王 鵬, 張穎超, 管軼男, 孔 青*, 郁東興

(1.中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島蔚藍生物股份有限公司，山東 青島 266101；3.青島尚好科技有限公司，山東 青島 266700)

黃曲霉是一種常見的腐生菌真菌和條件致病菌，多見于發(fā)霉的糧食、糧制品及其他霉腐的有機物上。黃曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素是毒性極強的劇毒物質(zhì)，具有明顯的“三致”作用，對人和動物肝臟組織具有嚴重的破壞性，黃曲霉及黃曲霉毒素對多個國家和地區(qū)造成了無法估量的經(jīng)濟損失[1]。黃曲霉是僅次于煙曲霉的第二大致病菌，可在免疫抑制的患者中引起侵襲性曲霉病[2]。黃曲霉基因組中存在豐富的次級代謝產(chǎn)物基因簇，具備產(chǎn)生許多有益的次級代謝產(chǎn)物的能力。預(yù)計將有56個次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇位于黃曲霉基因組中，其中27個基因簇包含至少一種聚酮化合物合酶(PKS)，而26個簇包含至少一種非核糖體肽合成酶(NRPS)[3-4]。在絲狀真菌中，源自NRPS的天然產(chǎn)物包括抗生素、霉菌毒素、鐵載體和生物堿[5]等。這些次級代謝產(chǎn)物的功能有待進一步探討。米曲霉是一種常見的工業(yè)菌株，在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中已經(jīng)被廣泛使用了1 000多年。米曲霉發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)成熟，其安全性已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的認可[6]。Payne等[7]研究表明，黃曲霉和米曲霉之間具有源自同一生態(tài)型的序列高度相似性，由此推測米曲霉是由黃曲霉馴化而來。此外，黃曲霉具有生產(chǎn)纖維素酶和生物乙醇的潛力[8]。目前，大多數(shù)研究中，常用的黃曲霉菌株的全基因組測序已經(jīng)完成。選擇標(biāo)記是分子生物學(xué)中必不可少的組成部分，由于黃曲霉可用的選擇標(biāo)記較少、情況復(fù)雜，因此，黃曲霉的功能基因組學(xué)研究仍受到諸多限制。本文描述了包括黃曲霉選擇標(biāo)記和遺傳轉(zhuǎn)化方法等方面的最新研究進展。此外，還討論了黃曲霉功能基因組學(xué)的應(yīng)用前景及改善黃曲霉功能基因組學(xué)研究策略的潛在技術(shù)。

1 黃曲霉的功能基因組學(xué)策略

1.1 黃曲霉次生代謝生物合成基因簇(BGCs)的預(yù)測

真菌是具有生物活性化合物的天然產(chǎn)物的重要來源之一，并應(yīng)用于從農(nóng)業(yè)到醫(yī)學(xué)等的各個領(lǐng)域。絲狀真菌的一些次生代謝物(SM)如抗生素(青霉素和頭孢菌素)、抗真菌藥物(灰黃霉素)和降低膽固醇的藥物(洛伐他汀)，在食品、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和其他領(lǐng)域均得到了廣泛應(yīng)用[9]。次生代謝物由低分子量物質(zhì)構(gòu)成，通常由大型多模塊PKS和NRPS或異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶和二甲基烯丙基色氨酸合酶組成[5]。Khaldi等[10]設(shè)計和開發(fā)了基于Web軟件的SMURF(www.jcvi.org/smurf/)，根據(jù)基因組背景和范圍系統(tǒng)預(yù)測次生代謝物基因簇。SMURF依靠隱馬爾可夫模型(HMM)檢測真菌基因組中的骨架基因，從而可以準確地恢復(fù)所有基因簇并預(yù)測其他潛在基因簇。最近，Blin等[11]設(shè)計了次生代謝生物合成基因簇快速識別工具antiSMASH(已更新為antiSMASH 5.0)，以便更好地應(yīng)用于次生代謝生物合成基因簇挖掘。PRISM3是一種預(yù)測非核糖體肽以及I型和II型聚酮化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)的工具，在預(yù)測次生代謝生物合成基因簇方面具有很大作用[12]。基于SMURF的分析表明，黃曲霉基因組至少包含70個編碼酶的基因，這些酶催化多種次級代謝物生物合成途徑的第一步[10]。值得注意的是，次生代謝生物合成基因簇的預(yù)測并不完全準確，如存在低估或高估次生代謝生物合成基因簇中的基因功能。因此，要準確了解與次生代謝生物合成基因簇真正關(guān)聯(lián)的基因，只能通過基因敲除來驗證。

