周大祥，龍泉洲，李彥杰，鄧雪松

(1.重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，重慶 萬州 404120；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶 萬州 404120)

茄科羅爾斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)是一種可在全球范圍內(nèi)造成嚴(yán)重危害的重要植物病原細(xì)菌，可侵染50多個(gè)科的數(shù)百種植物，其中對(duì)茄科植物的危害最嚴(yán)重，是世界上分布最廣、危害最重且最難防治的重大細(xì)菌性病害[1]。茄科羅爾斯通氏菌作為一個(gè)復(fù)雜的群體，生理分化明顯，不同寄主來源的菌株在寄主范圍、演化型(Phylotype)、生化型和致病力等細(xì)菌學(xué)特征上有很大差異[2-5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)茄科羅爾斯通氏菌的研究主要從分泌系統(tǒng)[6]、群體感應(yīng)[7]、毒性基因[8]和致病力分化[9]等方面進(jìn)行。最近王曉林[10]報(bào)道對(duì)青枯菌菌株P(guān)o82在銅脅迫及侵染過程中的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)掘了新的銅抗性相關(guān)基因，但利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)全面挖掘茄科羅爾斯通氏菌致病相關(guān)基因，對(duì)其通過哪些信號(hào)通路響應(yīng)致病過程還未見報(bào)道。本研究首先從染病番茄中分離出致病性和無致病性茄科羅爾斯通氏菌，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過基因差異表達(dá)、COG、GO和KEGG等分析方法，挖掘茄科羅爾斯通氏菌在不同致病力條件下的轉(zhuǎn)錄本差異，以期加深對(duì)茄科羅爾斯通氏菌在不同致病力條件下基因表達(dá)的理解，為進(jìn)一步深入研究茄科羅爾斯通氏菌致病分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 致病性茄科羅爾斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)(RS+)和無致病性茄科羅爾斯通氏菌(RS-)從番茄植株上分離，由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院馬貫華鑒定并饋贈(zèng)。菌株在常溫下保存于滅菌蒸餾水中。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①NB培養(yǎng)基：牛肉浸膏3，酵母浸膏1，蛋白胨5，葡萄糖10，蒸餾水加至1 000 mL，pH值6.8～7.0。②TTC培養(yǎng)基：蛋白胨10，酸水解酪蛋白1，葡萄糖5，瓊脂18，蒸餾水加至1 000 mL，pH 7.0，滅菌放涼后加經(jīng)過濾滅菌濃度為1%的TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)5 mL。

