卜祥輝 安海燕 安曉娜 張承承 郭曉媛

〔摘要〕 目的 采用網(wǎng)絡藥理學方法及分子對接技術探討鬼箭羽治療糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease， DKD）的作用機制。方法 通過文獻查找、TCMSP數(shù)據(jù)庫、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫及TCM@TAIWAN中醫(yī)數(shù)據(jù)庫篩選鬼箭羽主要成分及作用靶點，在Drugbank、TTD、OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取DKD相關靶點，利用Cytoscape軟件分別構建“中藥-成分-靶點”“中藥-成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡;運用STRING數(shù)據(jù)庫構建蛋白互作網(wǎng)絡，并根據(jù)拓撲學參數(shù)篩選鬼箭羽治療DKD的關鍵靶點;對關鍵靶點進行GO功能富集和KEGG通路分析，并構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖，運用AutoDock Tools和Pymol將得到的主要活性成分與關鍵靶點進行分子對接。結果 共獲得鬼箭羽有效成分14個，作用于564個潛在靶點，DKD靶點1 106個，拓撲分析得到關鍵靶點41個，其中度值大于50的靶點有23個，包括IL-6、TNF、AKT1、VEGFA等。GO功能富集分析得到生物過程主要涉及氧化物的反應、活性氧的調(diào)控、細胞凋亡的調(diào)控等;KEGG通路富集分析主要包括AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路等。分子對接結果顯示，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素與4個核心靶點均具有較好的結合活性。結論 鬼箭羽可能通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素等多種活性成分作用于多個靶點，參與調(diào)節(jié)多條信號通路，發(fā)揮抗炎、抗氧化應激、抗缺氧、抑制細胞凋亡以及改善腎血流動力學等作用，從而保護腎功能，延緩糖尿病腎病的進展。

〔關鍵詞〕 鬼箭羽;糖尿病腎病;網(wǎng)絡藥理學;分子對接;槲皮素;山柰酚;β-谷甾醇;木犀草素

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.017

Mechanism of Ramulus Euonymi in Treatment of Diabetic Nephropathy Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

BU Xianghui， AN Haiyan*， AN Xiaona， ZHANG Chengcheng， GUO Xiaoyuan

（Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Ramulus Euonymi in the treatment of diabetic dephropathy （DKD） based on network pharmacology and molecular docking technology. Methods The main components and targets of Ramulus Euonymi were screened by literature search， TCMSP database， BATMAN-TCM database and TCM@TAIWAN TCM database. The targets of DKD were obtained from the databases of Drugbank， TTD， OMIM and GeneCards. The interaction network of "drug-component-target" and “drug-component-target-disease” were constructed by Cytoscape. The protein interaction network was constructed by STRING platform， and the key targets for the treatment of DKD were screened according to the topological parameters. GO function enrichment and KEGG pathway analysis were carried out for key targets， and the "component-target-pathway" network was constructed. The main components obtained were docked with the key targets by AutoDock Tools and Pymol. Results A total of 14 active components were obtained， which acted on 564 targets， 1 106 DKD targets， 41 key targets were obtained by topological analysis， among them， there were 23 targets with a degree greater than 50， including IL-6， TNF， AKT1， VEGFA， etc. GO function enrichment analysis showed that biological processes were mainly involved oxide response， regulation of reactive oxygen species， regulation of apoptosis， etc. KEGG pathway enrichment analysis mainly included AGE-RAGE signal pathway， fluid shear stress and atherosclerosis， TNF signal pathway， etc. The results of molecular docking showed that quercetin， kaempferol， β-sitosterol and luteolin all had good binding activity to the four core targets. Conclusion Ramulus Euonymi may act on multiple targets and regulate multiple signal pathways through many active components such as quercetin， kaempferol， β-sitosterol and luteolin， playing anti-inflammation， antioxidant stress， anti-hypoxia， inhibition of apoptosis and improvement of renal hemodynamics， so as to protect renal function and delay the progress of DKD.