1.2 黃曲霉基因研究方法

1.2.1 篩選標(biāo)記 篩選標(biāo)記是黃曲霉功能基因研究的關(guān)鍵問題之一。有效的篩選標(biāo)記可極大提高基因操作效率。目前，黃曲霉的篩選標(biāo)記主要分為兩類：耐藥標(biāo)記和營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記(表1)。Seip等[13]利用β-微管蛋白基因作為篩選標(biāo)記基因，發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)化子對苯并咪唑具有抗性。Ramesh等[14]利用潮霉素抗性基因(hph)作為篩選標(biāo)記基因?qū)S曲霉絲氨酸蛋白酶基因(sep)進行敲除。Chang等[15]利用米曲霉中的巰乙胺抗性基因(ptr)作為篩選標(biāo)記基因，構(gòu)建了Ku70缺陷型黃曲霉菌株。同時，黃曲霉對博來霉素敏感，ble作為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化標(biāo)記物的基因，可使黃曲霉產(chǎn)生博來霉素抗性[16]。最近，Tao等[17]開發(fā)了一種新的羧甲基纖維素作為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化子可以有效地整合到黃曲霉基因組中。但曲霉屬真菌本身具有極強的抗生素抗性；同時，抗生素抗性標(biāo)記在實際生產(chǎn)中存在安全隱患，微生物中耐藥基因的基因流動會增加病原微生物的耐藥性，并對環(huán)境和人類健康構(gòu)成嚴重威脅。

表1 黃曲霉的篩選標(biāo)記

粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)中的Pyr-4是用于黃曲霉轉(zhuǎn)化的最常見篩選標(biāo)記基因之一[18]。Chang等[15]利用寄生曲霉(Aspergillusparasitica)的pyrG基因構(gòu)建一種營養(yǎng)缺陷型黃曲霉尿嘧啶菌株，用于基因敲除研究。pyrG基因編碼的5′-單磷酸胞苷脫羧酶是真菌尿嘧啶生物合成的關(guān)鍵酶，當(dāng)補充尿苷或尿嘧啶時，pyrG突變體才能夠?qū)⑷榍逅岷塑辙D(zhuǎn)化為尿嘧啶，以維持真菌正常生長[6]。niaD基因編碼的NADPH依賴性硝酸鹽還原酶，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，而niaD突變體無法在以硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長[19]。與其他曲霉屬真菌相比，黃曲霉中營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記的種類較少。Fiedller等[20]利用hisB基因作為篩選標(biāo)記基因，構(gòu)建了用于黑曲霉基因靶向研究的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，在其他類似的病原性絲狀真菌如黃曲霉應(yīng)用中極具開發(fā)潛力。Lenouvel等[21]利用argB基因(編碼鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶)的缺失，在黑曲霉中構(gòu)建了一株精氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，并將其應(yīng)用于黑曲霉轉(zhuǎn)化研究。sC基因編碼的ATP 硫酸鹽酶可催化無機硫酸鹽的ATP激活，sC突變體不能利用硫酸鹽作為硫的來源。sC作為篩選標(biāo)記基因已成功地應(yīng)用于各種曲霉中，例如構(gòu)巢曲霉、煙曲霉、黑曲霉、米曲霉[22]等。目前，黃曲霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因開發(fā)較少，hisB、argB和sC等篩選標(biāo)記基因在黃曲霉遺傳學(xué)研究中極具發(fā)展前景。因此，開發(fā)豐富多樣的篩選標(biāo)記基因?qū)τ邳S曲霉基因組學(xué)的研究至關(guān)重要，也將很大程度上提高黃曲霉的轉(zhuǎn)化效率。