1.1.3 主要試劑與儀器 SV Total RNA Isolation System細(xì)菌總RNA提取試劑盒(美國(guó)Promega)；PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara)；SYBR Premix Ex Tax II熒光定量PCR試劑盒(日本Takara)；TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)(北京鼎國(guó))。常規(guī)PCR儀(C1000，美國(guó)BIO-RAD)；Quantitative Real-Time PCR儀(CFX96，美國(guó)BIO-RAD)；分光光度計(jì)(Nanodrop-2000，美國(guó)Thermo)；光照培養(yǎng)箱(MGC-250BP-2，上海一恒)；核酸電泳儀機(jī)(164-5050，美國(guó)BIO-RAD)；凝膠成像系統(tǒng)(Versadoc1000,美國(guó)BIO-RAD)；溫控?fù)u床(MaxQ4000,美國(guó)Thermo)；超純水儀(IQ7000,美國(guó)Milli-Q)。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)序樣品的制備及測(cè)序 將致病性與無致病性番茄茄科羅爾斯通氏菌進(jìn)行TTC平板培養(yǎng)鑒定，注莖接種法接種番茄進(jìn)一步鑒定致病性。取致病性與無致病性茄科羅爾斯通氏菌分別接種于20 mL NB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)(28 ℃，250 r/min)至A600約為0.8(以NB培養(yǎng)基為對(duì)照)，得到活菌懸液。取兩種茄科羅爾斯通氏菌懸液各1 mL，10 000 r/min離心30 s，棄上清，再用1 mL NA液體培養(yǎng)基重懸。參照SV Total RNA Isolation System(Promega)試劑盒方法提取細(xì)菌總RNA，Nanodrop-2000分光光度計(jì)檢測(cè)樣品總RNAOD260/280在1.8～2.2之間，電泳檢測(cè)樣品總RNA無明顯降解且23S條帶亮度高于16S條帶1.5倍以上，合格的總RNA可以用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 兩株菌的mRNA富集及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托上海國(guó)家人類基因組南方研究中心，在Illumina HiseqTM2500中進(jìn)行雙向測(cè)序。參考基因組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，首先對(duì)raw reads進(jìn)行質(zhì)控和過濾，以參考基因組(茄科羅爾斯通氏菌GMI1000(序列號(hào)：AL646053.1))為參考序列，將clean reads 映射到參考基因組的編碼序列上，再利用Trinity軟件通過序列重疊方法得到重疊群(Contigs)，進(jìn)一步組裝成轉(zhuǎn)錄本(Transcripts)，最后利用Tgicl軟件進(jìn)行聚類去冗余得到Unigene。BIAST分別對(duì)Unigene進(jìn)行差異基因表達(dá)、COG、GO、KEGG等數(shù)據(jù)分析?；诓此煞植挤?PossionDis)作差異表達(dá)基因分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)比組樣品間表達(dá)倍數(shù)(fold change)≥2和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discover rate,FDR)<0.001；對(duì)差異表達(dá)基因作GO 和 KEGG功能分類及富集分析，功能和通路顯著富集篩選標(biāo)準(zhǔn)均為FDR≤0.01。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組qRT-PCR驗(yàn)證 選取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中4個(gè)差異表達(dá)基因，通過PrimerQuest Tool在線程序設(shè)計(jì)引物。以gyrB基因作內(nèi)參(表1)，采用PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，SYBR Premix Ex Tax II(Takara)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增平臺(tái)為CFX96 Real-Time PCR System(BIO-RAD，USA)。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用公式：F=2-△△Ct，其中△△Ct =(致病性茄科羅爾斯通氏菌的目的基因的Ct值-致病性茄科羅爾斯通氏菌的內(nèi)參基因的Ct值)-(無致病性茄科羅爾斯通氏菌的目的基因的Ct值-無致病性茄科羅爾斯通氏菌的內(nèi)參基因的Ct值)。

表1 qRT-PCR選用基因及其引物

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

測(cè)序質(zhì)量評(píng)估報(bào)告顯示，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量合格，滿足后續(xù)分析要求(表2)。堿基質(zhì)量分布、GC含量分布、堿基質(zhì)量混合分布、測(cè)序飽和度和均一化分布數(shù)據(jù)合格，可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。clean reads經(jīng)組裝后得到5 111條Contigs，其中大多數(shù)Contigs的長(zhǎng)度在200～2 499 bp之間，顯示測(cè)序數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量較好。

表2 測(cè)序質(zhì)量控制統(tǒng)計(jì)信息

2.2 Contigs的COG功能分類

圖1顯示，將注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)的3 336條Contigs進(jìn)行蛋白直系同源分類，得到24個(gè)功能類別，分別與代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與分泌以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等相關(guān)。其中表達(dá)數(shù)目最多的基因類別是未知功能，其次分別是一般功能預(yù)測(cè)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、轉(zhuǎn)錄和能量的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化等。

