陳曉慶，羅國(guó)芝,2,3，譚洪新,2,3，吳慧芳，蒙浩焱，黎 爽

( 1.上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306 )

集約化生產(chǎn)方式使水產(chǎn)養(yǎng)殖的放養(yǎng)密度和高蛋白飼料的投放量明顯增加。氨氮是蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物之一。據(jù)估算，氨氮產(chǎn)生量約為投喂飼料蛋白質(zhì)的9.2%[1]。氨氮的積累會(huì)直接抑制養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)，降低其存活率[2]。水體中氮素的去除主要是通過(guò)硝化作用和反硝化作用[3-5]。在生物絮團(tuán)—水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，硝化現(xiàn)象普遍發(fā)生[6]。水體中的硝化作用受一系列因素影響，如環(huán)境因子、生態(tài)因素、生物因子等[7]。硝化過(guò)程通常發(fā)生在有機(jī)物濃度較低的環(huán)境中[8]，硝化效率在一定范圍內(nèi)隨著碳氮比的增加而降低[9]。生物絮團(tuán)主要由浮游生物、細(xì)菌、原生動(dòng)物和顆粒有機(jī)體等組成[10]；絮體形狀不規(guī)則，可壓縮性強(qiáng)，具有高度滲透性(超過(guò)99%的穿透力)，且隨液體滲透而不固定[3,11-17]。絮團(tuán)的絮體粒徑變化區(qū)間大，從幾微米到幾百微米甚至數(shù)千微米，高度多孔，比表面積為20～100 cm2/mL。通常認(rèn)為，生物絮團(tuán)—水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中穩(wěn)定的生物絮團(tuán)大小為50～1000 μm[12]。這些物理和生物特性，使生物絮凝技術(shù)反應(yīng)器具有吸附、絮凝固體顆粒物并對(duì)其進(jìn)一步利用的潛能。在生物絮團(tuán)—水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，生物絮團(tuán)的絮體粒徑可能與培養(yǎng)對(duì)象對(duì)絮團(tuán)的攝取能力、消化率以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有關(guān)[3]。

隨著對(duì)生物絮團(tuán)的深入研究，已有生物絮團(tuán)影響因素碳源、碳氮比、水體混合強(qiáng)度、水力停留時(shí)間、pH、溶解氧、溫度、堿度、鹽度和反應(yīng)器結(jié)構(gòu)及活性污泥粒徑等方面的報(bào)道，但對(duì)生物絮團(tuán)絮體粒徑的相關(guān)研究還較少。筆者從絮體本身出發(fā)，以50 μm粒徑濾膜截留絮團(tuán)附著細(xì)菌，未被50 μm粒徑濾膜截留的非附著細(xì)菌，再采用0.22 μm粒徑濾膜截留[4,18]，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，揭示絮體內(nèi)部微生物多樣性，為進(jìn)一步研究生物絮團(tuán)各反應(yīng)階段的微生物組成比例變化提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，對(duì)探究生物絮團(tuán)硝化作用具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置及材料

試驗(yàn)于上海海洋大學(xué)循環(huán)水養(yǎng)殖工程與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。生物絮團(tuán)反應(yīng)器為9個(gè)7 L有機(jī)玻璃圓錐體反應(yīng)器，全高30 cm，錐高4 cm，內(nèi)徑18.5 cm，外徑20 cm，有效容積5 L。選用的氣泵功率為138 W、曝氣量為100 L/min，通過(guò)分接器和軟管在每個(gè)反應(yīng)器中設(shè)置2個(gè)曝氣頭(直徑3 cm、高3.5 cm的石英砂聚合氣石)，為水體提供氧氣和攪拌。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開(kāi)始前50 d，在3個(gè)150 L養(yǎng)殖水桶培養(yǎng)穩(wěn)定良好的絮體(圖1)[19]。各水桶中投入150 g磨碎后的寶石鱸魚飼料，初始總懸浮固體物質(zhì)量濃度1000 mg/L。通過(guò)添加碳酸氫鈉調(diào)控堿度保持在150 mg/L(以碳酸鈣計(jì)，下同)。試驗(yàn)期間除了補(bǔ)充因蒸發(fā)而損失的水分外，不換水。一臺(tái)羅茨鼓風(fēng)機(jī)供氧(型號(hào)HG-750，浙江森森集團(tuán)股份有限公司)，采用間歇式曝氣方式(曝氣8 h，停止16 h)將系統(tǒng)進(jìn)行悶曝72 h后開(kāi)始添加碳源[20]。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)一次性投入足夠的葡萄糖，使系統(tǒng)中碳氮比為15。

圖1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)圖[21]Fig.1 Experiment design

