喬 丹，李永亮，葛學(xué)軍*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)院，山西 太原 030001；2.北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)院，北京 100081)

齲病是影響人類口腔健康的最常見疾病之一，是以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生的慢性破壞性疾病[1-2]。變異鏈球菌(Streptococcusmutans)是目前公認(rèn)的齲病主要致病菌，可以利用蔗糖等碳水化合物形成細(xì)胞外多糖基質(zhì)，包裹細(xì)菌黏附并定殖于牙齒表面形成牙菌斑生物膜[3-4]。細(xì)菌在這種生物膜基質(zhì)保護(hù)下代謝碳水化合物產(chǎn)酸并逃避唾液沖刷和外界刺激，進(jìn)而造成牙體組織脫礦形成齲壞[4-5]。因此，研究變異鏈球菌的生理調(diào)節(jié)過程，理解其中的作用機(jī)制，尋找潛在的藥物作用靶點(diǎn)，將會為研發(fā)新型的抗齲藥物提供參考。細(xì)胞分裂是細(xì)菌繁殖及黏附定殖的基礎(chǔ)，通過不斷分裂增加細(xì)菌數(shù)量從而幫助在其生態(tài)位上定殖，形成生物膜[6]。因此，細(xì)胞分裂和生物膜形成密不可分。細(xì)菌的二分裂是胞質(zhì)分裂的重要生命過程，F(xiàn)tsZ是分裂過程中的核心骨架蛋白，可以在胞質(zhì)分裂位點(diǎn)處組裝并形成環(huán)形結(jié)構(gòu)—Z ring，啟動胞質(zhì)分裂[7-9]。正確的分裂過程確保子細(xì)胞基因組完整性和正常細(xì)胞形態(tài)，該過程看似簡單，其實是一個多基因參與調(diào)控的過程[10-12]。Z ring定位錯誤，染色體在分離完成之前開始細(xì)胞分裂，導(dǎo)致細(xì)胞不均等分裂[10,13]?？缒さ鞍譓apZ在鏈球菌屬中保守，是近年來在鏈球菌屬中發(fā)現(xiàn)的一種FtsZ調(diào)控機(jī)制[14]。鏈球菌MapZ比FtsZ更早定位于鏈球菌分裂位點(diǎn)，調(diào)控FtsZ準(zhǔn)確定位于分裂位點(diǎn)處并參與細(xì)胞分裂位點(diǎn)處隔膜的形成，進(jìn)而啟動胞質(zhì)分裂[13]。北京大學(xué)口腔醫(yī)院李永亮博士課題組[15]前期通過同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了變異鏈球菌mapZ基因缺失突變菌株ΔsmmapZ，經(jīng)過多次傳代和PCR技術(shù)鑒定該突變株能穩(wěn)定傳代。前期研究發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌跨膜蛋白MapZ可以對FtsZ的運(yùn)動路徑進(jìn)行限制和引導(dǎo)，從而保證FtsZ的準(zhǔn)確定位。但變異鏈球菌mapZ基因缺失是否會影響變異鏈球菌其他生理過程，仍不清楚。在此基礎(chǔ)上，本研究利用mapZ基因缺失突變菌株，研究mapZ基因缺失對變異鏈球菌細(xì)胞生長分裂、分裂基因ftsZ的相對表達(dá)量以及在口腔常用抑菌藥物氯己定存在下形成生物膜能力等生理過程的影響，探討mapZ在抗齲藥物開發(fā)中作為潛在作用靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 變異鏈球菌(Streptococcusmutans)標(biāo)準(zhǔn)株UA159、mapZ基因突變菌株ΔsmmapZ以及mapZ回復(fù)株mapZ+，均由北京大學(xué)口腔醫(yī)院中心實驗室惠贈。突變株ΔsmmapZ由課題組前期制備，具體方法如下[15]：①在NCBI上找到UA159mapZ上下游各2 kbp的序列，根據(jù)這段序列分別設(shè)計上游和下游引物，擴(kuò)增出800～1 000 bp DNA片段。②利用融合PCR將①中上下游片段與IFDC2片段融合。③將融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入UA159中，用紅霉素抗性BHI平板篩選出smmapZ基因敲除菌，但此時菌株在mapZ基因處殘留IFDC2片段。④再次按照①步驟擴(kuò)增上、下游片段，將兩片段融合。⑤將④中片段再次轉(zhuǎn)化入③中mapZ基因敲除菌，用帶有p-Cl-phe的BHI板篩選，最終得到mapZ基因敲除且不含IFDC2的突變株。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①BHI液體培養(yǎng)基:稱取3.7 g腦浸心肉湯粉劑溶解于100 mL MiliQ水中，121 ℃高壓滅菌15 min后在4 ℃冰箱保存；②BHIS(1%蔗糖)液體培養(yǎng)基：稱取3.7 g腦浸心肉湯粉劑和1 g蔗糖粉末溶解于100 mL MiliQ水中，121 ℃高壓滅菌15 min后在4 ℃冰箱保存；③BHI固體培養(yǎng)基:稱取3.7 g腦浸心肉湯粉劑溶于100 mL MiliQ水中，混勻溶解后加入7.5 g瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌15 min后，冷卻至 50 ℃左右后倒入一次性培養(yǎng)皿中，在超凈臺中放置 30 min，充分凝固后密封培養(yǎng)皿口倒置于 4 ℃冰箱保存；④THY液體培養(yǎng)基(每100 mL)：THB粉末3 g，酵母提取物粉末0.3 g，四環(huán)素粉末2.5 mg，ZnCl2溶液(儲存液濃度為0.2 mol/L)100 μL，MiliQ水溶液100 mL；⑤THY固體培養(yǎng)基：THB粉末3 g，酵母提取物粉末0.3 g，四環(huán)素粉末2.5 mg，瓊脂粉2 g；MiliQ水溶液100 mL。

