赭曲霉毒素A 的抗原設(shè)計及在免疫分析中的應(yīng)用

張瑩蕾，潘艷華，方書燦，王 冕，李 玲

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

赭曲霉毒素是曲霉菌屬和青霉菌屬的某些菌種產(chǎn)生的二級代謝產(chǎn)物，共包含7 種結(jié)構(gòu)類似的化合物[1]。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的真菌毒素中，根據(jù)其重要性和危害性排序，赭曲霉毒素僅次于黃曲霉毒素，是繼黃曲霉毒素后又一個引起世界廣泛關(guān)注的真菌毒素[2]。在赭曲霉毒素系列中，赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)因其毒性最大，分布最廣，含量最高，被認(rèn)為是最重要和危害性最大的一種赭曲霉毒素[3]。OTA 廣泛存在于谷物(玉米、小麥等)和其他植物性食品(橄欖、豆類、葡萄干、無花果、南瓜子等)，飲品(啤酒、葡萄酒、咖啡等)和中藥材(甘草等)中也有OTA 的存在[4]。由于OTA可以直接污染谷類、水果等農(nóng)作物，人和動物通過攝入污染的植物性食物而吸收進(jìn)入體內(nèi)，同時也可因OTA 在動物體內(nèi)的蓄積作用而通過攝入動物性食物進(jìn)入人體內(nèi)。研究表明OTA 不僅具有免疫毒性、腎毒性和肝毒性，并且還有致畸、致突變和致癌作用[5-9]。因此建立食品中OTA 的快速檢測技術(shù)對加強(qiáng)食品安全風(fēng)險控制，提高食品安全保障能力具有重要的意義。

目前報道的OTA 檢測方法主要包括儀器檢測方法和生物檢測方法兩大類。儀器檢測主要是氣相色譜、液相色譜和質(zhì)譜[10-12]，生物檢測方法主要包括免疫分析法、酶抑制分析法、適配體探針等[13-15]。儀器檢測一般具有靈敏度高、定量相對準(zhǔn)確、一次能檢測多個指標(biāo)等優(yōu)點(diǎn)，是國家標(biāo)準(zhǔn)采用的主要方法。但儀器檢測也存在一些不足，比如：昂貴的儀器購置及維護(hù)費(fèi)用、需要專業(yè)技術(shù)人員操作、樣品處理繁瑣、檢測耗時長、不適用于現(xiàn)場檢測和高通量檢測等[16]。免疫檢測方法可用于現(xiàn)場檢測，同時具有檢測速度快、檢測成本低、能實(shí)現(xiàn)高通量檢測等優(yōu)點(diǎn)，能很好地彌補(bǔ)儀器檢測方法的不足，與之形成互補(bǔ)。

免疫分析法是基于抗原和抗體特異性結(jié)合進(jìn)行檢測的一種技術(shù)，在食品安全檢測領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。商品化的免疫試劑盒和免疫試紙條已被用于食品中農(nóng)獸藥、抗生素、生物毒素等有毒有害物質(zhì)的殘留檢測。根據(jù)標(biāo)記物的不同，常見的免疫分析方法可分為：放射免疫分析法[17]、熒光免疫分析法[18-19]、酶聯(lián)免疫分析法[20-21]、化學(xué)發(fā)光免疫分析法[22-23]、膠體金免疫分析法[24-25]、磁珠免疫分析法[26-27]等。無論是哪種免疫分析方法，抗體都是最關(guān)鍵的試劑，抗體的性質(zhì)通常決定分析方法的靈敏度和可靠性，而抗體性質(zhì)的好壞又很大程度上取決于抗原設(shè)計的合理性。

目前文獻(xiàn)報道的OTA 抗原都是直接以O(shè)TA分子本身作為半抗原(圖1(a))，通過OTA 分子自帶的羧基偶聯(lián)載體蛋白得到完全抗原(圖1(b))，Zhang 等[28]用DCC 活化OTA 分子偶聯(lián)蛋白制備了OTA 的完全抗原和單克隆抗體，抗體的IC50為7.6 ng/g。孟輝等[29]EDC 活化OTA 分子偶聯(lián)蛋白制備了OTA 的完全抗原和單克隆抗體，抗體的IC50為1.29 ng/mL。盡管這些抗體已經(jīng)用于實(shí)際樣品的檢測，但是對于基質(zhì)較復(fù)雜的樣品則需要稀釋較大倍數(shù)才能排除基質(zhì)干擾；因此，需要更加靈敏的抗體，建立更加靈敏的酶聯(lián)免疫分析方法。