1.2.2 黃曲霉轉(zhuǎn)化策略 高效的轉(zhuǎn)化策略是黃曲霉遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)。目前，黃曲霉的轉(zhuǎn)化策略主要分為原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(PMT)和根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(AMT)兩種。其中，PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法是黃曲霉遺傳學(xué)研究中最常用的轉(zhuǎn)化方法。利用多種細胞壁裂解酶，從真菌細胞中制備原生質(zhì)體仍然是制備真菌感受態(tài)細胞的最常見方法。黃曲霉的PMT方法具有以下步驟[15](圖1)：①將10個營養(yǎng)缺陷型菌株孢子(ΔpyrG)接種到100 mL的Czepak-Dox肉湯(含酪蛋白0.5%、硫酸銨10 mmol/L、尿嘧啶0.2%和葡萄糖1%)中，30 ℃、150 r/min恒溫生化培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)11～12 h，100 μm尼龍細胞濾器收集菌絲體[8]。②將收集的菌絲體放入新鮮制備的酶解液中，50～70 r/min、30 ℃水解2～3 h。在酶解過程中，觀察原生質(zhì)體的狀態(tài)以確保原生質(zhì)體的質(zhì)量。酶解液主要有以下兩種：哈茨木霉、裂解酶和細胞壁消化酶，以含有0.55 mol/L KCl、0.05 mol/L檸檬酸溶液(pH 5.8)為溶劑；崩潰酶、β-葡萄糖苷酶、裂解酶，以含有1.2 mol/L NaCl、10 mmol/L NaPO3溶液(pH 7.0)為溶劑。③將收集的原生質(zhì)體用0.6 mol/L KCl、50 mmol/L CaCl2和10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0的溶液洗滌2次，然后加入新鮮配制的50%PEG-4000溶液(10 mmol/L CaCl2、10 mmol/L Tris pH 7.5、0.6 mol/L KCl)。④將每種轉(zhuǎn)化混合物添加到100～130 mL預(yù)熱的再生/選擇培養(yǎng)基(Czapek-box中加入0.6 mol/L KCl和10 mmol/L硫酸銨)中。

圖1 黃曲霉原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(PMT)流程圖

根瘤農(nóng)桿菌是一種植物性病原體，可通過IV型分泌系統(tǒng)將Ti質(zhì)粒上的一部分T-DNA(8個左右的基因在植物細胞內(nèi)表達)轉(zhuǎn)移到宿主中，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生冠狀膽囊腫瘤[23]。若將T-DNA轉(zhuǎn)移到酵母和絲狀真菌中，根瘤農(nóng)桿菌必須具有完整的毒力系統(tǒng)。用于轉(zhuǎn)化的DNA與DNA結(jié)合蛋白VirD2和VirE2一起作為單鏈DNA分子轉(zhuǎn)運到宿主[24]。與原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化相比，根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是一種更有效的基因靶向方法，不需要制備可轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。通常使用乙酰丁香酮作為誘導(dǎo)劑激活細胞表面的VirA和VirG蛋白，這些蛋白可以將其T-DNA隨機轉(zhuǎn)移至受體基因組中的隨機位點[25]。黃曲霉的根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法具有以下步驟(圖2)：①通過電穿孔將載體引入AGL-1感受態(tài)細胞；②將黃曲霉孢子懸浮液和誘導(dǎo)的根瘤農(nóng)桿菌懸浮液的混合物涂布在Co-IM培養(yǎng)基上(IM用5 mmol/L葡萄糖代替10 mmol/L葡萄糖，加1.8%(w/v)瓊脂)[26]；③將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到含有抗生素的選擇培養(yǎng)基中。目前，報道的轉(zhuǎn)化黃曲霉的方法僅有PMT和AMT兩種。PMT和AMT方法的優(yōu)缺點如表2所示。在其他絲狀真菌中，除了這兩種常規(guī)的方法外，還有兩種常用的轉(zhuǎn)化方法電穿孔轉(zhuǎn)化法(ET)和基因槍轉(zhuǎn)化法(BT)。每種方法獨具優(yōu)勢且被應(yīng)用相應(yīng)研究中，適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化方法，可以顯著提高基因工程的成功率。

圖2 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃曲霉轉(zhuǎn)化(AMT)流程圖

表2 黃曲霉兩種常用轉(zhuǎn)化方法的機制和優(yōu)劣勢

2 提高黃曲霉基因操作效率的策略

2.1 缺陷型菌株非同源末端連接(NHEJ)的基因工程研究

當(dāng)外源DNA作為目標(biāo)基因整合到受體染色體時，會涉及到DNA雙鏈斷裂(DSB)，而DNA雙鏈斷裂會導(dǎo)致細胞死亡或多種遺傳變化的損害，可通過非同源末端連接途徑和同源重組(HR)進行修復(fù)[27]?；谕粗亟M的基因敲除是真菌遺傳學(xué)研究中最常用的方法，但大多數(shù)絲狀真菌的同源重組頻率較低(<5%)。因此，在絲狀真菌中，需要通過NHEJ途徑來增加HR途徑以實現(xiàn)高效的基因靶向技術(shù)。

