張 盟，李興江，穆冬冬，姜蘇薇，張 旻，操麗麗，鄭 志，吳學(xué)鳳

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009；2.合肥學(xué)院 生物食品與環(huán)境學(xué)院，安徽 合肥 230601）

果醋是以水果及其下腳料為原料，通過接種酵母菌和醋酸菌進(jìn)行兩階段發(fā)酵加工而成的新型酸性飲品或調(diào)味品[1-2]，不僅含有食醋的營(yíng)養(yǎng)保健功能，同時(shí)保留了水果原有的營(yíng)養(yǎng)成分及其特有的芳香物質(zhì)[3]。蘋果醋是將新鮮蘋果破碎過濾得到蘋果汁，經(jīng)酒精和醋酸發(fā)酵而制成的，具有抵抗病菌、降血脂、降血壓、抗衰老、預(yù)防骨質(zhì)疏松等作用[4-6]。

鑒于液態(tài)單菌發(fā)酵果醋風(fēng)味欠佳的局限，混菌協(xié)同發(fā)酵有利于增強(qiáng)果醋營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味[7-9]已成為該領(lǐng)域研究者的共識(shí)。近期的研究顯示，乳酸菌對(duì)果醋風(fēng)味改善有重要作用，釀酒酵母和植物乳桿菌混菌發(fā)酵感官特性明顯優(yōu)于單菌發(fā)酵[10]。陳思奇等[11]采用嗜酸乳桿菌、戊糖乳桿菌和生香酵母混菌發(fā)酵刺梨果渣，其刺激性澀味明顯減弱，風(fēng)味更加協(xié)調(diào)柔和。CHEN Y等[12]通過釀酒酵母和植物乳桿菌混合發(fā)酵生產(chǎn)柑橘醋風(fēng)味更佳，具有高抗氧化性。有研究發(fā)現(xiàn)巴氏醋桿菌和植物乳桿菌混菌發(fā)酵有效促進(jìn)了香醋關(guān)鍵成分（乙偶姻）的增加[13]。CHAI L J等[14]通過調(diào)節(jié)干酪乳桿菌和巴氏醋桿菌的微生物代謝，促使了谷物醋在發(fā)酵過程中乙偶姻的積累。雖然混合培養(yǎng)在發(fā)酵過程中相對(duì)于純培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)得到了許多研究者的肯定，但在醋酸發(fā)酵階段巴氏醋桿菌和植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵蘋果醋理化和風(fēng)味的影響鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)以蘋果為原材料，在醋酸發(fā)酵階段同時(shí)接種巴氏醋桿菌和植物乳桿菌進(jìn)行雙菌協(xié)同發(fā)酵，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化雙菌協(xié)同發(fā)酵蘋果醋工藝條件，并與巴氏醋桿菌發(fā)酵蘋果醋對(duì)比分析主要理化指標(biāo)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異，以期為增強(qiáng)果醋營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果（山東棲霞產(chǎn)紅富士）：市售；果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）BJST-S、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZM803：本實(shí)驗(yàn)室保藏；果膠酶（500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

巴氏醋桿菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L、酵母粉10.0 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min，接種前加入2%（V/V）無(wú)水乙醇。

植物乳桿菌種子培養(yǎng)基：酪蛋白酶消化物10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母膏4.0 g/L、檸檬酸三銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐溫80 1.0 g/L。121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：安捷倫科技有限公司；GC-MS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司；S-433D型氨基酸分析儀：德國(guó)SYKAM公司；HYL-C2型組合式搖床：太倉(cāng)市強(qiáng)文實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果醋的加工工藝流程及操作要點(diǎn)

蘋果→清洗→切塊→打漿→酶解→過濾→蘋果汁→調(diào)整成分→殺菌→酒精發(fā)酵（酵母菌）→殺菌→醋酸發(fā)酵（巴氏醋桿菌和植物乳桿菌）→澄清→殺菌→成品

蘋果汁的制備：新鮮無(wú)腐敗的蘋果，洗凈后切塊，用榨汁機(jī)破碎打漿。在果漿中加入0.1%果膠酶，于45 ℃水浴酶解2 h后，85 ℃滅酶10 min，先四層紗布再八層紗布過濾得到澄清的蘋果汁。