圖1 Contigs的COG功能分類

2.3 Contigs的GO功能分類

GO功能分類將Contigs分為分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)和生物過程(biological process)。圖2顯示，生物過程中的代謝過程、細(xì)胞過程、定位、定位建立、生物調(diào)控和刺激應(yīng)答等是茄科羅爾斯通氏菌Contigs最多的種類；細(xì)胞組分中的細(xì)胞、細(xì)胞部件、高分子配合物、細(xì)胞器和細(xì)胞器組分等是Contigs富集較多的種類；生物過程中的催化活性、結(jié)合劑活性、轉(zhuǎn)運(yùn)因子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、結(jié)構(gòu)分子活性和電荷載體活性等是Contigs富集最多的種類。通過GO分析表明，代謝過程、細(xì)胞過程、定位、刺激應(yīng)答、細(xì)胞、細(xì)胞部件、催化活性和結(jié)合劑活性等途徑中的Contigs可能共同參與茄科羅爾斯通氏菌對(duì)植物的侵染過程。

圖2 Contigs的GO功能分類

2.4 Contigs的KEGG功能分類

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)將Contigs分為代謝(metabolism)、遺傳信息處理(genetic information processing)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、細(xì)胞過程(cellular processes)和生物體系統(tǒng)(organismal systems)。通過KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，共有2 672個(gè)基因注釋到27個(gè)信號(hào)通路中。其中，注釋到代謝的最多，為2 023個(gè)，占全部注釋基因的75.71%。其次為注釋到環(huán)境信息處理的膜轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因較多，分別為169和150個(gè)。這些代謝通路中的氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和翻譯等可能在茄科羅爾斯通氏菌對(duì)寄主致病過程中發(fā)揮著重要作用(圖3)。

圖3 Contigs的KEGG功能分類

2.5 差異表達(dá)基因分析

表3顯示，與無致病性茄科羅爾斯通氏菌(RS-)相比，致病性茄科羅爾斯通氏菌(RS+)共發(fā)現(xiàn)779條差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因數(shù)量偏少，可能與轉(zhuǎn)錄組樣品為相同菌株不同致病性有關(guān)。其中上調(diào)表達(dá)376條，占全部差異表達(dá)基因的48.27%，下調(diào)表達(dá)403條，占全部差異表達(dá)基因的51.73%。上調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)范圍為1.00～7.45，差異倍數(shù)均值為1.89，下調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)范圍為1.00～6.71，差異倍數(shù)均值為2.41。上調(diào)表達(dá)基因長(zhǎng)度范圍為141～4 500 bp，平均長(zhǎng)度為1 003 bp，下調(diào)表達(dá)基因長(zhǎng)度范圍為120～9 969 bp，平均長(zhǎng)度為1 104 bp。

表3 差異表達(dá)基因的數(shù)量及表達(dá)變化范圍

2.6 DEGs的GO富集分析

為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)差異表達(dá)基因的功能，在GO功能分類基礎(chǔ)上進(jìn)行GO富集分析。圖4所示，有1 068個(gè)基因注釋到GO富集分析中的差異表達(dá)基因。其中，上調(diào)表達(dá)的差異基因按照富集程度排序，分子功能中的催化活性、結(jié)合劑活性、轉(zhuǎn)運(yùn)因子活性和電荷載體活性等是茄科羅爾斯通氏菌致病時(shí)差異表達(dá)基因富集最多的種類；細(xì)胞組分中的細(xì)胞、細(xì)胞部件、細(xì)胞間區(qū)域、高分子配合物和細(xì)胞器等是差異表達(dá)基因富集較多的種類；生物過程中的代謝過程、細(xì)胞過程、定位、定位建立、生物調(diào)控和刺激應(yīng)答等是差異表達(dá)基因富集最多的種類。下調(diào)表達(dá)的差異基因按照富集程度排序，分子功能中的催化活性、結(jié)合劑活性、分子感應(yīng)器活性、轉(zhuǎn)運(yùn)因子活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性等是差異表達(dá)基因富集最多的種類；細(xì)胞組分中的細(xì)胞、細(xì)胞部件和細(xì)胞器等是差異表達(dá)基因富集較多的種類；生物過程中的細(xì)胞過程、運(yùn)動(dòng)、代謝過程、刺激應(yīng)答、生物調(diào)控和定位等是差異表達(dá)基因富集最多的種類。通過GO富集分析表明，青枯侵染植物時(shí)，代謝過程、調(diào)節(jié)過程、刺激應(yīng)答、細(xì)胞及組分和定位等途徑中的差異表達(dá)基因可能共同參與對(duì)植物的致病響應(yīng)。