NHEJ過程由DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA-PKcs)、Ku70-Ku80異二聚體和DNA連接酶IV-Xrcc4復(fù)合體介導(dǎo)[28]。在真核細胞中，Ku70-Ku80異二聚體識別斷裂的DNA雙鏈，形成橋接復(fù)合體并集合其他在NHEJ途徑中起到至關(guān)重要作用的NHEJ蛋白[29]。目前，通過敲除ku70/ku80基因的基因靶向技術(shù)已成功地應(yīng)用于包括黑曲霉、米曲霉、醬油曲霉和黃曲霉在內(nèi)的許多曲霉屬物種[15，30-31]。在紅曲霉M7中，通過敲除ku70和ku80，基因置換的頻率從15%分別增加到42.2%和61.5%[29]。在黑曲霉中，ku70和ku80雙缺陷突變體的基因靶向頻率增加到100%[30]。在指狀青霉中，ku70的敲除極大地增加了同源重組的發(fā)生頻率，但同時發(fā)現(xiàn)Δku70菌株的生長和分生孢子的發(fā)育也受到影響。因此，Δku70/ku80被用作基因靶向技術(shù)的受體菌株，必須確認ku70/ku80等基因?qū)Ψ稚咦赢a(chǎn)生以及菌體生長發(fā)育功能無影響[32]。

目前，在黃曲霉中用于遺傳學(xué)研究的受體菌株主要是TJES19.1(Δku70,pyrG-)和CA14(Δku70,pyrG-)[15]。為了提高基因靶向技術(shù)的成功率，應(yīng)盡可能消除NHEJ途徑。ligD基因編碼DNA連接酶IV，參與NHEJ途徑的最后一步。在米曲霉中，ligD敲除菌株的基因靶向頻率高達100%，在青曲霉中，通過破壞ligD，目標(biāo)基因替換的頻率從低于2%增加到85%[34]。在黃曲霉中，可以分別或同時建立Δku70、Δku80和ΔligD菌株，以測試所構(gòu)建菌株的靶基因置換頻率，從而進一步提高基因組學(xué)研究的成功率。

2.2 使用Cre-loxP重組系統(tǒng)拯救標(biāo)記基因

在絲狀真菌中，由于篩選標(biāo)記種類較少，其實用性受到限制，而標(biāo)記拯救方法的出現(xiàn)可以實現(xiàn)連續(xù)基因敲除，從而使基因操作更加方便。噬菌體P1 Cre-loxP重組系統(tǒng)包含重組酶(Cre)，重組酶可特異性識別34 bp的靶DNA序列(loxP)并催化它們之間發(fā)生重組[35]。其原理如圖3所示。首先，構(gòu)建具有上下游同源臂，篩選標(biāo)記基因(M)和loxP位點的載體；然后將具有l(wèi)oxP位點的載體通過同源重組與目標(biāo)基因組置換；最后，Cre重組酶消化loxP位點，以切除整個消化區(qū)域，包括位于loxP側(cè)翼的目標(biāo)基因，并重組原始目標(biāo)基因組。

圖3 Cre-loxP重組原理

通過使用Cre-loxP重組系統(tǒng)，能夠比較容易地在米曲霉中構(gòu)建ΔligD標(biāo)記基因拯救菌株，從而提高了同源重組效率[36]。但是，由于在標(biāo)記物拯救過程中，Cre重組酶介導(dǎo)的切除在基因組上留下了loxP位點，因此使用Cre-loxP系統(tǒng)進行的幾輪基因敲除或整合導(dǎo)致許多l(xiāng)oxP位點在基因組上積累。為了避免由剩余的loxP位點引起的相鄰基因座同源重組而發(fā)生染色體DNA區(qū)域的不必要切除，在米曲霉中，成功地構(gòu)建了具有自滅標(biāo)記回收盒的質(zhì)粒載體[37]。Cre-loxP重組系統(tǒng)同時已成功用于黑曲霉中，可以在有效的細胞工廠中敲除和/或插入多個基因結(jié)構(gòu)，從而用于草酸和蘋果酸的生產(chǎn)[38]。在黃曲霉中，可以通過Cre-loxP重組系統(tǒng)，快速構(gòu)建連續(xù)的基因敲除菌株，可用于研究多個基因?qū)φ婢L發(fā)育功能的相互作用，也可用于快速構(gòu)建NHEJ途徑缺陷的基因研究受體菌株。

2.3 利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)開發(fā)基因組編輯方法

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，是生物體(存在于大多數(shù)細菌和所有古細菌)為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制[39]。Cas9蛋白是一種雙鏈DNA核酸酶，能在介導(dǎo)RNA引導(dǎo)下對靶位點進行切割。CRISPR-Cas系統(tǒng)主要有3種類型，其中II型系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，使RNA介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)成為簡單、方便、快速的功能基因組學(xué)研究工具。

