崔歡 高巧麗 羅立新 楊靖 陳淳 郭濤 劉永柱 黃永相 王慧 陳志強(qiáng),* 肖武名,*

水稻萌發(fā)期激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和谷胱甘肽代謝轉(zhuǎn)錄分析

崔歡1高巧麗1羅立新1楊靖1陳淳1郭濤1劉永柱1黃永相2王慧1陳志強(qiáng)1,*肖武名1,*

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣州 510642；2廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088；*通信聯(lián)系人，E-mail：chenlin@scau.edu.cn；heredity24@126.com）

【】利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，探究水稻萌發(fā)過(guò)程中激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)部氧化還原平衡的調(diào)控機(jī)理，以期增加對(duì)萌發(fā)過(guò)程中復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的理解，促進(jìn)萌發(fā)期基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并挖掘調(diào)控種子萌發(fā)的相關(guān)基因，為水稻直播稻新品種選育提供理論參考。利用萌發(fā)0、24和48 h的種子進(jìn)行動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，以差異倍數(shù)≥2、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率≤0.05為閾值篩選差異基因，并利用Gene Ontology(GO)和KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)萌發(fā)不同階段的差異基因進(jìn)行分析注釋?zhuān)煌瑫r(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；最后運(yùn)用String蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)以combined_score≥0.9為閾值分析差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。在種子萌發(fā)前期鑒定到8719個(gè)差異基因，而在萌發(fā)后期僅鑒定到3480個(gè)。GO和KEGG富集結(jié)果均顯示與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因主要在萌發(fā)前期被誘導(dǎo)，特別是生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的GH3家族基因在萌發(fā)前期均受到顯著誘導(dǎo)；而谷胱甘肽代謝途徑中的基因在萌發(fā)后期轉(zhuǎn)錄更為活躍，其中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因富集最多。此外，兩個(gè)異檸檬酸脫氫酶基因在萌發(fā)過(guò)程中被顯著誘導(dǎo)，經(jīng)蛋白互作預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)異檸檬酸脫氫酶基因與GH3家族基因可能存在相互作用。在種子萌發(fā)前期，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的GH3家族基因可能在減弱生長(zhǎng)素信號(hào)以及降低生長(zhǎng)素活性方面發(fā)揮著重要作用，其高表達(dá)能降低生長(zhǎng)素對(duì)種子的休眠作用，促進(jìn)萌發(fā)啟動(dòng)；在種子萌發(fā)后期，谷胱甘肽代謝途徑中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因可能在細(xì)胞抵抗氧化脅迫中發(fā)揮主要作用；此外，在整個(gè)萌發(fā)過(guò)程中，GH3和異檸檬酸脫氫酶家族基因的相互作用可能在實(shí)現(xiàn)激素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和谷胱甘肽代謝途徑的交互串聯(lián)作用、共同調(diào)控種子萌發(fā)方面具有重要意義。

水稻；萌發(fā)；轉(zhuǎn)錄組；激素；谷胱甘肽

水稻是世界上最重要的農(nóng)作物之一，世界上超過(guò)一半的人口以水稻為主食[1]。近年來(lái)，隨著水稻免耕直播技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及機(jī)插秧比例的不斷增加，生產(chǎn)上對(duì)種子發(fā)芽特性的要求越來(lái)越高[2]。提高種子活力可以大幅縮短出苗時(shí)間，減小田間播種環(huán)境中的低溫和低氧等不良因素對(duì)種子發(fā)芽的抑制作用，提高發(fā)芽率和出苗整齊度，從而提高群體質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)播種后的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)[3, 4]。