1.1.3 試劑與儀器 0.1%結(jié)晶紫溶液(索萊寶，中國)；RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)，中國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑(東洋紡，日本)。電子掃描電鏡(830.10U3，日本日立)；酶標(biāo)儀(EL808，美國伯騰公司)；實時熒光定量PCR儀(7500，美國賽默飛世爾)；恒溫混勻儀(ThermoMixer C，德國艾本德)；核酸蛋白分析儀(NanoDrop 8000，美國賽默飛世爾)；離心機(jī)(5430，德國 艾本德)；漩渦混勻儀(VORTEXZ，德國艾卡)；水平搖床(WD-9405B，中國沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司)；二氧化碳孵箱(Heraeus HERAcel，美國賽默飛世爾)；生物安全柜(1300A2，美國賽默飛世爾)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的復(fù)蘇 變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株UA159、ΔsmmapZ復(fù)蘇于BHI固體培養(yǎng)基，mapZ+復(fù)蘇于THY(含2.5 μg/mL四環(huán)素)固體培養(yǎng)基后，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，經(jīng)菌落形態(tài)學(xué)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定為變異鏈球菌。將變異鏈球菌單菌落過夜培養(yǎng)，次日菌液以1∶100分別接種于BHI和THY(含2.5 μg/mL四環(huán)素和0.2 mmol/L ZnCl2)液體培養(yǎng)基，孵育到對數(shù)期，調(diào)整有效活菌數(shù)為108cfu/mL備用。

1.2.2 掃描電鏡(SEM)觀察變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株UA159、ΔsmmapZ菌細(xì)胞形態(tài)及生長分裂差異 菌液和BHIS(含1%蔗糖)液體培養(yǎng)基以1∶100置入加有無菌硅片的24孔板內(nèi)，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后將硅片移至新孔，沖洗，2.5%戊二醛固定4 h(固定溫度4 ℃)，梯度脫水(50%、70%、80%、90%、100%乙醇)，室溫下自然干燥，噴金，SEM下觀察。