CRISPA-Cas9系統(tǒng)僅需要Cas9核酸酶即可破壞與由crRNA-tracrRNA(反式激活crRNA)雜交體組成的雙介導(dǎo)RNA所匹配的DNA[40]。crRNA-tracrRNA被設(shè)計為具有兩個關(guān)鍵特征的單介導(dǎo)RNA(sgRNA)：5′端的序列通過Watson-Crick堿基配對原則確定DNA靶位點，3′端(雙鏈RNA)是Cas9的結(jié)合端(圖4)[41]。sgRNA原始間隔區(qū)序列的核苷酸(包含20個堿基配對識別的靶位點)可以使RNA介導(dǎo)的Cas9核酸酶準確地定位到靶向DNA序列，通過改變sgRNA的前20個核苷酸以對應(yīng)目標(biāo)DNA的核苷酸序列，且Cas9核酸酶活性可以針對任何帶有N20-NGG形式的DNA序列[42]。Cas9核酸酶對靶位點進行切割后，目標(biāo)基因座通常經(jīng)歷兩次主要的DNA損傷修復(fù)(圖4)：通過NHEJ途徑的易錯修復(fù)或高保真的同源介導(dǎo)的雙鏈DNA修復(fù)(HDR)。在沒有修復(fù)模板的情況下，DNA雙鏈斷裂通過NHEJ過程重新連接以實現(xiàn)突變形式的基因敲除。HDR通過外源加入修復(fù)模板，并使用它在目標(biāo)位置產(chǎn)生精確的修復(fù)。

圖4 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因敲除

目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)已被用于許多曲霉屬的遺傳學(xué)研究中。在煙曲霉中，CRISPR-Cas9系統(tǒng)已成功用于靶向聚酮化合物合酶基因(pksP)的敲除。Cas9核酸酶本身表達對煙曲霉的生長或毒力無影響，因此CRISPR系統(tǒng)可用于煙曲霉相關(guān)的發(fā)病機制研究[43]。在黑曲霉中，使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型受體菌株并整合基因組，整合效率提高到100%[44]。在米曲霉中，使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)開發(fā)基因組編輯方法。這項技術(shù)為廣泛使用的工業(yè)菌株米曲霉的基因工程改造提供便利性[45]。由于使用固定真菌啟動子表達在不同真菌中實際效果存在差異，Cas9和sgRNA基因在不同物種中的表達可能不同。如果Cas9和sgRNA基因表達受限，則RNA定向誘變可能無效。在真核生物中，尋找和優(yōu)化用于sgRNA表達的合適啟動子是一項主要的技術(shù)挑戰(zhàn)。在體內(nèi)表達gRNA的最常見方法是使用兩個位于gRNA兩側(cè)的核酶序列，即5′末端錘頭(HH)和3′末端丁型肝炎病毒(HDV)序列。在黑曲霉中，使用U6啟動子建立了一個簡單的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。sgRNA的轉(zhuǎn)錄由兩個異源(PhU6和PyU6)和一個內(nèi)源性U6啟動子驅(qū)動。雖然簡化了黑曲霉的遺傳操作，但基因編輯效率僅為15%～36%[46]。真核生物中高度保守和有效表達的5S rRNA基因可用作sgRNA啟動子。在米曲霉中，通過構(gòu)建包含基于AMA1帶有抗性標(biāo)記ptrA的自主復(fù)制質(zhì)粒，改進了CRISPR-Cas9方法。由于該質(zhì)粒帶有抗藥性標(biāo)記，供體DNA進行有效的基因編輯無需插入任何選擇標(biāo)記，因此可以重復(fù)進行基因工程研究[47]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)在曲霉中顯示出強大的應(yīng)用潛力，極大地提高了基因編輯的便利性。在黃曲霉中尚未報道CRISPR-Cas9系統(tǒng)，但其極具潛在應(yīng)用價值。CRISPR-Cas9系統(tǒng)無毒，無需標(biāo)記即可連續(xù)進行基因編輯。在研究黃曲霉與植物之間的相互作用時，具有很大的優(yōu)勢。