種子萌發(fā)是水稻生命周期的起始階段，開(kāi)始于干種子吸水膨脹，結(jié)束于胚根的形成并突破種皮，決定了隨后的成苗效果。一般而言，種子萌發(fā)過(guò)程可分為快速吸水階段、吸水平臺(tái)期和再次快速吸水三個(gè)階段[5, 6]。先前研究表明，種子在快速吸水過(guò)程中，會(huì)因?yàn)榕蛎涍^(guò)快、過(guò)度而出現(xiàn)損傷[7]，并且種子緊密的內(nèi)部結(jié)構(gòu)也會(huì)限制與外界環(huán)境的正常氣體交流，從而導(dǎo)致萌發(fā)早期的種子出現(xiàn)氧化脅迫。因此，種子在萌發(fā)過(guò)程中會(huì)激活一系列脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)保障萌發(fā)的正常進(jìn)行[8]。蛋白組學(xué)分析揭示了水稻種子在吸水膨脹過(guò)程中發(fā)生的主要代謝活動(dòng)，包括細(xì)胞完整性的修復(fù)、DNA損傷的修復(fù)、氧化還原以及丙酮酸代謝等[9-12]。同時(shí)，隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）的不斷發(fā)展與應(yīng)用，一系列與氧化還原、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞壁完整性相關(guān)的基因在種子萌發(fā)過(guò)程中被鑒定出來(lái)[13, 14]。Chen等[15]在擬南芥種子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)編碼抗壞血酸過(guò)氧化酶6（ascorbate peroxidase 6，APX6）能調(diào)節(jié)活性氧（reactive oxygen species，ROS）信號(hào)來(lái)保護(hù)種子免受過(guò)度的氧化損傷，并能通過(guò)與激素信號(hào)的串聯(lián)作用來(lái)促進(jìn)種子萌發(fā)。He等[16]利用干種子和吸脹8 h的種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)含有AP2（Apetala 2）結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子在種子萌發(fā)初期的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可能起著重要調(diào)控作用。

眾多研究表明，植物激素是調(diào)控種子萌發(fā)的重要因素，在種子萌發(fā)過(guò)程中激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑會(huì)調(diào)節(jié)一系列蛋白質(zhì)的合成與分解代謝，從而保證種子在合適的條件下啟動(dòng)萌發(fā)[17]。其中，脫落酸（ABA）是種子萌發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)因子之一，其主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的松動(dòng)和膨脹來(lái)抑制種子萌發(fā)[18]。同時(shí)，ABA也能促進(jìn)茉莉酸（JA）的生物合成來(lái)協(xié)同抑制種子萌發(fā)[19]。種子對(duì)ABA的敏感性決定了種子的發(fā)芽速率[20]，主要受ABA信號(hào)通路上PYR/PYL(pyrabactin resistance 1 / pyrabactin resistance 1-like)受體等3個(gè)核心組件的調(diào)控[21, 22]。Song等[23]發(fā)現(xiàn)基因能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合活性，促進(jìn)ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制種子萌發(fā)。一般而言，生長(zhǎng)素（AUX）能通過(guò)刺激ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)促進(jìn)種子休眠，在萌發(fā)過(guò)程中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用[24]。He等[25]利用構(gòu)建的日本晴水稻突變體，發(fā)現(xiàn)水稻吲哚乙酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因能通過(guò)調(diào)節(jié)種子萌發(fā)過(guò)程中AUX和ABA的含量，引起下游ABA信號(hào)因子表達(dá)變化，從而決定水稻種子活力水平。有研究表明，乙烯（ET）和油菜素內(nèi)酯（BR）在種子萌發(fā)過(guò)程中可能起著促進(jìn)作用[26]。

種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程。目前，關(guān)于種子萌發(fā)過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控已有諸多研究，但是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的準(zhǔn)確調(diào)控機(jī)制以及氧化還原平衡如何穩(wěn)定維持等問(wèn)題仍然有待探索。本研究利用萌發(fā)0 h、24 h和48 h的種子進(jìn)行動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，以探索水稻種子萌發(fā)過(guò)程中不同發(fā)育階段的基因表達(dá)變化，旨在揭示不同萌發(fā)階段起主要調(diào)控作用的生物學(xué)途徑，并挖掘在萌發(fā)過(guò)程中起重要調(diào)控作用的關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

供試材料為美國(guó)直播稻品種Francis，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物航天育種技術(shù)研究中心收集。種子先用70%乙醇浸泡20 min進(jìn)行表面消毒，后于10%的次氯酸鈉溶液中深度消毒30 min，蒸餾水洗滌三次后均勻放在鋪有兩層濾紙的直徑9 cm的培養(yǎng)皿中（加入10 mL蒸餾水），置于培養(yǎng)箱（25℃、12 h光照/12 h黑暗、濕度85%）中進(jìn)行萌發(fā)。分別取萌發(fā)0 h（C0）、24 h（C1）和48 h（C2）三個(gè)階段的種子，30粒為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)階段各取3個(gè)重復(fù)，用液氮快速冷凍后置于?80℃下保存?zhèn)溆?。稱(chēng)取冷藏的種子0.2 g，參照艾德萊試劑盒（AIDLA. RAN53）的指導(dǎo)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行水稻總RNA提取。