待水體中氨氮、亞硝態(tài)氮降至最低值，視為系統(tǒng)穩(wěn)定構(gòu)建，取3個(gè)空桶標(biāo)記A、B、C。A桶為未分級(jí)絮體組；將前期培養(yǎng)絮體過(guò)300目篩網(wǎng)，經(jīng)篩網(wǎng)濾過(guò)的絮體分入B桶；截留在篩網(wǎng)上的絮體分入C桶，C桶水體取自原絮體靜置5 h后的上清液。3個(gè)桶經(jīng)充分曝氣后，分別取15 L注入9個(gè)有效容積為5 L的反應(yīng)器中培養(yǎng)不同粒徑生物絮團(tuán)。試驗(yàn)分3組，每組3個(gè)平行：A組為未分級(jí)絮體組，B組為<50 μm絮體組，C組為>50 μm絮體組。反應(yīng)器中分別以氯化銨和葡萄糖作為氮源和碳源，以碳氮比為15分別加入0.19 g氯化銨和1.88 g葡萄糖進(jìn)行10 mg/L氨氮轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。取試驗(yàn)初始水樣(A、B、C組各3個(gè))和氨氮轉(zhuǎn)化結(jié)束水樣(A、B、C組各3個(gè))各50 mL，經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜抽濾后將濾膜于-80 ℃冰箱保存,試驗(yàn)結(jié)束后送至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)與測(cè)定方法

1.3.1 水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

每隔1 d檢測(cè)水體的溫度、pH、溶解氧，并測(cè)定水體總氮、總氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和溶解性有機(jī)碳?？偟捎眠^(guò)硫酸鉀氧化—紫外分光光度法(型號(hào)UV2000，上海尤尼柯，中國(guó)，下同)測(cè)定。水樣經(jīng)0.45 μm孔徑濾膜抽濾后測(cè)定三態(tài)氮及溶解性有機(jī)碳。其中亞硝態(tài)氮采用N-(1-萘基)-乙二胺比色法測(cè)定，硝態(tài)氮含量采用紫外分光光度法測(cè)定，總氨氮含量測(cè)定采用鈉氏試劑法，溶解性有機(jī)碳含量使用多功能碳氮元素分析儀(Multi N/C 2100，德國(guó))測(cè)定。

1.3.2 絮團(tuán)成分指標(biāo)的測(cè)定

總固體懸浮顆粒物采用稱量質(zhì)量法測(cè)定；絮團(tuán)經(jīng)65 ℃烘干后使用碳氮元素分析儀測(cè)定絮團(tuán)中的碳元素和氮元素含量，將氮元素由粗蛋白平均系數(shù)6.25換算成粗蛋白含量。

1.3.3 生物絮團(tuán)微生物樣品的測(cè)定

按照Omega Water DNA Kit (Omega,USA)的說(shuō)明，提取水體中的DNA。將提取得到的細(xì)菌總DNA通過(guò)微量紫外分光光度計(jì)(Nano Drop?ND-1000,美國(guó))測(cè)定DNA質(zhì)量濃度和純度。采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGA-GGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGG-GTWTCTAAT-3′)對(duì)絮團(tuán)細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)擴(kuò)增,修飾后的通用引物含有不同的Tag標(biāo)簽用以區(qū)分不同樣品。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：5×Fast Pfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L d NTPs 2 μL、Forward Primer(5 μmol/L) 0.8 μL、Reverse Primer(5 μmol/L) 0.8 μL、Fast Pfu Polymerase 0.4 μL、DNA模板10 ng，補(bǔ)雙蒸水至20 μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94 ℃，5 min；30×(94 ℃，30 s，54 ℃，30 s，72 ℃，45 s)；72 ℃，10 min。每個(gè)樣品3個(gè)平行，利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的MiSeq PE300測(cè)序儀(Illumina Inc，美國(guó))完成序列測(cè)定。

Miseq文庫(kù)構(gòu)建及Miseq測(cè)序：(1)通過(guò)PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端；(2)使用凝膠回收試劑盒TruSeqTM DNA Sample Prep Kit切膠回收PCR產(chǎn)物；(3) Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)；(4)氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。檢測(cè)合格文庫(kù)后，采用Miseq進(jìn)行測(cè)序。

數(shù)據(jù)分析處理：采用Mothur軟件將得到的16S rDNA基因序列在RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)，充分去除嵌合體序列。為得到每個(gè)運(yùn)算分類單元(OUT)對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的運(yùn)算分類單元代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，用Mothur軟件構(gòu)建稀釋性曲線[15]。