2.4 RNA干擾(RNAi)技術(shù)

RNA干擾(RNAi)是一種保守的真核基因調(diào)控機制，該機制使用小的非編碼RNA(sRNA)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后/轉(zhuǎn)錄基因沉默。在已鑒定的sRNA中，RNAi主要分為三類：小干擾RNA(siRNA)，microRNA(miRNA)和PIWI相互作用RNA(piRNA)[48]。RNAi最初被描述為一種宿主防御機制，通過產(chǎn)生源自這些外源序列的小干擾RNA或短發(fā)夾RNA(shRNA)，可以保護基因組免受侵入性核酸(例如病毒和轉(zhuǎn)座子)的侵害[49]。RNAi也是在真核生物中誘導(dǎo)基因沉默或敲低的獨特技術(shù)。sRNA由依賴性Dicer酶或非依賴性生物途徑產(chǎn)生，并整合到效應(yīng)蛋白Argonaute(AGO)家族中，通過與靶RNA堿基配對來指導(dǎo)特異性序列的基因沉默[50]。

真核生物中的RNAi由RNAse III酶(Dicer)引發(fā)，該酶將長雙鏈RNA(dsRNA)切割成siRNA，并且siRNA與AGO和其他蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。然后，siRNA/RISC復(fù)合物結(jié)合靶mRNA的互補序列，從而阻止靶轉(zhuǎn)錄本的翻譯[49]。RNAi與CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有明顯的相似性，例如，兩者均使用靶標(biāo)特異性sRNA。表3顯示了RNAi和CRISPR-Cas9技術(shù)的比較。

表3 RNAi和CRISPR-Cas9技術(shù)的比較

基于RNAi技術(shù)的宿主誘導(dǎo)基因沉默(HIGS)是研究真菌與宿主之間相互作用的重要手段之一。真菌sRNA與宿主RNAi機制相互作用，從而下調(diào)宿主的防御基因并增強致病性[51]。宿主誘導(dǎo)的基因沉默在發(fā)展對霉菌毒素具有抗性的農(nóng)作物中具有潛力。例如，用目標(biāo)aflR基因778 bp的RNAi構(gòu)建體轉(zhuǎn)化玉米基因組序列。該構(gòu)建體在宿主植物中產(chǎn)生初級siRNA。當(dāng)植物被黃曲霉菌感染時，初級siRNA進入真菌并切割互補的aflRmRNA序列，從而阻礙aflR基因的表達并導(dǎo)致黃曲霉毒素生物合成的下調(diào)[52]。在玉米種子中，通過構(gòu)建α-淀粉酶基因RNAi構(gòu)建體，抑制了黃曲霉α-淀粉酶(amy1)基因的表達，減少了黃曲霉對宿主的感染，從而導(dǎo)致黃曲霉毒素產(chǎn)量降低[53]。由于具有沉默特性的RNA可以從植物宿主轉(zhuǎn)移到各種入侵病原體, RNAi在研究預(yù)防黃曲霉毒素污染方面具有巨大潛力。

3 黃曲霉功能基因組學(xué)的潛在應(yīng)用

3.1 黃曲霉基因組學(xué)用于闡明主要真菌毒素的合成途徑和調(diào)控

隨著基因組測序技術(shù)的飛速進步，越來越多的黃曲霉菌株完成全基因組測序，其中完成基因組測序最早的是黃曲霉菌株NRRL3357。Faustinelli等[54]報道了8種黃曲霉菌株的基因組序列，其中3種是不產(chǎn)黃曲霉毒素菌株。不產(chǎn)黃曲霉毒素菌株被用作減少黃曲霉毒素污染，是一種用來防治黃曲霉毒素污染的重要生物學(xué)策略。Weaver等[55]報道了3株被用于黃曲霉毒素的生物防治的黃曲霉菌株(NRRL21882、AF36和K49)的全基因組序列。Weaver等[56]還報道了從田間土壤和玉米中分離的20株具有地理參考價值菌株的全基因組序列。Chang等[57]報道了黃曲霉菌株CA14的基因組，一株被廣泛用于黃曲霉基因功能研究的菌株。黃曲霉基因組的大小約為36.5～38.8 Mb。序列數(shù)據(jù)保存在GenBank數(shù)據(jù)庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

3.1.1 通過功能基因組學(xué)研究黃曲霉毒素的生物合成 黃曲霉基因組編碼超過13,000個功能基因，生物信息學(xué)分析表明，這些酶由多種基因編碼。通過對黃曲霉表達的序列標(biāo)簽(EST)進行大規(guī)模測序，確定了與黃曲霉毒素生物合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、總體調(diào)控、真菌致病性和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因[58]。目前，黃曲霉毒素的生物合成基因簇是研究最為廣泛的次級代謝途徑之一(圖5)。調(diào)控基因aflR編碼AflR蛋白以促進黃曲霉毒素的合成。當(dāng)aflR過表達時，黃曲霉毒素合成中的基因轉(zhuǎn)錄被上調(diào)，黃曲霉毒素的產(chǎn)生量增加[59]。alfS基因與aflR相互作用并促進黃曲霉毒素的生物合成。