1.2 測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序

測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序樣品檢測(cè)合格后，在北京百邁客生物科技有限公司用IIIuminaHiSeq平臺(tái)對(duì)構(gòu)建合格的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.3 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量分析

分別將各樣品的Clean Reads與指定的參考基因組（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）進(jìn)行序列比對(duì)；獲得唯一比對(duì)上參考基因的reads（unique reads）；統(tǒng)計(jì)unique reads在參考序列上的分布情況及覆蓋度，判斷比對(duì)結(jié)果是否通過(guò)第二次質(zhì)控，判斷合格的高質(zhì)量reads用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.4 差異表達(dá)基因的篩選與功能注釋

運(yùn)用DESeq2軟件，以差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）≥2、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）≤0.05為閾值，篩選出兩樣本間的差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Gene，DEG），對(duì)基因表達(dá)模式進(jìn)行上（下）調(diào)描述和統(tǒng)計(jì)。FDR值是通過(guò)對(duì)差異顯著性值（-value）進(jìn)行校正得到的。

對(duì)篩選的差異基因運(yùn)用ClusterProfiler分別進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細(xì)胞組分（Cell Component，CC）的富集分析，并進(jìn)行GO基因功能注釋?zhuān)@得所有差異表達(dá)基因的功能注釋、生物學(xué)功能以及相關(guān)的代謝途徑，并以值（-value）≤0.05為閾值找出顯著富集的分子條目。同時(shí)，利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)篩選的差異基因進(jìn)行通路（Pathway）定位和注釋分析，以≤0.05為閾值找出顯著富集的通路，進(jìn)一步解讀基因的功能。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

分別采用艾德萊AIDLA.RAN53試劑盒和Promega公司的GoScript? Reverse Transcription System試劑盒提取總RNA并合成cDNA。在StepOne plus定量PCR儀上（美國(guó)ABI公司）開(kāi)展實(shí)時(shí)定量PCR分析，所用試劑為南京諾唯贊生物科技有限公司的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)以及基于SYBRGreen染料法的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒。以（）基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列信息如表1所示，定量數(shù)據(jù)處理參照Schmittgen等[27]的方法，每個(gè)基因進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 蛋白互作預(yù)測(cè)

利用String蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string- db.org/）中的互作關(guān)系以combined_score≥0.9為閾值分析差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用Cytoscape軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同階段DEG的鑒定和表達(dá)分析

在種子萌發(fā)過(guò)程中，總共鑒定到10 379個(gè)DEG。在萌發(fā)前期（C0 vs C1），共有8719個(gè)基因差異表達(dá)，其中4863個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，3856個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖1-A）；在萌發(fā)后期(C1 vs C2)，共鑒定到3480個(gè)DEG，其中有2185個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、1295個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖1-B）。萌發(fā)前期的差異基因數(shù)量顯著多于后期，尤其是前期表達(dá)上調(diào)的基因明顯多于表達(dá)下調(diào)的基因和后期表達(dá)上調(diào)的基因。共有1820個(gè)基因在萌發(fā)的兩個(gè)階段持續(xù)差異表達(dá)（圖1-C），其中703個(gè)持續(xù)上調(diào)表達(dá)，344個(gè)持續(xù)下調(diào)表達(dá)（圖1-D），它們可能在萌發(fā)過(guò)程中持續(xù)發(fā)揮重要作用。此外，有560個(gè)差異表達(dá)基因在萌發(fā)前期表達(dá)顯著上調(diào)，而在萌發(fā)后期又顯著下調(diào)，還有部分基因在萌發(fā)前期表達(dá)量顯著上升，而在萌發(fā)后期又顯著下降，暗示它們可能在萌發(fā)的不同階段發(fā)揮著不同的作用。

表1 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證引物

2.2 不同階段DEG的GO富集分析

為了了解水稻種子在萌發(fā)過(guò)程中DEG的主要功能特征，分別對(duì)每一階段的DEG進(jìn)行GO顯著性富集分析。萌發(fā)前期共富集了37個(gè)GO分子條目，其中生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能分別富集到21、13和3個(gè)條目（圖2-A）；在萌發(fā)后期，分別富集到28、19和30個(gè)條目（圖2-B）。