酒精發(fā)酵：在37 ℃的5 g/100 mL白砂糖溶液中加入0.6%的果酒酵母，待表面起泡后，即為酵母活化成功，冷卻至室溫（25 ℃）備用。按照10%的添加量接種果酒酵母，于26 ℃條件下靜置發(fā)酵7 d。

醋酸發(fā)酵：巴氏醋桿菌、植物乳桿菌分別接種于種子液培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min活化12 h，備用。酒精發(fā)酵結(jié)束后，按照初始酒精度9%vol、發(fā)酵溫度30 ℃、巴氏醋桿菌接種量10%（V/V）、植物乳桿菌接種量10%（V/V）、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min進(jìn)行醋酸發(fā)酵12 d。

澄清與殺菌：醋酸發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)0.45 μm水相濾膜抽濾得到澄清果醋發(fā)酵液，并進(jìn)行巴氏殺菌（70 ℃、20 min）。

1.3.2 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素優(yōu)化試驗(yàn)：以總酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察初始酒精度（6%vol、7%vol、8%vol、9%vol、10%vol、11%vol）、發(fā)酵溫度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、37 ℃）、植物乳桿菌接種量（0、5%、10%、15%（V/V））、搖床轉(zhuǎn)速（120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min）對(duì)蘋果醋醋酸發(fā)酵的影響。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定巴氏醋桿菌接種量為10%，以初始酒精度（A）、發(fā)酵溫度（B）、植物乳桿菌接種量（C）、搖床轉(zhuǎn)速（D）4個(gè)因素為優(yōu)化條件，以總酸為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)4因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，確定醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件，試驗(yàn)因素與水平表見表1。

表1 蘋果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for acetic acid fermentation conditions optimization of apple vinegar

1.3.3 測(cè)定方法

總酸：酸堿滴定法；蛋白質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)法[15]；多酚：Folin-Ciocalteu法[16-17]；總黃酮：亞硝酸鈉-硝酸鋁法[16-17]；維生素C（vitamin C，VC）：分光光度法[18]；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基、羥自由基清除率：參照參考文獻(xiàn)[19-21]的方法測(cè)定；游離氨基酸：參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》[22]的方法測(cè)定。

揮發(fā)性香氣成分：參照參考文獻(xiàn)[23-25]的方法測(cè)定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Origin8.0、Design-Expert 8.0.6、TBtools分析數(shù)據(jù)及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 蘋果醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

酒精是醋酸發(fā)酵的主要底物，醋酸菌通過代謝酶系作用底物發(fā)酵產(chǎn)酸[26]，過低的酒精濃度無(wú)法持續(xù)為醋酸菌產(chǎn)酸提供發(fā)酵原料，較高濃度酒精會(huì)抑制醋酸菌的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)酸速率也會(huì)受到抑制[27]，由圖1（a）可知，當(dāng)初始酒精度為9%vol時(shí)，總酸最高為51.43 g/L，因此選擇初始酒精度為9%vol進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由圖1（b）可知，不同植物乳桿菌接種量對(duì)蘋果醋發(fā)酵產(chǎn)酸也有影響，當(dāng)植物乳桿菌接種量為10%時(shí)，總酸可達(dá)51.85 g/L，與單巴氏醋桿菌發(fā)酵蘋果醋總酸含量（52.97 g/L）無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。因此選擇植物乳桿菌接種量為10%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。溫度也是影響醋酸發(fā)酵的重要因素，當(dāng)溫度較低時(shí)，醋酸菌的生長(zhǎng)代謝能力減弱，發(fā)酵周期較長(zhǎng)，產(chǎn)酸速率低，溫度過高會(huì)加快醋酸菌菌體老化，菌體內(nèi)酶系活性降低[9]，由圖1（c）可知，在發(fā)酵溫度30 ℃時(shí)，醋酸菌的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，總酸最高為51.45 g/L，因此選擇發(fā)酵溫度為30 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。醋酸菌是好氧細(xì)菌，發(fā)酵液中的溶氧量與醋酸菌的生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)，搖床轉(zhuǎn)速過高，也會(huì)加快發(fā)酵液中酸類物質(zhì)的揮發(fā)，同時(shí)過高的溶解氧會(huì)加快醋酸菌的衰亡，使得發(fā)酵液總酸含量降低，由圖1（d）可知，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min時(shí)，總酸最高為50.91 g/L，因此選擇搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 初始酒精度（a），植物乳桿菌接種量（b），發(fā)酵溫度（c）和搖床轉(zhuǎn)速（d）對(duì)蘋果醋酸度的影響Fig.1 Effects of initial alcohol content (a), Lactobacillus plantarum inoculum (b),fermentation temperature (c),and rotational speed (d) on acidity of apple vinegar