圖5 黃曲霉中的黃曲霉毒素途徑基因簇

黃曲霉毒素的生物合成不僅受黃曲霉毒素合成基因簇上基因的影響，還受到多種因素的影響。laeA是黃曲霉二級代謝的全局調(diào)控因子。敲除laeA后，黃曲霉的疏水性喪失，黃曲霉毒素和其他次生代謝受到顯著影響[60]。同時，laeA、VelB和VeA形成異源三聚體天鵝絨復(fù)合體，將光響應(yīng)的發(fā)育調(diào)控與次級代謝的控制聯(lián)系起來[61]。研究表明，分解代謝抑制基因creA調(diào)節(jié)黃曲霉毒素的形態(tài)，定殖和黃曲霉毒素的合成[62]。黃曲霉毒素的生物合成也受到外界環(huán)境因素的影響。與37 ℃相比，黃曲霉毒素合成簇基因aflR和aflS在28 ℃顯著上調(diào)，促進黃曲霉毒素的產(chǎn)生[63]。溫度和水活度的相互作用還可以通過調(diào)節(jié)黃曲霉毒素合成簇基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)黃曲霉毒素的合成。與液體培養(yǎng)基相比，固體培養(yǎng)基中黃曲霉通過G蛋白信號傳導(dǎo)途徑、氨基酸代謝、菌核發(fā)育和氧化應(yīng)激等途徑蛋白的表達，從而促進黃曲霉毒素的生物合成[64]。

3.1.2 通過功能基因組學(xué)研究環(huán)匹阿尼酸(CPA)生物合成 環(huán)匹阿尼酸(CPA)是由青霉和曲霉真菌的二次代謝產(chǎn)生的吲哚-四甲酸霉菌毒素，可通過抑制肌漿網(wǎng)中鈣依賴性ATP酶來增加肌肉收縮[65]。由于曲霉產(chǎn)生的CPA含量低，很少報道發(fā)生CPA真菌毒素事件，但黃曲霉毒素中毒可能會使CPA的作用變得更加復(fù)雜化[66]。CPA具有五環(huán)吲哚四羧酸支架，該支架由色氨酸、乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A和焦磷酸二甲基烯丙基焦磷酸酯分子通過三種酶(CpaS、CpaD和CpaO)的連續(xù)作用而組成[67]。在黃曲霉中，CpaS催化了CPA生物合成中的第一個穩(wěn)定中間體，即環(huán)乙酰乙?；鵏-色氨酸(cAATrp)。cAATrp通過dmaT編碼的環(huán)乙酰乙?；阴＜谆郊谆谆┍D(zhuǎn)移酶(CpaD)轉(zhuǎn)化為β-CPA。maoA編碼單胺氧化酶(CpaO)催化了α-CPA生物合成的最后一步[68]。通過敲除與CPA產(chǎn)生相關(guān)基因簇基因(maoA、dmaT、pks-nrps和ctfR1，發(fā)現(xiàn)除ctfR1敲除菌株外，所有類型的敲除菌株均喪失了產(chǎn)生CPA的能力[69]。在黃曲霉ΔveA突變體中，黃曲霉震顫毒素被完全阻斷，CPA的產(chǎn)量同時大大降低[70]。laeA是真菌次級代謝途徑的調(diào)節(jié)因子，其在煙曲霉中的過表達增加了CPA的產(chǎn)生[71]。CPA 還受到非生物因素(如溫度和水活度)的影響。在25 ℃條件下，黃曲霉的CPA產(chǎn)量最高，CPA作為侵染農(nóng)作物的有毒污染物的重要性被黃曲霉毒素污染帶來的擔(dān)憂所掩蓋。需要更多的研究來闡明低水平的CPA對人類和動物健康的影響。