在萌發(fā)過(guò)程中，細(xì)胞氧化劑排毒、過(guò)氧化氫分解過(guò)程、氧化還原過(guò)程、氧化應(yīng)激反應(yīng)、幾丁質(zhì)分解代謝過(guò)程以及基于微管的運(yùn)動(dòng)共6個(gè)生物學(xué)過(guò)程的條目在種子發(fā)育的兩個(gè)階段均顯著富集。在萌發(fā)前期，顯著富集到的主要包括脂肪酸生物合成過(guò)程、以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA復(fù)制起始、對(duì)脫落酸的反應(yīng)以及細(xì)胞周期等分子條目，主要與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程有關(guān)。在種子發(fā)育后期，顯著富集到的生物學(xué)過(guò)程的條目主要涉及物質(zhì)的合成與分解代謝、光合作用以及氧化還原等生物學(xué)過(guò)程，主要包括谷胱甘肽代謝過(guò)程、糖酵解過(guò)程以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等。對(duì)分子功能進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在種子萌發(fā)前期只顯著富集到了金屬離子結(jié)合、過(guò)氧化物酶活性和脂質(zhì)結(jié)合3個(gè)功能條目；而在種子萌發(fā)的后期，主要富集在幾丁質(zhì)酶活性、過(guò)氧化物酶活性、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性以及氧化還原酶活性等分子功能條目。

2.3 不同階段DEG的KEGG富集分析

為了探究水稻種子在萌發(fā)過(guò)程中的代謝途徑變化，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEG進(jìn)行了功能分類(lèi)和通路注釋分析。由圖3可知，在萌發(fā)前期有4條KEGG通路顯著富集，在萌發(fā)后期有22條KEGG通路顯著富集，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝與半胱氨酸和蛋氨酸代謝兩條氨基酸代謝途徑在兩個(gè)階段均顯著富集。在萌發(fā)前期富集到

差異基因最多的通路是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；而在萌發(fā)后期顯著富集的代謝通路主要包括碳代謝、淀粉和蔗糖代謝與谷胱甘肽代謝等13條代謝途徑，苯丙烷生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成等4條生物合成途徑，糖酵解/糖異生以及與光合作用有關(guān)的2條途徑等。

2.4 激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的表達(dá)模式分析

種子萌發(fā)過(guò)程中，在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中共富集到與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜素內(nèi)酯、茉莉酸和水楊酸在內(nèi)的8大類(lèi)激素轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的107個(gè)DEG，其中在萌發(fā)前期富集到87個(gè)DEG，且58個(gè)基因的表達(dá)水平相比于干種子均顯著上調(diào)(圖4)。萌發(fā)后期富集到的基因明顯少于前期，只有38個(gè)，其中上調(diào)基因占24個(gè)。

A?萌發(fā)前期差異基因MA圖；B?萌發(fā)后期差異基因MA圖；C?萌發(fā)期差異基因韋恩圖；D?萌發(fā)期上（下）調(diào)差異基因韋恩圖。

C0?萌發(fā)后0 h; C1?萌發(fā)后24 h; C2?萌發(fā)后48 h。

A, MA map of DEG in early germination; B, MA map of DEG in late germination; C, Venn diagram of DEG in germination stage; D, Venn diagram of up-regulation and down-regulation DEG in germination stage.

C0, 0 h after germination; C1, 24 h after germination; C2, 48 h after germination.

圖1 不同萌發(fā)階段差異表達(dá)基因分析

Fig. 1. Differentially expressed gene analysis during different germination stages.

在種子萌發(fā)前期，與生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的4個(gè)基因均被顯著誘導(dǎo)，而生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF(auxin response factor)基因更是上調(diào)10倍以上。生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子Aux／IAA(auxin/indole acetic acid)、具有吲哚乙酸氨基酸化合成酶功能的GH3(Gretchen Hagen 3)相關(guān)基因以及編碼鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的SAUR(small auxin up RNA)基因也大部分顯著上調(diào)表達(dá)，且在24 h表達(dá)上調(diào)的基因更為集中。說(shuō)明在種子萌發(fā)前期，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起負(fù)調(diào)控作用的基因轉(zhuǎn)錄更為活躍，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度在萌發(fā)期間可能有所降低。與AUX相關(guān)基因表達(dá)趨勢(shì)不同的是，ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的亞類(lèi)Ⅲ蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶2(subclass Ⅲ sucrose nonfermenting-1-related protein kinase2，SnRK2)、A組2C類(lèi)蛋白磷酸酶(group A type 2C protein phosphatase，PP2C)以及轉(zhuǎn)錄因子ABF(ABA-responsive element binding factor)相關(guān)基因的表達(dá)在種子吸脹后表達(dá)呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，暗示在種子萌發(fā)過(guò)程中與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄受到明顯抑制。而ABA受體PYR/PYL基因在萌發(fā)前期表達(dá)量上升而在后期表達(dá)量又明顯下調(diào)，表明ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能主要發(fā)生在種子萌發(fā)前期。ET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控器CTR1相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，而乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子EIN2相關(guān)的基因以及下游的正調(diào)控器EIN3基因均表達(dá)下調(diào)，暗示種子萌發(fā)過(guò)程中對(duì)ET敏感性有所降低。