圖1 OTA 的結(jié)構(gòu)式、文獻(xiàn)報道的OTA 抗原設(shè)計和本文的抗原設(shè)計

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性Balb/c 小鼠由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供；OTA 標(biāo)準(zhǔn)品購自青島普瑞邦生物工程有限公司，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自天津希恩思；Freunds 完全佐劑和不完全佐劑，牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)購自Sigma 公司；羊抗鼠IgG-HRP 購自武漢博士德生物工程有限公司；OTA 抗體由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；其它化學(xué)試劑均為市售分析純。UV1900 紫外可見分光光度計，日本島津公司；Multiskan FC多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher 公司。

1.2 OTA 半抗原和完全抗原的制備

1.2.1 OTA 半抗原的合成

OTA 屬于有機(jī)小分子生物毒素，只有反應(yīng)原性，沒有免疫原性，如果要作為免疫抗原必須與載體蛋白偶聯(lián)。本文通過兩步反應(yīng)，增加了OTA 分子羧基碳鏈的個數(shù)，有利于免疫抗原中OTA 分子抗原表位的完全暴露，增加抗體的親和力，其合成路線如圖2 所示。

圖2 OTA-H1 半抗原的合成路線

具體合成步驟如下：10.0 mg OTA(25 μmol)、5.8 mg 4-氨基丁酸甲酯(37.4 μmol)、15.5 mg DCC(75 μmol)和3.1 mg DMAP(25 μmol)溶 于2 mL DMF 中，室溫攪拌反應(yīng)3 h，用TLC 板監(jiān)測反應(yīng)，待OTA 反應(yīng)完全后，將反應(yīng)體系倒入10 mL 水中，用20 mL 乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)相，有機(jī)相用1 mol/L HCl 洗滌3 次后用無水硫酸鈉干燥2 h，濃縮有機(jī)相得OTA 半抗原中間體(OTA-H1a)，該中間體不經(jīng)任何表征直接用于下一步反應(yīng)。用3 mL 甲醇溶解上步產(chǎn)物，加入等體積的1 mol/L LiOH 水溶液，室溫攪拌反應(yīng)1 h，用TLC 板監(jiān)測反應(yīng)，待反應(yīng)完全后，用1 mol/L HCl 小心調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH 至中性，將反應(yīng)體系倒入10 mL 水中，用20 mL 乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)相，有機(jī)相水洗3 次后用無水硫酸鈉干燥2 h，濃縮后柱色譜純化得到OTA 半抗原(OTA-H1)9.7 mg，兩步反應(yīng)總收率：80.2%。

1.2.2 OTA 完全抗原的合成

準(zhǔn)確稱取9.8 mg(20 μmol) OTA-H1 溶于0.6 mL DMF，加入6.2 mg DCC(30 μmol)和6.9 mg NHS(60 μmol)，反應(yīng)體系室溫攪拌24 小時，出現(xiàn)白色沉淀(二環(huán)己基脲)，離心后收集上清液，即為活化好的半抗原。準(zhǔn)確稱取20 mg BSA 和10 mg OVA 分別用于2 mL PBS(pH 7.4、0.1 mol/L)緩沖液溶解，室溫條件下，準(zhǔn)確吸取420 μL 上述活化好的半抗原，緩慢滴加到BSA 溶液中，邊滴加邊攪拌，滴加完畢，反應(yīng)液4 ℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)12 h。采用同樣操作，將剩余的180 μL 活化好的半抗原偶聯(lián)OVA。將上述偶聯(lián)產(chǎn)物透析純化后(透析液為pH 7.4，0.1 mol/L 的PBS 緩沖液，每次透析6 h，共透析6 次)分裝并低溫保存，即得到OTA 的完全抗原(OTA-H1-BSA，OTA-H1-OVA)。

B2C企業(yè)技術(shù)能力包括核心技術(shù)水平和技術(shù)創(chuàng)新能力兩個方面。核心技術(shù)水平主要由信息技術(shù)水平和物流技術(shù)水平等構(gòu)成。信息技術(shù)水平指B2C企業(yè)的網(wǎng)站系統(tǒng)建設(shè)、信息化水平的建設(shè)等；物流技術(shù)能力是指物流軟技術(shù)，包括系統(tǒng)工程技術(shù)、價值工程技術(shù)、配送技術(shù)等。技術(shù)創(chuàng)新能力是引領(lǐng)市場需求、減少成本、增大企業(yè)市場規(guī)模的物質(zhì)基礎(chǔ)，B2C企業(yè)的信息技術(shù)和物流技術(shù)的學(xué)習(xí)創(chuàng)新在優(yōu)化企業(yè)產(chǎn)品/服務(wù)組合、降低企業(yè)成本、提升企業(yè)主營業(yè)務(wù)的異質(zhì)性、獨(dú)特性方面發(fā)揮重要作用。