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化雙菌協(xié)同發(fā)酵條件結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以蘋果醋的總酸為響應(yīng)指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，回歸模型的方差分析見表3。

表2 蘋果醋發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test for fermentation conditions optimization of apple vinegar

續(xù)表

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert 8.0對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到總酸含量的二次多項(xiàng)回歸擬合方程為：

由表3可知，模型P＜0.001，表明差異極顯著；失擬項(xiàng)P=0.109 4＞0.05，差異不顯著；決定系數(shù)R2=0.969 9，校正決定系數(shù)因而該模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較小，且該回歸模型一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)D，交互項(xiàng)AC、AD對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。各因素之間相互作用響應(yīng)面圖，如圖2所示，響應(yīng)值隨著單因素的增大，呈先上升再下降的趨勢(shì)，結(jié)合表3可知，各因素對(duì)結(jié)果的影響順序依次為初始酒精度＞發(fā)酵溫度＞轉(zhuǎn)速＞植物乳桿菌接種量。

圖2 各因素交互作用對(duì)蘋果醋總酸影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of various factors on total acid of apple vinegar

本試驗(yàn)優(yōu)化得出較優(yōu)工藝條件為初始酒精度9.36%vol，發(fā)酵溫度30.52 ℃，植物乳桿菌接種量9.22%，搖床轉(zhuǎn)速174.76 r/min，蘋果醋總酸預(yù)測(cè)值為58.54 g/L。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，以初始酒精度9%vol、發(fā)酵溫度31 ℃、植物乳桿菌接種量10%及搖床轉(zhuǎn)速170 r/min進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的蘋果醋總酸實(shí)際值為56.13 g/L，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.04%，誤差率小。

2.2 蘋果醋的理化指標(biāo)及抗氧化性研究結(jié)果

由圖3可知，兩種蘋果醋蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05），雙菌協(xié)同發(fā)酵蘋果醋（DFAV）的總黃酮質(zhì)量濃度（0.45 mg/mL）顯著高于單菌發(fā)酵蘋果醋（SFAV）中總黃酮質(zhì)量濃度（0.37 mg/mL）（P＜0.05）；DFAV的總多酚質(zhì)量濃度高于SFAV，分別為0.30 mg/mL和0.32 mg/mL，這是由于植物乳桿菌能從相應(yīng)的酚酸中產(chǎn)生更多的揮發(fā)性酚類物質(zhì)[28]；此外，DFAV的VC質(zhì)量濃度也顯著高于SFAV，分別為0.25 mg/mL、0.22 mg/mL。DPPH、ABTS、羥自由基清除率通常用來(lái)評(píng)價(jià)果醋的抗氧化活性[29]。果醋發(fā)酵后，SFAV和DFAV的DPPH自由基清除率分別為91.88%和96.29%，有顯著性差異（P＜0.05）；DFAV的ABTS自由基清除率為56.52%，顯著高于SFAV（P＜0.05），有研究表明利用植物乳桿菌發(fā)酵果汁，其自由基清除率效果增加[30]，這與本結(jié)果一致；SFAV和DFAV羥自由基清除率分別為58.30%、55.87%。由此可見雙菌協(xié)同發(fā)酵蘋果醋可有效提高果醋營(yíng)養(yǎng)及抗氧化性。