1.4 去除效率計(jì)算公式

總氨氮去除效率(R,%)計(jì)算公式：

R=(ρ1-ρ2)/ρ1×100%

式中，ρ1為初始總氨氮質(zhì)量濃度(mg/L)；ρ2為終末總氨氮質(zhì)量濃度(mg/L)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，由Origin、Adobe Illustrator軟件進(jìn)行相關(guān)圖表的繪制。試驗(yàn)數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 絮體培養(yǎng)階段水質(zhì)及三態(tài)氮的動(dòng)態(tài)變化

試驗(yàn)前50 d穩(wěn)定絮體培養(yǎng)階段的三態(tài)氮及總氮變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2。生物絮團(tuán)在第43天亞硝態(tài)氮降至最低并趨于穩(wěn)定，絮體基本形成。試驗(yàn)期間，各組溫度18.4～28.4 ℃，溶解氧7.5～9.6 mg/L、pH 7.7～9.0，因前期絮體培養(yǎng)階段加入少許鹽，水體鹽度7.1～7.7，各組環(huán)境指標(biāo)組間差異不顯著(P>0.05)。3個(gè)處理組的堿度均維持在155～240 mg/L。

圖2 絮體培養(yǎng)階段三態(tài)氮及總氮的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamics of total ammonia-N, nitrite-N, nitrate-N and total nitrogen in the water in the 3 different groups

2.2 氨氮的轉(zhuǎn)化

溶解性有機(jī)碳質(zhì)量濃度及總氨氮質(zhì)量濃度計(jì)算見(jiàn)圖3。3組反應(yīng)器中溶解性有機(jī)碳含量與總氨氮含量的初始比值分別為16.24、15.01、14.07。試驗(yàn)期間，pH、溶解氧、溫度等水質(zhì)指標(biāo)見(jiàn)表1，各組溫度22.0～23.5 ℃、溶解氧8.2～8.7、pH 8.2～8.6，各組環(huán)境指標(biāo)組間差異不顯著(P>0.05)。3個(gè)處理組的堿度均維持在250 mg/L，氨氮快速轉(zhuǎn)化期間3個(gè)處理組堿度波動(dòng)范圍差異不顯著(P>0.05)。

3組反應(yīng)器初始氨氮質(zhì)量濃度分別為(8.43±0.13)、(9.71±0.07)、(10.52±0.44) mg/L，在第2 h，3組氨氮均達(dá)到峰值，分別為(16.46±1.34)、(17.93±1.91)、(18.62±1.19) mg/L，下降后均有回升，最后趨于穩(wěn)定快速下降。3組反應(yīng)器均在12 h基本將10 mg/L總氨氮同化去除完畢，氨氮去除率分別達(dá)97.33%、95.28%和95.09%(圖3a)；總體上看，3組反應(yīng)器對(duì)氨氮的同化去除速度是一樣的，3個(gè)處理組的氨氮變化差異不顯著(P>0.05)。反應(yīng)過(guò)程中亞硝態(tài)氮有反復(fù)出現(xiàn)小幅度“先升后降”的趨勢(shì)，3組間差異不顯著(P>0.05)(圖3b)。3組反應(yīng)器硝態(tài)氮含量升降起伏明顯，均有少量增加后降低趨勢(shì)，并低于初始值，3組反應(yīng)器硝態(tài)氮變化差異不顯著(P>0.05)(圖3c)。到反應(yīng)結(jié)束，未額外產(chǎn)生亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮，與已有的研究結(jié)果[1]相符。溶解性有機(jī)碳質(zhì)量濃度呈持續(xù)下降趨勢(shì)(圖3d)，不同絮體粒徑組溶解性有機(jī)碳變化差異不顯著(P>0.05)。

圖3 10 mg/L氨氮快速轉(zhuǎn)化期間3個(gè)處理組中總氨氮(a)、亞硝態(tài)氮(b)、硝態(tài)氮(c)及溶解性有機(jī)碳(d)的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamics of total ammonia-N (a), nitrite-N (b), nitrate-N (c) and dissolved organic carbon (d) in the water in the 3 different groups during rapid conversion of 10 mg/L ammonia-N

表1 10 mg/L氨氮快速轉(zhuǎn)化期間3個(gè)處理組中各水質(zhì)指標(biāo)的平均值、最小值和最大值

2.3 絮團(tuán)總固體懸浮物及粗蛋白

每組反應(yīng)器取3個(gè)樣品進(jìn)行總懸浮固體物測(cè)定，以確定初始的總懸浮固體物質(zhì)量濃度。10 mg/L氨氮快速轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，3組初始總懸浮固體物分別為(720.33±52.21)、(693±58.28) mg/L和(753.67±59.55) mg/L。3組的總懸浮固體物質(zhì)量濃度在12 h內(nèi)的變化均有所升高，同時(shí)段不同粒徑處理組之間總懸浮固體物質(zhì)量濃度差異不顯著(P>0.05)(圖4)。由表2可見(jiàn)，不同粒徑處理組對(duì)絮體粗蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。