〔Keywords〕 Ramulus Euonymi; diabetic nephropathy; network pharmacology; molecular docking; quercetin; kaempferol; β-sitosterol; luteolin

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease， DKD）是糖尿病主要微血管并發(fā)癥之一，也是導致終末期腎臟?。╡nd-stage renal disease， ESRD）的主要原因[1]。在我國，DKD所占慢性腎臟?。╟hronic kidney disease， CKD）比例已經(jīng)超過慢性腎小球腎炎，成為住院患者中慢性腎臟病的首要病因[2]。目前，DKD的發(fā)病機制尚不完全清楚，已被證明的機制包括腎小球血流動力學改變、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）過度活躍、氧化應激的增加、足細胞自噬和遺傳以及表觀遺傳失調(diào)等[3]，最終引起腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生及腎臟纖維化。臨床針對DKD的治療以降糖、降壓、降脂及改善生活方式為主，但仍不能完全阻斷DKD的進程，部分患者仍可能發(fā)展為ESRD。隨著傳統(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展，在西醫(yī)治療的基礎上通過合理應用中醫(yī)藥而延緩甚至阻止疾病的發(fā)展顯得尤為重要。

DKD屬于中醫(yī)學“腎消病”或“消渴病腎病”范疇，其基本病機為消渴病日久，治不得法，傷陰耗氣，痰、熱、郁、瘀互相積聚于腎之絡脈，形成“微型癥瘕”，而導致腎體受損、腎用失司的虛實夾雜之證[4]。鬼箭羽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦，性寒，善下行，具有破血通經(jīng)、解毒消腫的功效，主治癥瘕結塊、心腹疼痛、瘀滯癰腫等。Meta分析[5]示，臨床應用含有鬼箭羽的中成藥或復方合劑治療DKD療效顯著。多項臨床試驗[6-7]表明，鬼箭羽單藥可降低尿蛋白、保護腎小管上皮細胞、減少細胞外基質(zhì)的沉積，從而延緩腎小球硬化，對防治DKD具有獨特的優(yōu)勢。本研究采用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術探索鬼箭羽的主要化學成分、核心靶點以及與DKD之間的相互關系，為進一步闡明鬼箭羽治療DKD的作用機制提供思路和理論基礎。

1 資料與方法

1.1? 數(shù)據(jù)庫與軟件

全文涉及的數(shù)據(jù)庫、分析平臺及與軟件來源：中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP， http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）;中醫(yī)分子機制生物信息學分析工具（BATMAN-TCM， http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）;中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫（TCM@TAIWAN， http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/）;有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem， https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）;通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot， http：//www.uniprot.org）;小分子結構數(shù)據(jù)庫（ZINC15， http：//zinc15.docking.org）;蛋白結構數(shù)據(jù)庫（RCSB PDB， http：//www.rcsb.org）;藥物靶標數(shù)據(jù)庫（TTD， http：//db.idrblab.net/ttd/）;人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards， https：//www.genecards.org/）;藥物銀行數(shù)據(jù)庫（DrugBank， http：//www.Drugbank.ca/）;在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM; http：//www.Omim.org/）;網(wǎng)絡在線繪圖軟件Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）;STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）;在線云平臺OmicShare網(wǎng)站（https：//www.omicshare.com/）;網(wǎng)絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.7.1（http：//cytoscape.org/）;分子對接軟件AutoDock4.2.6/AutoDock

Tools1.5.6（http：//autodock.scripps.edu）;分子對接可視化軟件Pymol（http：//pymol.org/2/）。

1.2? 鬼箭羽活性成分獲取及靶點篩選

以“鬼箭羽”“衛(wèi)矛”和“Ramulus Euonymi”為檢索詞條分別在TCMSP、BATMAN-TCM、TCM@TAIWAN數(shù)據(jù)庫進行搜索，以生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件[8]，并結合相關文獻報道篩選出有效成分及作用靶點，將有效成分導入ZINC15數(shù)據(jù)庫，保存有效成分的mol2式;利用Uniprot數(shù)據(jù)庫的對靶點進行蛋白名稱標準化，通過Cytoscape構建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡。

1.3? DKD靶點及交集靶點獲取

在TTD、OMIM、DrugBank、GeneCards數(shù)據(jù)庫中，以“diabetic nephropathy”和“nephropathy，diabetic”為檢索詞條，搜索DKD靶點，利用在線繪圖軟件Venny將總疾病靶點和鬼箭羽的作用靶點取交集，即得鬼箭羽治療DKD的潛在作用靶點。

1.4? “中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建及分析

將鬼箭羽有效成分及與DKD的共同靶點導入Cytoscape，構建“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，利用Cytoscape中NetworkAnalyzer對網(wǎng)絡進行分析獲取相關拓撲參數(shù)。

