群總量較大。在脂溢性皮炎/頭皮屑皮損處，這2種菌群均出現(xiàn)定植比例失衡[13]，對2種菌群相互作用的研究有助于進一步了解菌群失衡相關(guān)皮膚疾病的病因及發(fā)病機制。有報道在特定的環(huán)境下，馬拉色菌可通過改變其本身酶活性影響表皮葡萄球菌的增殖[14]，本研究發(fā)現(xiàn)葡萄球菌LTA可以抑制糠秕馬拉色菌誘導(dǎo)的炎性因子的表達，從菌群相互作用的角度揭示了這2種菌群新的互作方式，但其機制有待進一步研究。