圖2 萌發(fā)前期(A)和萌發(fā)后期(B)差異表達(dá)基因GO富集分析

Fig. 2. GO enrichment plots of differentially expressed genes at early(A) and late(B) germination stages.

C0?萌發(fā)后0 h; C1?萌發(fā)后24 h; C2?萌發(fā)后48 h。

Fig. 3. KEGG enrichment plots of DEGs at different germination stages.

圖4 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達(dá)熱圖

Fig. 4. Heatmap of DEGs expression in hormone signal transduction pathways.

其他植物激素中，6個(gè)與BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因在萌發(fā)前期均顯著上調(diào)，而在萌發(fā)后期的表達(dá)水平與前期相比無(wú)明顯變化，表明BR在整個(gè)萌發(fā)過(guò)程中可能起促進(jìn)作用，且主要在前期響應(yīng)萌發(fā)信號(hào)。CK、JA和SA信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)整體呈上升趨勢(shì)。與大部分激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因在萌發(fā)前期出現(xiàn)顯著上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)不同的是，CK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因在萌發(fā)后期比前期表達(dá)上調(diào)更為顯著和集中，可能與后期活躍的細(xì)胞擴(kuò)增有十分密切的關(guān)系。

2.5 谷胱甘肽代謝途徑基因的表達(dá)模式分析

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）能猝滅細(xì)胞中的活性氧物質(zhì)，是一種在植物中普遍存在的抗氧化劑。在種子萌發(fā)過(guò)程中總共有44個(gè)DEG富集在谷胱甘肽代謝途徑上，在萌發(fā)前期富集到28個(gè)DEG，包括13個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因；在萌發(fā)后期富集到23個(gè)差異基因，且大部分基因的表達(dá)水平相比前期均呈顯著上升趨勢(shì)（圖5）。在萌發(fā)期間共有7個(gè)基因持續(xù)差異表達(dá)，其中有4個(gè)基因持續(xù)上調(diào)表達(dá)，包括2個(gè)GST基因。2個(gè)異檸檬酸脫氫酶（Isocitrate Dehydrogenase，ICDH）基因在萌發(fā)前期的表達(dá)量相較于干種子均顯著上升，上調(diào)倍數(shù)更是達(dá)到了36倍以上。說(shuō)明ICDH催化NADPH生成NADP+的同時(shí)釋放的能量可能在種子萌發(fā)前期發(fā)揮著重要的作用。該途徑中富集到的編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）的基因最多，達(dá)到23個(gè)，且大部分在萌發(fā)過(guò)程中被顯著誘導(dǎo)。此外，谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase，GS)和谷胱甘肽水解酶相關(guān)基因在萌發(fā)后期也均被顯著誘導(dǎo)，谷胱甘肽代謝途徑相關(guān)基因在種子萌發(fā)過(guò)程中進(jìn)行了積極響應(yīng)，在萌發(fā)前期與后期上調(diào)和下調(diào)的基因有所不同。

2.6 激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與谷胱甘肽代謝途徑對(duì)萌發(fā)的交互調(diào)控