1.3 小鼠免疫試驗(yàn)

選擇6 周大小的雌性Balb/c 小鼠，用完全抗原OTA-H1-BSA 免疫5 只小鼠，具體步驟為：將完全抗原OTA-H1-BSA 用PBS 緩沖液溶解稀釋至1.0 mg/mL。第1 次免疫時取1.0 mL 完全抗原與1.0 mL 完全弗氏佐劑混合并充分乳化。每只小鼠腹腔注射0.1 mL 乳化好的完全抗原，背部多點(diǎn)注射0.1 mL。第2 次免疫時取1.0 mL 完全抗原與1.0 mL 不完全弗氏佐劑乳化，其他操作與第1 次相同，第3 次免疫時與第2 次完全相同。每次免疫的間隔期為2 周，第3 次免疫1 周后用毛細(xì)管從小鼠眼角靜脈竇處采血，用間接競爭酶聯(lián)免疫分析法(ic-ELISA)檢測血清的效價和抑制，效價定義為OD 值為1.0 時的抗血清的最大稀釋倍數(shù)。間接競爭酶聯(lián)免疫分析檢測血清的具體操作如下所示。

1) 用包被緩沖液將包被抗原稀釋成系列濃度，酶標(biāo)板每孔加100 μL，37 ℃溫育3 h，用PBST 洗板3 次后甩干。

2) 用樣品稀釋液將抗血清稀釋成系列濃度。在每組包被抗原及抗血清濃度梯度棋盤組合下分別設(shè)置1 000 ng/mL OTA 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋液空白對照孔，每孔50 μL，再加入50 μL 系列濃度梯度的抗血清，37 ℃溫育30 min，用PBST 洗板3 次后甩干。

3) 每孔加入100 μL 用PBSTG 稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，37 ℃溫育30 min，用PBST 洗板3 次后甩干。

4) 每孔加入100 μL OPD 底物溶液，37 ℃避光顯色10～15 min 后，每孔加入50 μL 2 mol/L 的硫酸溶液終止反應(yīng)，在492 nm 下測定吸光值。

1.4 間接競爭酶聯(lián)免疫分析法的建立

間接競爭法用抗原包板，用棋盤滴定法優(yōu)化包被抗原和抗體最佳濃度組合濃度。固定包被抗原稀釋倍數(shù)為1 000、2 000、4 000、8 000 倍，抗體稀釋倍數(shù)為1 000、2 000、4 000、8 000 倍，每一個濃度組合包含一個空白孔(不加標(biāo)樣)和一個抑制孔(加標(biāo)樣)。選取最佳濃度組合必須同時考慮空白孔的吸光度和對應(yīng)的抑制孔的抑制率。一般空白孔的吸光度控制在0.8～1.0 較合適，在此前提下抑制率越高越好。確定最佳濃度組合后，在最佳濃度組合下做出工作曲線，計算工作曲線IC50，IC50越小，檢測越靈敏，檢測范圍定義為IC20～I(xiàn)C80抑制濃度。

1.5 添加回收實(shí)驗(yàn)

從市場購買不同品種的小麥，按照國標(biāo)方法[30]用HPLC 進(jìn)行檢測，選擇不含OTA 的陰性樣品用于添加回收實(shí)驗(yàn)。添加回收實(shí)驗(yàn)具體步驟如下：取5.0 g 的陰性小麥樣品置于離心管中，加入不同濃度的OTA 標(biāo)準(zhǔn)品，加入25 mL 提取液(70%的甲醇水溶液)，在多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩提取10 min 后過濾提取液，離心取上清液，上清液用樣品稀釋液稀釋10 倍后用于分析。作為對照，取空白樣品進(jìn)行同樣處理后用于分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 半抗原和完全抗原的結(jié)構(gòu)表征與鑒定

本文采用核磁氫譜、核磁碳譜和高分辨質(zhì)譜對半抗原OTA-H1 進(jìn)行表征，結(jié)果表明半抗原結(jié)構(gòu)正確。表征數(shù)據(jù)如下：1H NMR (400 MHz，CDCl3)：δ 12.73 (s,1H),8.54 (dd,J=7.4,2.7 Hz,1H),8.29(d,J=1.4 Hz,1H),7.26 -7.08 (m,6H),6.37 (t,J=5.4 Hz,1H),4.76 (d,J=7.2 Hz,1H),4.68 (dd,J=5.8,2.3 Hz,1H),3.24 -3.04 (m,5H),2.77 (ddd,J=17.4,11.6,3.1 Hz,1H),2.16 (t,J=7.1 Hz,2H),1.70 -1.61 (m,2H),1.52 (d,J=6.3 Hz,3H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)：δ 176.56,170.86,169.73,169.70,162.93,159.00,157.60,140.95,140.92,138.82,136.57,129.33,128.66,127.08,123.16,120.49,110.11,75.92,55.67,38.97,38.41,32.25,31.50,29.70,24.46,20.68.HRMS calcd for C24H25ClN2O7：[M+H+]489.142 3,found 489.142 6。