1.2.3 變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株UA159和突變株ΔsmmapZ以及回復(fù)株mapZ+的ftsZ基因相對表達(dá)量測定 變異鏈球菌各菌株總RNA的提?。喝?shù)期菌液各10 mL，在4 ℃條件下12 000 r/min離心4 min后，PBS重懸2次，再次離心(離心條件同前)。在菌沉淀中加入100 μL溶菌酶(20 mg/mL)，混勻后37 ℃恒溫混勻儀孵育1 h破壁。依照細(xì)菌RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總RNA，提取操作均在生物安全柜中進(jìn)行(離心均在4 ℃條件下)，步驟如下：①破壁后的菌液加入350 μL Buffer RL緩沖液，渦旋振蕩后全部加入過濾柱Spin Columns FL中，12 000 r/min離心2 min；②向①中得到的濾液中加250 μL無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱Spin Columns RM，12 000 r/min離心1 min，吸掉廢液，重新將柱放回收集管中；③吸附柱中加入350 μL RW1buffer緩沖液，其余步驟同②；④吸附柱中加入80 μL DNaseI混合液，20～30 ℃孵育15 min；⑤重復(fù)步驟③；⑥吸附柱加入500 μL RW2緩沖液，12 000 r/min離心1 min棄廢液；⑦重復(fù)步驟⑥后繼續(xù)12 000 r/min, 離心2 min；⑧50 μL RNase-free water洗脫，12 000 r/min離心1 min，收集RNA溶液，Nanodrop 8000檢測質(zhì)量及濃度，-80 ℃保存。變異鏈球菌RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA：依照ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒說明書步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作步驟如下：①RNA在65 ℃條件下熱變性5 min后，立即置于冰上冷卻；②在冰上配制如下反應(yīng)液(10 μL體系)：5×RT Master Mix 2 μL、RNA template 5 μL、Nuclease-free Water 3 μL；③在PCR儀設(shè)定逆轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min，4 ℃保持；④逆轉(zhuǎn)錄完成后，cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?。real-time PCR檢測變異鏈球菌分裂基因ftsZ的相對表達(dá)量：Primer5軟件設(shè)計最優(yōu)引物(表1)，實時定量熒光PCR儀檢測菌株ftsZ基因的相對表達(dá)含量，16S rRNA作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：①Starlighter SYBR Green qPCR Mix 10 μL、正反向引物各1 μL、ROX 0.4 μL、cDNA 1 μL、Nuclease-free Water 6.6 μL; ②運(yùn)行程序：95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s，擴(kuò)增循環(huán)設(shè)為35個循環(huán)。real-time PCR擴(kuò)增完成后分析溶解曲線，2-ΔΔCt對樣本進(jìn)行相對定量。SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入和CT值統(tǒng)計分析。

表1 引物序列

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定及不同氯己定(CHX)藥物濃度下變異鏈球菌生物膜的形成 二倍稀釋法測定藥物MIC：于96孔板各孔中加入50 μL BHIS(含1%蔗糖)液體培養(yǎng)基，在第1孔中加入50 μL CHX(4 mg/mL)，充分混勻后，各取50 μL加到下一孔，以此類推，第6孔取50 μL棄去。調(diào)整變異鏈球菌UA159、ΔsmmapZ濃度為104cfu/mL，于各孔中加50 μL菌液，使每孔最終藥物質(zhì)量濃度分別為1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 μg/mL。CO2孵箱培養(yǎng)過夜，次日觀察每孔的渾濁程度，以肉眼看不到渾濁的最小濃度為最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)晶紫檢測不同CHX藥物濃度下變異鏈球菌生物膜的形成：在二倍稀釋法測定藥物MIC(即在CHX藥物濃度為1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 μg/mL條件下培養(yǎng)變異鏈球菌)的實驗基礎(chǔ)上，CO2孵箱培養(yǎng)過夜，待形成生物膜后，先測菌液的OD630值，記錄數(shù)據(jù)，然后吸走菌液，PBS緩慢沖洗3次，晾干，每孔加入50 μL結(jié)晶紫(0.1%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))染色15 min，棄廢液，PBS再次緩慢沖洗3次，晾干后觀察生物膜的染色情況。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗重復(fù)3次，每次設(shè)3個平行對照實驗。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)學(xué)計分析,兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株UA159、ΔsmmapZ掃描電鏡結(jié)果