圖4 DEGs的GO功能分類

2.7 DEGs的KEGG代謝通路分析

圖5顯示，有425個(gè)基因注釋到信號(hào)通路中的差異表達(dá)基因，共富集到23個(gè)KEGG二級(jí)pathway參與茄科羅爾斯通氏菌致病性響應(yīng)。根據(jù)富集程度從大到小排列，前四個(gè)KEGG富集的顯著信號(hào)通路見表4，其中，富集程度用Q值表示，Q值是由P值經(jīng)過FDR校正后的值，越小表示富集程度越顯著。Q值小于0.05的顯著富集的二級(jí)通路分別為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(cell motility)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)(Membrane transport)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)，進(jìn)一步可將其顯著富集到20個(gè)三級(jí)子代謝通路中(表4)。富集結(jié)果表明，茄科羅爾斯通氏菌對(duì)寄主的響應(yīng)由眾多信號(hào)通路共同參與，其作用方式可能包括增強(qiáng)細(xì)菌趨化性、強(qiáng)化鞭毛組裝能力、提高細(xì)菌分泌系統(tǒng)、上調(diào)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、調(diào)整MAPK信號(hào)通路和增強(qiáng)氨基酸代謝等。

圖5 DEGs的KEGG代謝通路

表4 KEGG富集的顯著信號(hào)通路

2.8 茄科羅爾斯通氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因表達(dá)差異分析

通過分泌系統(tǒng)細(xì)菌將毒力蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，與寄主細(xì)胞發(fā)生相互作用而產(chǎn)生毒性。目前為止，發(fā)現(xiàn)在革蘭陰性病原菌中至少存在7種不同類型的分泌系統(tǒng)(Ⅰ～Ⅶ型分泌系統(tǒng))。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，茄科羅爾斯通氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的hrp基因簇中的23個(gè)基因，有16個(gè)在致病性茄科羅爾斯通氏菌中上調(diào)表達(dá)。在茄科羅爾斯通氏菌中已經(jīng)注釋和假定的78個(gè)Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子中，共有68個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)，其中在致病性茄科羅爾斯通氏菌中有59個(gè)上調(diào)表達(dá)，9個(gè)下調(diào)表達(dá)(表5)。

表5 致病性茄科羅爾斯通氏菌表達(dá)上調(diào)T3SS分泌系統(tǒng)基因簇的相關(guān)基因

2.9 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

隨機(jī)挑選fliC、hrpB、ripX和hrcU等4個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，評(píng)估轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。以log2FC表示基于轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR分析的基因表達(dá)量變化，其中l(wèi)og2FC=log2[RS+表達(dá)量/RS-表達(dá)量]，設(shè)置4次重復(fù)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為r=0.883 9，P<0.01(圖6)，表明基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析差異表達(dá)基因的表達(dá)結(jié)果較為可靠。

圖6 相關(guān)差異表達(dá)基因的qRT-PCR與RNA-seq結(jié)果的相關(guān)性分析

3 討 論

基于高通量、高質(zhì)量和低成本的基礎(chǔ)，Illumina測(cè)序技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)已成為越來越多國(guó)內(nèi)外研究者的主要選擇[11]。本研究從自然界分離的番茄茄科羅爾斯通氏菌致病性和無致病性菌株出發(fā)，通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)挖掘出的茄科羅爾斯通氏菌致病基因，對(duì)后續(xù)探究其致病機(jī)理具有非常重要的意義，并為青枯病生防菌的篩選、應(yīng)用研究提供參考。

轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，RS-和RS+對(duì)比發(fā)現(xiàn)779條差異表達(dá)基因(DEGs)，其中上調(diào)表達(dá)376條，下調(diào)表達(dá)403條。差異表達(dá)基因的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，代謝過程、調(diào)節(jié)過程、刺激應(yīng)答、細(xì)胞及組分和定位等途徑中的差異表達(dá)基因可能共同參與青枯菌對(duì)植物的致病響應(yīng)。而KEGG分析表明，代謝通路中的氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和翻譯等可能在茄科羅爾斯通氏菌對(duì)寄主致病過程中發(fā)揮著重要作用。信號(hào)通路富集表明，茄科羅爾斯通氏菌對(duì)寄主的響應(yīng)由眾多信號(hào)通路共同參與，其作用方式可能包括增強(qiáng)細(xì)菌趨化性、強(qiáng)化鞭毛組裝能力、提高細(xì)菌分泌系統(tǒng)、上調(diào)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、調(diào)整MAPK信號(hào)通路和增強(qiáng)氨基酸代謝等。

鞭毛作為植物病原細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的器官，保證了植物病原細(xì)菌能夠正常運(yùn)動(dòng)[12]，而植物病原細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)向與趨化性相關(guān)，因此，很多病原細(xì)菌的致病性又與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性及趨化性有關(guān)[13-14]。病原菌在侵染植物時(shí)，趨化性具有重要的作用[15]。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，與無致病性茄科羅爾斯通氏菌相比，致病性茄科羅爾斯通氏菌鞭毛組成相關(guān)基因都下調(diào)表達(dá)(motAB-FlhABCDF-flgABCDEFGIJKLMN-fliACDEFGHIJKLMNOPQRST)。而在細(xì)菌趨化性，cheABD1D3D4RWZ1等8個(gè)基因均下調(diào)表達(dá)。推測(cè)茄科羅爾斯通氏菌的運(yùn)動(dòng)性與趨化性降低，影響了病原菌的致病力。

菌毛具有黏附在細(xì)胞表面的能力，與植物病原菌的致病性相關(guān)，與病原菌運(yùn)動(dòng)性無關(guān)，失去菌毛，致病力也隨之喪失[16]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，PilA、PilE2、RSp1092、RSc2675、RSc2677、RSc2678和RSc2679等菌毛相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，結(jié)果與茄科羅爾斯通氏菌致病力喪失一致。

目前為止，發(fā)現(xiàn)在革蘭陰性病原菌中至少存在6種不同類型的分泌系統(tǒng)(Ⅰ～Ⅵ型分泌系統(tǒng))，這些分泌系統(tǒng)通過分泌或注射的方式釋放效應(yīng)蛋白(效應(yīng)子)，以刺激或干擾寄主細(xì)胞的活動(dòng)，從而能夠調(diào)控一系列的病原細(xì)菌-寄主細(xì)胞的相互作用[17]。一系列復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控茄科羅爾斯通氏菌毒力因子的表達(dá)，位于該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心是PhcA—LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[18]。XpsR連接PhcA調(diào)控esp基因的表達(dá)，與VsrC共同激活esp基因的啟動(dòng)子[7,19]。PhcA也調(diào)控作為胞外蛋白相關(guān)基因的tex基因[20]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，茄科羅爾斯通氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的hrp基因簇中的23個(gè)基因，有16個(gè)基因在無致病性茄科羅爾斯通氏菌中下調(diào)表達(dá)(hrpBDFHJKXYZ-hrcCJNQSUV)。在茄科羅爾斯通氏菌中已經(jīng)注釋和假定的78個(gè)Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子中，共有68個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)，其中有59個(gè)下調(diào)表達(dá)，9個(gè)上調(diào)表達(dá)。無致病性茄科羅爾斯通氏菌中phcA基因的表達(dá)量降低不顯著，但xpsR和tek基因表達(dá)量顯著降低，引起esp基因表達(dá)量也顯著降低，推測(cè)xpsR和tek基因影響茄科羅爾斯通氏菌的致病力。