運(yùn)用String蛋白互作預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，將107個(gè)與激素信號(hào)相關(guān)的DEG和44個(gè)谷胱甘肽代謝途徑中的DEG進(jìn)行蛋白互作預(yù)測(cè)，以combined_score≥0.9為閾值得到了如圖6所示的互作網(wǎng)絡(luò)圖。圖中共有10個(gè)簇，其中9個(gè)簇顯示的是與激素信號(hào)相關(guān)基因之間的互作關(guān)系，包括生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)錄因子基因（MP）與（IAA13）以及（IAA30）這兩個(gè)AUX/IAA轉(zhuǎn)抑制子基因之間的互作關(guān)系。前人研究表明，在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中，AUX/IAA蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄因子ARF具有抑制作用，能夠限制生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)[28]。有趣的是，谷胱甘肽代謝途徑中的ICDH家族中的兩個(gè)基因（OsJ_02861）和（OsJ_19624）與生長(zhǎng)素早期應(yīng)答基因GH3家族的8個(gè)基因可能存在相互作用，結(jié)果表明植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與谷胱甘肽代謝途徑可能通過(guò)ICDH和GH3家族基因?qū)崿F(xiàn)串聯(lián)，在種子萌發(fā)中存在交互調(diào)控機(jī)制。

圖5 谷胱甘肽代謝途徑基因表達(dá)熱圖

Fig. 5. Heatmap of DEGs expression in glutathione metabolic pathway.

圖6 激素信號(hào)途徑基因與谷胱甘肽代謝途徑基因互作預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)圖

Fig. 6. Predicted interaction networks between hormone signaling transduction pathways and glutathione metabolic pathways.

C0?萌發(fā)后0 h; C1?萌發(fā)后24 h; C2?萌發(fā)后48 h。

Fig. 7. Expression patterns of selected DEG were verified by qRT-PCR.

2.7 部分DEG表達(dá)模式的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)是否可靠，從鑒定到的GH3和GST兩個(gè)家族的差異基因中各自隨機(jī)挑選了4個(gè)進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明8個(gè)DEGs的差異倍數(shù)雖然和測(cè)序結(jié)果不是完全一致，但是表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果均一致（圖7），表明轉(zhuǎn)錄組結(jié)果數(shù)據(jù)可靠。

3 討論

種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，干種子吸水后會(huì)啟動(dòng)一系列轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，基因表達(dá)十分活躍。在本研究中，種子萌發(fā)前期的DEG顯著多于萌發(fā)后期，且大部分基因表達(dá)上調(diào)，暗示干種子吸水后，基因的表達(dá)量會(huì)顯著升高，且主要發(fā)生在萌發(fā)的前24 h，與前人研究結(jié)果基本一致[14]。GO富集發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化氫分解、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程在整個(gè)萌發(fā)過(guò)程中均被顯著富集，說(shuō)明在萌發(fā)過(guò)程中，氧化脅迫相關(guān)基因發(fā)揮著重要的作用。萌發(fā)前期被顯著富集的DEG主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA復(fù)制、對(duì)脫落酸的反應(yīng)以及細(xì)胞周期等功能相關(guān)，說(shuō)明萌發(fā)前期是基因轉(zhuǎn)錄以及信號(hào)分子發(fā)生劇烈變化的重要時(shí)期，該時(shí)期信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及相應(yīng)物質(zhì)的準(zhǔn)備決定著種子是否可以順利打破休眠，啟動(dòng)萌發(fā)。在萌發(fā)后期，種子的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答主要涉及到物質(zhì)的合成與分解代謝、光合作用以及氧化還原等生物學(xué)過(guò)程，可能與種子出芽階段的大量物質(zhì)與能量需求有關(guān)。KEGG富集結(jié)果表明，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝與半胱氨酸和蛋氨酸代謝兩條氨基酸代謝途徑十分活躍，能為種子生命活動(dòng)的進(jìn)行提供充足的氨基酸，且其代謝產(chǎn)物也能為其他代謝途徑提供部分物質(zhì)和能量支持，可能在種子萌發(fā)過(guò)程中起著舉足輕重的作用。萌發(fā)前期富集到DEG最多的通路是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，表明與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因在種子萌發(fā)前期的信號(hào)響應(yīng)中可能發(fā)揮著重要作用；而谷胱甘肽代謝途徑在萌發(fā)后期比前期富集更為顯著，則暗示在種子萌發(fā)后期可能仍舊存在著較為嚴(yán)重的氧化脅迫。