利用掃描電鏡對UA159和ΔsmmapZ基因缺失突變株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，野生株呈現(xiàn)類桿狀形態(tài)(圖1c)，分離隔膜處于菌細(xì)胞的正中位置(圖1d白色實線)。但是ΔsmmapZ細(xì)胞形態(tài)變的短圓，呈短鏈狀(圖1a)，并且胞質(zhì)分裂不均勻且分裂隔膜位置偏離正中(圖1b白色實線和箭頭所示)，分裂隔膜位置偏離細(xì)菌正中位置(圖1)。這與前期的研究結(jié)果相似，證實了mapZ基因?qū)?xì)胞生長分裂的影響[10，13-14]。

圖1 ΔsmmapZ、UA159掃描電鏡(SEM)圖

2.2 分裂基因ftsZ的相對表達(dá)量

采用實時定量熒光PCR對ftsZ的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，ΔsmmapZ株中，ftsZ表達(dá)量相較UA159下降了四分之一(P<0.01)，有顯著性差異。在回復(fù)株mapZ+中發(fā)現(xiàn)，雖然ftsZ的表達(dá)量低于野生株，但相對于ΔsmmapZ株ftsZ的表達(dá)量有顯著恢復(fù)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。雖然在回復(fù)株中ftsZ表達(dá)量并未完全恢復(fù)到與野生株UA159一致的水平，但這對Li等[15]的實驗中回復(fù)株恢復(fù)野生株形態(tài)是足夠的。

圖2 S.mutans各菌株相關(guān)分裂基因ftsZ的相對表達(dá)含量

2.3 最小抑菌濃度測定及不同質(zhì)量濃度CHX下生物膜的形成

2.3.1 最小抑菌濃度(MIC) 通過測定UA159與ΔsmmapZ對CHX的最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)UA159的MIC為0.250 00 μg/mL，而ΔsmmapZ的MIC則為0.125 00 μg/mL。

2.3.2 不同質(zhì)量濃度CHX下生物膜的形成 變異鏈球菌ΔsmmapZ在CHX質(zhì)量濃度為0.062 50和0.031 25 μg/mL的情況下雖然可以形成生物膜，但浮游菌的數(shù)量仍比UA159少(圖3a)，這兩組OD630值相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；UA159在CHX質(zhì)量濃度為0.125 00、0.062 50及0.031 25 μg/mL均可以形成生物膜(被結(jié)晶紫染色的即為有生物膜形成)，而ΔsmmapZ只在0.062 50以及0.031 25 μg/mL質(zhì)量濃度條件下形成生物膜，當(dāng)CHX質(zhì)量濃度為0.125 00 μg/mL則無法形成生物膜(圖3b)。

圖3 UA159、ΔsmmapZ在不同CHX質(zhì)量濃度下的生長及生物膜形成情況

3 討 論

變異鏈球菌是公認(rèn)的致齲菌，其致齲性與形成強(qiáng)健生物膜、產(chǎn)酸、耐酸性等有關(guān)[5]。細(xì)菌胞質(zhì)分裂過程對于變形鏈球菌生長、增殖以及形成生物膜至關(guān)重要，是潛在的抗齲藥物研發(fā)作用靶點(diǎn)。MapZ是近年來發(fā)現(xiàn)鏈球菌中主要的FtsZ調(diào)控機(jī)制。MapZ作為FtsZ定位Z ring的準(zhǔn)確信號，決定分裂隔膜的形成位置和分裂位點(diǎn)，Z ring在錯誤位置形成會導(dǎo)致細(xì)胞不均等分裂[13]。Zring定位錯誤，導(dǎo)致染色體在分離完成之前開始細(xì)胞分裂，最終導(dǎo)致隔膜損壞染色體, 大大影響細(xì)菌的生長繁殖[10]。