3.2 利用功能基因組學(xué)研究黃曲霉與植物的相互作用

真菌生長和黃曲霉毒素污染是宿主、真菌和環(huán)境之間相互作用的結(jié)果?；ㄉ鳛樽罹咧匾虡I(yè)價值的農(nóng)作物之一，一直飽受黃曲霉毒素污染的嚴重困擾。RNA-seq是一種使用深度測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的方法，改變了人們對真核轉(zhuǎn)錄組范圍和復(fù)雜性的認識。通過RNA-seq進行的初步分析可以表明蛋白質(zhì)組學(xué)或代謝組學(xué)等其他組學(xué)技術(shù)的適用性或?qū)嵱眯訹72]。在通過RNA-seq研究黃曲霉菌和花生(S和R基因型)之間的相互作用時，發(fā)現(xiàn)與R基因型花生相比，S基因型花生的黃曲霉毒素含量增加，差異表達基因(DEG)與菌絲體生長和穿透、分生孢子形成和發(fā)育有關(guān)[73]。在玉米和黃曲霉的相互作用中，涉及與囊泡、內(nèi)核體和糖代謝基因相互作用的中心樞紐基因Ubi4與pH調(diào)節(jié)劑PalF和氮調(diào)節(jié)劑AreA的相互作用[74]。通過RNA-seq研究微生物對體外種子定殖(IVSC)的抗性，了解宿主與病原體之間的相互作用。通過RNA-seq鑒定與宿主-病原體相互干擾和標(biāo)記有關(guān)的基因；通過基因工程(例如RNAi)培育抗性品種；通過多組學(xué)方法(如代謝組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué))研究病原真菌的相互作用，獲得前后的鑒定、分離和描述真菌毒素產(chǎn)生的能力；通過多組學(xué)方法，可以更準確地發(fā)現(xiàn)影響真菌發(fā)育、毒素產(chǎn)生以及真菌與植物相互作用的關(guān)鍵因素。找到相關(guān)基因后，可以通過本文中提及的基因編輯技術(shù)敲低或敲除相關(guān)基因來進行準確驗證。

目前，大多數(shù)關(guān)于真菌與農(nóng)作物之間相互作用的研究都停留在實驗室階段?；趯嶒炇业睦碚撗芯靠梢员灰暈榫哂兄笇?dǎo)價值的理想模型。受多因素影響，大多數(shù)實驗還旨在單個產(chǎn)毒素黃曲霉菌株的研究及其與宿主的相互作用。然而，田間真實的情況是復(fù)雜多樣的，黃曲霉毒素的污染與多種真菌或細菌相關(guān)。通過功能基因組學(xué)研究黃曲霉不同菌株的相互作用以及黃曲霉與其他曲霉菌甚至其他病原菌的相互作用是未來的發(fā)展趨勢。

4 展 望

近年來，功能基因組學(xué)研究迅速崛起，在真菌生長發(fā)育、挖掘真菌次級代謝產(chǎn)物以及研究包括黃曲霉毒素在內(nèi)的真菌毒素等方面得到了廣泛應(yīng)用。然而，黃曲霉功能基因組學(xué)受到其細胞壁難以破除、耐藥性高、選擇標(biāo)記少、缺陷型菌株構(gòu)建費力耗時等因素的影響而發(fā)展緩慢。目前，在黃曲霉中，主要通過構(gòu)建NHEJ缺陷型菌株來提高菌株的同源重組效率，從而提高其基因編輯的效率。但這種構(gòu)建方式，不能解決選擇標(biāo)記少等問題，不利于連續(xù)的遺傳學(xué)研究。正是由于缺乏選擇標(biāo)記，使得大多黃曲霉研究停留在單個基因的研究。而Cre-loxP重組系統(tǒng)具有可以刪除選擇標(biāo)記的特征，可以連續(xù)構(gòu)建多基因敲除菌株。同時，CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，積極推動了功能基因組學(xué)的發(fā)展。目前，CRISPR-Cas9被廣泛應(yīng)用于米曲霉、黑曲霉、煙曲霉等曲霉屬菌株構(gòu)建中，在黃曲霉菌株中還未見相關(guān)報道。同時，功能基因組學(xué)在研究真菌與其他病原微生物的互作方面具有良好的發(fā)展前景。通過多組學(xué)方法，可以更準確地尋找影響真菌發(fā)育、毒素產(chǎn)生以及真菌與植物相互作用的相關(guān)基因。而影響真菌發(fā)育、毒素產(chǎn)生以及真菌在植物中的定殖往往并不是由單一基因調(diào)控的。找到這些相關(guān)基因后，可以通過本文中提及的基因編輯技術(shù)敲低或敲除相關(guān)基因來進行準確驗證。同時，通過這些基因編輯技術(shù)可以更好地研究完整的代謝通路，為黃曲霉的遺傳學(xué)研究提供參考。