植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在種子萌發(fā)過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，其中，ABA和AUX均能通過(guò)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制種子萌發(fā)。在本研究中，與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因在種子萌發(fā)前期被顯著富集，暗示激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)主要發(fā)生在種子萌發(fā)前期，并可能參與了種子前期的應(yīng)激反應(yīng)途徑。在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，PYR/PYL受體能間接調(diào)控SnRK2的活性[29]；同時(shí)，當(dāng)ABA與PYR/PYL受體結(jié)合后能觸發(fā)受體的構(gòu)象變化，從而使受體-ABA復(fù)合物與PP2C結(jié)合并抑制其活性[30]。在本研究中，ABA受體PYR/PYL基因在萌發(fā)前期受到顯著誘導(dǎo)，而和基因在種子吸脹后均表達(dá)下調(diào)，另外8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在萌發(fā)過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄也均受到明顯抑制，表明在萌發(fā)過(guò)程中ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱，ABA對(duì)萌發(fā)的抑制作用顯著降低。生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要由生長(zhǎng)素受體TIR1/AFB、轉(zhuǎn)錄抑制子AUX/IAA以及轉(zhuǎn)錄因子ARF三種因子組成[31]。在擬南芥中，基因的表達(dá)量下調(diào)會(huì)導(dǎo)致種子休眠水平的降低，加快萌發(fā)速率[24]。本研究中，僅鑒定到一個(gè)基因，其在吸脹后表達(dá)量大幅上升，而在生長(zhǎng)素信號(hào)途徑中鑒定到的和相關(guān)差異基因數(shù)量較多，且大部分表達(dá)顯著上調(diào)，暗示在種子吸脹過(guò)程中，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能受到抑制，基因和可能共同調(diào)控生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因的表達(dá)。GH3家族中鑒定到的8個(gè)DEG在萌發(fā)前期均受到顯著誘導(dǎo)，、、和更是上調(diào)8倍以上。GH3蛋白能降低細(xì)胞中游離的生長(zhǎng)素活性，抑制生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能在種子萌發(fā)早期能降低生長(zhǎng)素對(duì)種子的休眠調(diào)控作用，促進(jìn)種子萌發(fā)[32]。在本研究中，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，種子萌發(fā)過(guò)程中乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能受到抑制，與前人報(bào)道不同[26]，這可能與不同的測(cè)試材料以及分析時(shí)期有關(guān)。

谷胱甘肽（GSH）能幫助維持細(xì)胞抗氧化防御，并且在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有著舉足輕重的作用，是一種在植物體內(nèi)普遍存在且極為重要的抗氧化物質(zhì)[33]。GST是具有多種功能的蛋白質(zhì)家族，它們?cè)诿复賀OS清除機(jī)制中起重要作用，能以GSH為底物催化H2O2的轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（GSSG），GST過(guò)表達(dá)有助于提升非生物脅迫耐受性[34]。本研究在谷胱甘肽代謝途徑中富集到的23個(gè)編碼GST的DEG，且大部分在萌發(fā)過(guò)程中被顯著誘導(dǎo)，暗示GST家族基因可能通過(guò)維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡而在種子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮作用。此外，和這兩個(gè)基因在萌發(fā)過(guò)程中受到顯著誘導(dǎo)。ICDH可以通過(guò)三羧酸循環(huán)為細(xì)胞質(zhì)提供α-酮戊二酸，同時(shí)也可以產(chǎn)生谷胱甘肽還原酶和硫氧還蛋白還原酶的重要輔酶NADPH，與植物體內(nèi)的ROS清除密切相關(guān)[35, 36]。兩個(gè)基因在萌發(fā)過(guò)程中持續(xù)表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明它們可能與萌發(fā)過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的穩(wěn)定維持以及能量代謝密切相關(guān)，在促進(jìn)種子萌發(fā)過(guò)程的順利進(jìn)行方面起著重要作用。谷胱甘肽代謝可能通過(guò)影響GSH/GSSG比率來(lái)平衡細(xì)胞中的ROS含量、催化H2O2的轉(zhuǎn)化，保護(hù)細(xì)胞免受氧化所導(dǎo)致的損傷；同時(shí)，其也可能通過(guò)合成與分解代謝參與調(diào)節(jié)細(xì)胞中的谷氨酸、半胱氨酸的含量，為其他代謝途徑提供部分物質(zhì)基礎(chǔ)，在萌發(fā)過(guò)程中具有重要作用[37]。富集結(jié)果顯示在種子萌發(fā)前期和后期谷胱甘肽代謝途徑均被顯著富集，且在萌發(fā)后期富集更為顯著，暗示其在種子萌發(fā)的整個(gè)過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，尤其在保障種子從露白到發(fā)芽階段的順利過(guò)渡方面有著重要貢獻(xiàn)。