圖3 蘋果醋的理化指標(biāo)及自由基清除率分析Fig.3 Analysis of physicochemical indexes and free radical scavenging rate of apple vinegar

2.3 蘋果醋的游離氨基酸分析

游離氨基酸被認(rèn)為是醋獨(dú)特風(fēng)味的重要貢獻(xiàn)者[12]。由表4可知，兩種果醋中均檢測(cè)到了16種氨基酸，其中包含除蘇氨酸外人體必需的7種氨基酸[31]，其質(zhì)量濃度均顯著高于單菌發(fā)酵果醋，這是由于植物乳桿菌的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生更多的游離氨基酸，豐富果醋的營(yíng)養(yǎng)含量。此外，DFAV中非必需氨基酸質(zhì)量濃度也顯著高于SFAV，特別是呈甜味的氨基酸Gly、Ala、Ser含量分別是SFAV的8.17、3.62、2.49倍，且呈鮮味的氨基酸Glu、Asp質(zhì)量濃度也顯著高于SFAV（P＜0.05），因此雙菌協(xié)同發(fā)酵果醋可以顯著改善果醋的風(fēng)味與口感。

表4 雙菌協(xié)同發(fā)酵蘋果醋對(duì)游離氨基酸的影響Table 4 Effects of dual-species cooperative fermentation on free amino acids of apple vinegar

2.4 蘋果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

單菌和雙菌協(xié)同發(fā)酵蘋果醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類分析如圖4所示，在SFAV和DFAV中分別發(fā)現(xiàn)25種和36種揮發(fā)性化合物，主要有酸類、酯類、醛類、醇類、酮類。其中酸類物質(zhì)是醋風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者，醋酸在SFAV和DFAV中質(zhì)量濃度最高；兩種果醋醇類物質(zhì)差異較小，其中DFAV中的芳樟醇質(zhì)量濃度顯著高于SFAV。在雙菌協(xié)同發(fā)酵過程中，由于植物乳桿菌的作用，在DFAV中檢測(cè)到乳酸乙酯，且DFAV中乙偶姻（192.35 μg/L）的質(zhì)量濃度是SFAV（139.07 μg/L）的1.38倍，這與任聰?shù)萚13]研究發(fā)現(xiàn)巴氏醋桿菌和植物乳桿菌混菌發(fā)酵有效的促進(jìn)了香醋關(guān)鍵成分（乙偶姻）的增加結(jié)果一致。SUN S Y等[32]研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中添加植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵可增加酯類化合物的產(chǎn)生，DFAV中酯類化合物的種類和含量均大于SFAV。因此雙菌協(xié)同發(fā)酵更有利于果醋風(fēng)味物質(zhì)的生成。

圖4 雙菌協(xié)同發(fā)酵蘋果醋揮發(fā)性化合物聚類熱圖Fig.4 Clustering heat map of volatile compounds of apple vinegar by dual-species cooperative fermentation

3 結(jié)論

本研究在醋酸發(fā)酵階段同時(shí)接種巴氏醋桿菌和植物乳桿菌進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵制備蘋果醋。在對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，與單菌發(fā)酵果醋進(jìn)行了理化性質(zhì)、抗氧化活性、氨基酸及風(fēng)味物質(zhì)對(duì)比分析。在雙菌協(xié)同發(fā)酵蘋果醋的較優(yōu)工藝條件（酒精度9%vol，發(fā)酵溫度31 ℃，植物乳桿菌接種量10%，轉(zhuǎn)速170 r/min）下，蘋果醋的總酸含量達(dá)到56.13 g/L。雙菌協(xié)同發(fā)酵蘋果醋中總多酚、總黃酮、VC、游離氨基酸質(zhì)量濃度顯著高于單菌發(fā)酵蘋果醋（P＜0.05），且具有較好的抗氧化性，表現(xiàn)出更好的風(fēng)味。由此可見，利用巴氏醋桿菌與植物乳桿菌進(jìn)行雙菌協(xié)同醋酸發(fā)酵是改善果醋風(fēng)味的一個(gè)有效途徑，本研究結(jié)果可為增強(qiáng)蘋果醋風(fēng)味及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo)。