有學(xué)者利用電子顯微鏡和熒光顯微鏡首先在肺炎鏈球菌中，觀察到了MapZ缺失會導(dǎo)致肺炎鏈菌球菌細(xì)胞大小以及分裂隔膜微觀結(jié)構(gòu)的改變[13]。隨后，Li等[15]在敲除變異鏈球菌的mapZ基因后，通過熒光顯微鏡觀察到mapZ基因的缺失同樣也會導(dǎo)致變異鏈球菌細(xì)胞大小發(fā)生改變(有迷你細(xì)胞形成)，但未對細(xì)菌細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察。本研究利用掃描電鏡觀察到變異鏈球菌mapZ基因缺失后，變異鏈球菌變?yōu)槎替湢?，分裂不均等。這進(jìn)一步證明了MapZ在變異鏈球菌中對分裂隔膜定位的影響。骨架蛋白FtsZ的空間定位直接決定了分裂隔膜的定位，mapZ缺失會影響FtsZ空間定位，但是否會影響ftsZ的表達(dá)仍不清楚。本研究通過實時定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，mapZ基因缺失后變異鏈球菌中ftsZ的表達(dá)量下降，在回復(fù)株mapZ+(外源表達(dá)mapZ)中ftsZ表達(dá)量明顯上升，但是仍未恢復(fù)到野生株水平。Holeǒková等[14]的研究表明，外源表達(dá)的MapZ(也稱locZ)表達(dá)量低于野生株中內(nèi)源MapZ，但是外源表達(dá)的MapZ已經(jīng)足夠回復(fù)株恢復(fù)野生株的表型。因此推測回復(fù)株中ftsZ的表達(dá)量較低是由于突變株mapZ表達(dá)量低于野生株,這進(jìn)一步說明了mapZ對ftsZ有正反饋調(diào)控作用。

形成菌斑生物膜是變異鏈球菌的主要致齲特點(diǎn)，在有蔗糖存在的情況下，變異鏈球菌可以代謝蔗糖形成胞外基質(zhì)，從而形成強(qiáng)健的生物膜附著于牙齒表面[16-17]。變異鏈球菌對口腔中復(fù)雜環(huán)境的耐受性較強(qiáng)，依靠菌斑生物膜在口腔中持久發(fā)揮作用[18]。CHX是口腔常用抑菌劑，作為廣譜抑菌殺菌劑長達(dá)30多年[19]。CHX可以吸附在細(xì)菌胞漿膜的滲透屏障，使內(nèi)容物泄露，在低濃度時呈抑菌作用，高濃度時呈殺菌作用，對革蘭陽性菌殺滅效果更佳。但CHX長期使用對人體細(xì)胞具有毒性且會造成味覺變化和口腔染色問題，因此通過其他方式降低CHX工作濃度尤為重要[20]。本研究發(fā)現(xiàn)MapZ缺失可以降低CHX的MIC，這可能是由于變異鏈球菌在失去mapZ基因調(diào)控后，Z ring位置紊亂造成細(xì)菌細(xì)胞分裂隔膜位置紊亂、胞質(zhì)分裂不均致使子細(xì)胞細(xì)胞膜組分改變，在受到帶正電的CHX陽離子刺激后，細(xì)胞膜通透性改變無法及時做出相應(yīng)快速的防御反應(yīng)而造成細(xì)菌細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)不可逆損傷而死亡[21]。提示變異鏈球菌敲除mapZ后對藥物耐受性降低導(dǎo)致形成生物膜能力下降，這對降低CHX在口腔治療中用藥的工作濃度具有參考意義。

本研究只描述了缺失mapZ后變異鏈球菌細(xì)胞分裂隔膜的位置和細(xì)胞形態(tài)大小變化，關(guān)于隔膜位置的細(xì)胞壁如何變化以及細(xì)胞壁對細(xì)胞膜的影響未進(jìn)行深入研究。研究中發(fā)現(xiàn)，mapZ缺失可以降低變異鏈球菌對CHX的耐受性和形成生物膜的能力，但對具體分子機(jī)制也未進(jìn)行深入研究。

變異鏈球菌敲除mapZ基因后對細(xì)菌細(xì)胞生長形態(tài)、分裂隔膜，以及在氯己定藥物作用下成膜能力均有影響。MapZ有望作為新型抗齲藥物的靶點(diǎn)。