先前研究表明，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和谷胱甘肽代謝途徑可能存在著多方向的交互作用，以保障植株對(duì)脅迫的有效應(yīng)對(duì)[38, 39]。在擬南芥中，ABA能影響ROS的濃度[40]；而在水稻中，SA能調(diào)節(jié)GSH的濃度和GR的活性[41]。因此，本研究利用富集到的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和谷胱甘肽代謝途徑中的差異基因進(jìn)行了初步的蛋白互作預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，GH3家族的基因和ICDH家族的兩個(gè)基因可能存在相互作用，它們可能將兩個(gè)代謝通路交互串聯(lián)起來(lái)，在水稻種子萌發(fā)過(guò)程中共同作用，確保種子萌發(fā)的順利進(jìn)行。

4 結(jié)論

本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)水稻干種子（0 h）、吸脹種子（24 h）以及發(fā)芽種子（48 h）進(jìn)行了動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)主要發(fā)生在種子萌發(fā)前期，其中生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的GH3家族基因可能在降低游離生長(zhǎng)素活性以及減弱生長(zhǎng)素信號(hào)方面發(fā)揮著重要作用，其高表達(dá)能降低生長(zhǎng)素對(duì)種子的休眠作用，促進(jìn)種子萌發(fā)。而谷胱甘肽代謝途徑中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因可能在種子萌發(fā)后期抵抗細(xì)胞氧化脅迫中發(fā)揮主要作用，并且萌發(fā)過(guò)程中該途徑里的異檸檬酸脫氫酶基因的高表達(dá)可能在實(shí)現(xiàn)與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的串聯(lián)交互作用、共同調(diào)控種子萌發(fā)方面具有重要意義。

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Transcriptome Analysis of Hormone Signal Transduction and Glutathione Metabolic Pathway in Rice Seeds at Germination Stage

CUI Huan1, GAO Qiaoli1, LUO Lixin1, YANG Jing1, CHEN Chun1, GUO Tao1, LIU Yongzhu1,HUANG Yongxiang2, WANG Hui1, CHEN Zhiqiang1,*, XIAO Wuming1,*

(1National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2Binhai Agricultural College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China;*Corresponding author, E-mail: chenlin@scau.edu.cn; heredity24@126.com)

【】By using transcriptome sequencing technology, we explored the regulation mechanism of hormone signal transduction and redox balance inside cells during rice germination, as a way to increase the understanding of and construct the complex regulatory network of germination.At the same time, mining the genes that regulate seed germination could lay a theoretical basis for direct-seeded rice breeding.【】Dynamic transcriptome sequencing analysis was performed using seeds at 0, 24, and 48 hours after imbibition as materials. Differentially expressed genes (DEGs) were screened with the threshold of Fold Change≥2 and False Discovery Rate≤ 0.05. Gene Ontology and KEGG Pathway databases were used to analyze and annotate the DEGs at different stages of germination and real-time quantitative PCR was conducted to verify the sequencing results. Finally, the protein interaction network of DEGs was analyzed using the String protein interaction database under the threshold of combined_score≥0.9.【】8719 DEGs were identified in the early stage of seed germination, but only 3480 DEGs in the late stage of germination. The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that the DEGs related to hormone signal transduction were mainly induced in the early stage, especially the GH3 (Gretchen Hagen 3) family genes in the auxin signal transduction pathway were all significantly induced after imbibition. While the DEGs involved in the glutathione metabolism pathway were more active during the late germination period, and the glutathione-S-transferase genes were the most enriched in this pathway. In addition, two isocitrate dehydrogenase (ICDH) genes were significantly induced throughout the germination process. According to protein interaction prediction, the two ICDH genes may interact with the GH3 family genes.【】The GH3 family genes in the AUX signal transduction pathway may play an important role in attenuating the AUX signal and reducing the AUX activity in the early stage of seed germination. Their high expression levels reduce the regulatory effect of auxin on seed dormancy and promote seed germination. In the glutathione metabolism pathway, GST genes may play a major role in resistance to cell oxidative stress in the late stage of seed germination. In addition, the interaction between GH3 and ICDH family genes during the germination process may have important significance in realizing the tandem effect of hormone transduction pathway and glutathione metabolism pathway and co-regulating seed germination.

rice; germination; transcriptome; hormone; glutathione

10.16819/j.1001-7216.2021.200915

2020-09-23；

2021-03-04。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31872885)；廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2020B020219004)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2017YFD0100100)。