1.5? 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建及關鍵靶點篩選

將共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，蛋白種類設置為“homo sapiens”，置信度“medium confidence”設置為0.4，隱藏網(wǎng)絡中無關聯(lián)節(jié)點，輸出TSV格式文件，并導入Cytoscape，對網(wǎng)絡進行拓撲分析，以degree（自由度）、betweenness centrality（介度中心性）、closeness centrality（接近中心性）均大于或等于中位數(shù)，average shortest path length（平均最短路徑長度）小于或等于中位數(shù)為篩選條件，獲取關鍵靶點。

1.6? GO富集分析和KEGG通路分析

利用Cytoscape中ClueGO插件對關鍵靶點進行GO富集分析，選擇“Biological Process”，設置參數(shù)為P<0.05、Min Level為6、Max Level為8、Min Gene為7，進行可視化分析;將富集目的基因?qū)朐诰€云平臺Omicshare，背景基因選擇“homo sapiens”，對關鍵靶點進行KEGG通路分析，以P<0.05為篩選條件，對排名前20的信號通路以柱狀圖形式表示，為進一步從信號通路角度分析鬼箭羽治療DKD可能的作用機制，以P<0.01、富集基因數(shù)>10為篩選條件，并排除與DKD不相關的通路，在此基礎上繪制“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖。

1.7? 鬼箭羽活性成分與關鍵靶點分子對接

選取“1.5”項中的核心靶點與“1.6”項“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡中度值排名靠前活性成分進行分子對接驗證。通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲取關鍵基因的晶體結構，采用AutoDock Tools對靶蛋白添加非極性氫、刪除水分子及小分子配體。將活性成分的mol2式導入AutoDockTools，添加原子電荷，分配原子類型，運行AutoDock和AutoGrid進行半柔對接，選取最低結合能的組合結果，并用Pymol2.4軟件對結果進行可視化。一般而言，結合能<-5 kcal/mol說明可形成穩(wěn)定的對接結構[9]，且所需結合能越低，則說明其結合構象越穩(wěn)定。

2 結果

2.1? 鬼箭羽主要活性成分靶點篩選結果

通過檢索TCMSP、BATMAN-TCM、TCM@TAIWAN 3個中藥數(shù)據(jù)平臺共得到鬼箭羽有效成分38個，結合相關文獻檢索補充[10-11]，共篩選出鬼箭羽主要活性成分14個，其編號及ADME關鍵參數(shù)見表1。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出對應的靶點564個，通過Uniprot對蛋白名稱標準化，去重整合后，得到鬼箭羽主要活性成分的作用靶點241個。利用Cytoscape繪制鬼箭羽“成分-靶點”網(wǎng)絡圖，在此網(wǎng)絡中共有256個節(jié)點，578條邊，見圖1。

2.2? “中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建

在TTD、OMIM、DrugBank及GeneCards數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫中分別檢索到22、251、110、879個DKD潛在靶點，去掉重復靶點后，得到1 106個DKD相關靶點，疾病靶點韋恩圖見圖2。將鬼箭羽主要成分的作用靶點與DKD疾病靶點取交集，得到97個共同靶點，見圖3。利用Cytoscape構建鬼箭羽“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，見圖4。該網(wǎng)絡中共有節(jié)點123個，251條邊。對網(wǎng)絡進行拓撲分析，結果顯示，度值排名前4的成分是槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素。

2.3? PPI網(wǎng)絡構建及關鍵靶點篩選

將97個共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫得到網(wǎng)絡，如圖5，此網(wǎng)絡中共有97個節(jié)點，1 682條邊。將TSV式文件導入Cytoscape，進行拓撲分析，獲取鬼箭羽治療DKD的關鍵靶點，并提取關鍵靶點相互作用網(wǎng)絡圖，見圖6。

2.4? GO富集分析

運用ClueGO插件進行GO功能富集分析，構建生物過程網(wǎng)絡圖（見圖7），共得到生物過程條目278條（P<0.05），其中P<0.01的條目有140條，顯著性排名靠前的生物過程主要涉及含氧化物的反應、活性氧的調(diào)控、細胞凋亡的調(diào)控、細胞增殖的調(diào)節(jié)、脂質(zhì)的反應等。