OTA 完全抗原的表征結(jié)果如圖3 和圖4 所示，其中圖3 為OTA-H1-BSA 的紫外-可見吸收光譜圖，圖4 為OTA-H1-OVA 的紫外-可見吸收光譜圖。圖3 中BSA 的特征吸收峰在278 nm 附近，對應(yīng)的是蛋白中酪氨酸殘基的吸收峰。OTA-H1 的特征吸收峰在380 nm 附近。作為BSA 和OTAH1 的偶聯(lián)物，OTA-H1-BSA 同時在278 nm 附近和380 nm 附近出現(xiàn)吸收峰，這表明偶聯(lián)物OTAH1-BSA 同時含有BSA 結(jié)構(gòu)單元和OTA-H1 結(jié)構(gòu)的單元，因此偶聯(lián)成功。圖4 中偶聯(lián)物OTA-H1-OVA 也同樣在279 nm 和380 nm 附近出現(xiàn)吸收峰，這表明偶聯(lián)物OTA-H1-OVA 偶聯(lián)成功，因此OTA 的完全抗原制備成功。

圖3 OTA-H1、BSA、OTA-H1-BSA 的紫外吸收光譜圖

圖4 OTA-H1、OVA、OTA-H1-OVA 的紫外吸收光譜圖

2.2 小鼠血清效價及抑制的檢測

免疫的5 只小鼠均有較高的效價與抑制，其中5 號小鼠的效價最高，抑制最好(見表1)。當(dāng)小鼠血清稀釋8 000 倍時，對照孔的吸光度仍然超過1.0，因此小鼠血清的效價超過8 000，并且對OTA有較好的抑制(包被抗原和血清都稀釋8 000 倍時，抑制率為50%)；因此，該小鼠可用于后面單克隆抗體的制備。

表1 赭曲霉毒素A 融合小鼠血清效價及抑制反應(yīng)的檢測

2.3 間接競爭酶聯(lián)免疫分析法的建立

2.3.1 工作曲線的建立

綜合考慮空白孔的吸光度和對應(yīng)抑制孔的抑制率，選擇抗體稀釋4 000 倍，包被抗原為OTAH1-OVA 稀釋8 000 倍，在此濃度組合下做出工作曲線如圖5 所示，工作曲線IC50為0.04 ng/mL，比文獻(xiàn)報道的靈敏度提高了30 倍[29]，檢測范圍為0.01 ng～0.17 ng/mL(IC20～I(xiàn)C80抑制濃度)。

圖5 赭曲霉毒素A 間接競爭酶聯(lián)免疫法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 添加回收實(shí)驗(yàn)

根據(jù)工作曲線的檢測范圍，在樣品中分別添加3 個質(zhì)量濃度(2.5、5.0、8 ng/mg)的OTA，每個質(zhì)量濃度3 次平行，采用1.5 中的方法對樣品進(jìn)行前處理后用于分析，添加回收實(shí)驗(yàn)計算公式如下：

添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，兩種小麥樣品的添加回收率范圍分別為：86.7%～102.0%、85.8%～101.4%，變異系數(shù)分別為3.6%～5%、1.8%～4.7%，一般認(rèn)為回收率在80%～120%之間為合理范圍，因此本實(shí)驗(yàn)建立的ic-ELISA 方法具有較高的準(zhǔn)確性和精密度，可用于小麥樣品中OTA 的檢測[30]。

表2 紅小麥、白小麥中OTA 的添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究設(shè)計合成了結(jié)構(gòu)合理的新OTA 半抗原，增加了OTA 分子與載體蛋白之間的連接臂，有利于完全抗原中OTA 分子抗原表位的完全暴露，這樣有助于提高抗體親和力，得到高靈敏的OTA抗體。以完全抗原OTA-H1-BSA 作為免疫原免疫小鼠，小鼠的血清效價為8 000，并且對OTA 有一定的抑制，可用于進(jìn)一步制備OTA 的單克隆抗體。以完全抗原OTA-H1-OVA 作為包被抗原，建立了OTA 的間接競爭酶聯(lián)免疫分析法，該方法對OTA 的IC50為0.04 ng/mL，比文獻(xiàn)[29]報道的OTA 檢測靈敏度提高了30 倍。本文采用建立的方法對小麥樣品做了添加回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和精密度，可以用實(shí)際樣品的檢測。