2.5? KEGG通路富集分析

通過Omicshare平臺對關鍵靶點進行KEGG通路分析，共得到148條信號通路（P<0.05），其中顯著富集P<0.01的有117條，根據(jù)P值由小到大篩選排名前20的通路繪制氣泡圖，見圖8。以基因數(shù)>10個為篩選條件，并排除與DKD不相關的通路，最后確定了12條通路，包括AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、白細胞介素-17信號通路、缺氧誘導因子-1信號通路等。根據(jù)成分、靶點與信號通路之間的聯(lián)系，建立成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖，見圖9。在關鍵的AGE-RAGE信號通路上標注出鬼箭羽的作用位點，見圖10。

2.6? 分子對接

選擇度值超過雙倍均值的核心靶點（IL-6、TNF、AKT1、VEGFA）與“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖中度值排名前4的化合物（槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素）進行分子對接，選取最低結合能組合，見表2。使用Pymol進行繪圖，展示前8個結合力較好的分子對接模式圖，見圖11。結果表明鬼箭羽主要化合物與4個靶蛋白的結合能均小于-5 kcal/mol，兩者之間能夠形成氫健，具有較強的結合能力。

3 討論

鬼箭羽在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為木部中品，既可活血通絡、推陳出新，又可清熱堅陰、破血消癥，與現(xiàn)代研究認為的DKD的“虛”“瘀”等病因病機相一致[12]。國醫(yī)大師呂仁和等[4]認為腎小球系膜細胞外基質(zhì)的增生積聚，是一個由癥聚逐漸發(fā)展為癥積的過程，指出DKD治療的關鍵應在活血化瘀的基礎上，重視軟堅散結之法。方用含鬼箭羽以期消癥化結，不僅緩解血絡中已經(jīng)形成的微型癥瘕，更可防止新的癥瘕形成，延緩疾病的發(fā)展。

本研究通過多個中藥數(shù)據(jù)庫篩選出鬼箭羽活性成分14個，其中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素可能是鬼箭羽治療DKD的關鍵成分。張杰等[13]發(fā)現(xiàn)槲皮素能下調(diào)AngⅡ誘導下的系膜細胞的MCP-1的分泌，減少腎臟系膜增生;王興紅等[14]研究表明，槲皮素能通過抑制p38MAPK、NF-κB來減少炎癥因子IL-8、TGF-β1表達，減少腎組織炎癥反應，發(fā)揮抗纖維化作用。山柰酚具有良好的抗炎活性，能通過調(diào)節(jié)MAPK、AKT通路，抑制IL-1β、IL-6、CXCL8、TNF-α等炎癥因子的表達，對腎功能具有保護作用，此外，山柰酚還能減少活性氧的生成并促進其清除，起到抗氧化應激和抗細胞凋亡的作用[15]。血脂代謝紊亂可直接或間接損害腎小球系膜細胞，進而促進DKD的發(fā)展[16]，動物實驗表明，β-谷甾醇除可激活2型糖尿病大鼠脂肪組織中的IR和GLUT4來改善血糖，還可顯著降低大鼠血清TC、TG，抑制脂質(zhì)過氧化，調(diào)節(jié)脂代謝，降低全血黏度[17]。木犀草素屬于黃酮類化合物，王超超等[18]發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以抑制高糖誘導下腎小球系膜細胞過度增生，促進其凋亡，改善腎臟損傷，其機制可能與激活AMPK/SIRT-1/PGC-1α蛋白表達，從而發(fā)揮抗腎小球炎癥反應、抗增生作用。本研究發(fā)現(xiàn)AMPK信號通路、TNF信號通路以及AKT信號通路是鬼箭羽治療DKD的關鍵通路，基于分子對接結果，推測槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素為鬼箭羽通過多途徑協(xié)同治療DKD的極具潛力的藥效物質(zhì)基礎。

PPI網(wǎng)絡拓撲分析顯示，鬼箭羽治療DKD的關鍵靶點有41個。包括IL-6、CXCL8、VEGFA、EGFR、ICAM-1、CXCL2等與炎癥反應、免疫反應及血管生成相關的靶點，以及AKT1、MAPK1、MAPK8、MMP-9、CASP3等涉及細胞凋亡和細胞增殖的相關靶點。

IL-6、ICAM-1等諸多促炎癥因子參與DKD病理生理過程，其中IL-6被認為是調(diào)控諸多慢性炎癥進展和轉(zhuǎn)歸的關鍵基因[19]。DKD患者機體內(nèi)IL-6水平明顯升高，且隨著蛋白尿程度的增加，IL-6水平也逐漸增加，提示DKD患者腎組織高水平表達的IL-6可能參與了DKD發(fā)生發(fā)展的病理生理過程[20]。有研究[21]表明，腎臟在受到某些抗原刺激后，系膜細胞可持續(xù)分泌IL-6，同樣高糖和晚期糖基化產(chǎn)物均能誘導腎小管上皮細胞表達和分泌IL-6。AKT1是P13K下游的一個重要靶激酶，是PI3K/AKT信號傳導途徑的中心環(huán)節(jié)，參與DKD腎纖維化的病理過程[22]。VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子家族中主要影響微血管形成的細胞因子，而VEGFA的表達，可活化系膜細胞，增加基底膜通透性，使多種炎癥因子滲出，加劇炎癥反應和腎組織缺氧，而腎髓質(zhì)過低的氧分壓會刺激HIF產(chǎn)生，進而上調(diào)VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄[23]。張思泉等[24]研究表明，通過抑制ATF6/CHOP途徑，下調(diào)Caspase-3表達，可減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的細胞凋亡，保護腎組織。

KEGG富集分析結果顯示多條通路與DKD有關。富集結果涉及炎癥信號通路（AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路等）、自噬-凋亡通路（PI3K-AKT信號通路、FoxO信號通路）和低氧誘導通路（HIF-1信號通路）等。AGEs-RAGE信號通路是DKD發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，腎臟在持續(xù)高血糖環(huán)境中產(chǎn)生大量AGEs上調(diào)AGE受體（RAGE）表達，AGEs結合RAGE激活一系列信號通路，包括MAPK、JAK/STAT、Caspase-3/7、NF-κB等通路，引起大量黏附分子、生長因子和促炎因子（如IL-6、CXCL8、VEGFA、TNF-α、TGF-β1、CXCL2等）的表達和釋放，其中IL-6、CXCL8、TNF-α等促進腎臟慢性炎癥狀態(tài)的建立;VEGFA在腎臟足突細胞過度表達，可增加血管的通透性，進而產(chǎn)生蛋白尿;TGF-β1可通過控制蛋白酶的合成與降解而導致腎小球細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生以及腎小管上皮間質(zhì)化，造成腎臟組織纖維化，而TGF-β1以及VEGFA的表達又可上調(diào)系膜細胞CXCL2表達，促進單核細胞浸潤，引起腎小球損傷，最終導致腎臟結構和功能逐漸喪失[25]。MAPK信號通路通過3級激酶級聯(lián)反應，促進p38MAPK活化，通過促進炎癥介質(zhì)表達、干預細胞因子產(chǎn)生等途徑而導致腎組織炎癥性損傷以及腎纖維化，同時，p38MAPK信號通路激活還可進一步活化細胞凋亡因子Caspase-3引起足細胞凋亡[26]。本研究表明，MAPK信號通路中包含CASP3、TNF、IL-1B等關鍵基因，推測鬼箭羽可通過調(diào)控上述基因表達、參與調(diào)節(jié)MAPK信號通路，從而發(fā)揮抗炎、抗纖維化及抑制足細胞凋亡的作用，為后續(xù)探討鬼箭羽治療DKD的作用機制提供思路。在PI3K/AKT信號通路中，PI3K是該通路的起始因子，PTEN是該通路的關鍵負調(diào)節(jié)因子，AKT則是該通路的中心環(huán)節(jié)，AKT被活化后，能夠通過調(diào)節(jié)GLUT-4、Fox O1、mTOR等的活性調(diào)控機體糖脂代謝、細胞自噬和凋亡、氧化應激水平，從而參與DKD的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，鬼箭羽可能通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素等主要活性成分，作用于IL-6、AKT1、VEGFA、CASP3等相關靶點，干預AGE-RAGE、PI3K-AKT、HIF-1、MAPK等信號通路，協(xié)作產(chǎn)生抗炎、抗缺氧、降低氧化應激、抗纖維化、抑制細胞凋亡及改善腎血流動力學等作用來防治DKD。

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