圖4 氨氮快速轉(zhuǎn)化期間3個(gè)處理組絮團(tuán)中總固體懸浮物含量Fig.4 Contents of total suspended solids in the 3 different biofloc treatment groups during the rapid ammonia-N transformation period

2.4 微生物序列數(shù)目和多樣性

分別取初始0 h時(shí)間段與終末12 h時(shí)間段絮團(tuán)進(jìn)行高通量測(cè)序多樣性分析，絮體細(xì)菌原核16S序列數(shù)目和平均長(zhǎng)度見(jiàn)表3。初始絮團(tuán)更能準(zhǔn)確反映不同粒徑的微生物群落豐度、多樣性差異。通過(guò)比較sobs、ace和chao指數(shù)分析可知，初始微生物豐度由大到小排序?yàn)椋?50 μm絮體組，>50 μm絮體組，未分級(jí)絮體組；由表3可見(jiàn)，初始微生物多樣性由大到小排序?yàn)椋何捶旨?jí)絮體組，>50 μm絮體組，<50 μm絮體組；3個(gè)組處理組Shannon值差異不顯著(P>0.05)。終末時(shí)段各組微生物群落多樣性相對(duì)初始時(shí)段均有所降低。

表3 不同絮體粒徑組絮團(tuán)微生物群落豐富度和多樣性指數(shù)

2.5 微生物群落組成分析

10 mg/L氨氮快速轉(zhuǎn)化期間，在門水平上，3組絮團(tuán)樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成情況相似，但各種微生物所占比例略有差異(圖5a)。樣品中微生物主要隸屬于12個(gè)門，初始時(shí)段絮團(tuán)最能客觀反映不同粒徑絮團(tuán)中生物群落組成差異。試驗(yàn)初始0 h時(shí)，變形菌門(未分級(jí)絮體組36.69%，<50 μm絮體組28.19%，>50 μm絮體組31.02%)和放線菌門(未分級(jí)絮體組28.30%，<50 μm絮體組23.98%，>50 μm絮體組29.60%)占主要優(yōu)勢(shì)，其他優(yōu)勢(shì)菌門分別為擬桿菌門(未分級(jí)絮體組11.66%，<50 μm絮體組10.15%，>50 μm絮體組10.38%)、厚壁菌門(未分級(jí)絮體組6.26%，<50 μm絮體組20.57%，>50 μm絮體組8.53%)，綠彎菌門(4.49%～5.81%)、浮霉菌門(2.44%～2.75%)、芽單胞菌門(1.22%～1.73%)和疣微菌門(1.02%～1.99%)等。<50 μm絮體組厚壁菌門豐度顯著高于未分級(jí)絮體組和>50 μm絮體組(P<0.05)，其余菌門細(xì)菌差異不顯著(P>0.05)。12 h后，3組絮體樣本的變形菌門和放線菌門的細(xì)菌數(shù)量均有所增加，變形菌門(未分級(jí)絮體組51.88%，<50 μm絮體組44.85%，>50 μm絮體組44.91%)成為主要優(yōu)勢(shì)菌，其次是放線菌門(未分級(jí)絮體組32.39%，<50 μm絮體組29.62%，>50 μm絮體組34.31%)，其余菌群在數(shù)量上均有所減少。各組微生物在門水平上的組成分布與本試驗(yàn)之前的研究結(jié)果[20]一致。

圖5 氨氮快速轉(zhuǎn)化不同時(shí)間點(diǎn)3組粒徑絮體在門(a)、綱(b)、屬(c)水平上群落結(jié)構(gòu)組成分布Fig.5 The composition and distribution of community structure at different time on the phylum(a), class(b) and genus(c) levels in the three different treatment groups throughout the rapid ammonia nitrogen conversion periodA.未分級(jí)絮體組； B.<50 μm絮體組; C.>50 μm絮體組.A.flocs without screening; B.<50 μm of flocs; C.>50 μm of flocs.

綱的分類水平上，3組絮體主要菌綱有放線菌綱(未分級(jí)絮體組28.30%，<50 μm絮體組23.98%，>50 μm絮體組29.60%)、α-變形菌綱(未分級(jí)絮體組14.70%，<50 μm絮體組11.81%，>50 μm絮體組11.85%)、γ-變形菌綱(未分級(jí)絮體組9.91%，<50 μm絮體組8.03%，>50 μm絮體組9.87%)、β-變形菌綱(未分級(jí)絮體組8.03%，<50 μm絮體組5.63%，>50 μm絮體組6.08%)和芽孢桿菌綱(未分級(jí)絮體組5.51%，<50 μm絮體組19.55%，>50 μm絮體組7.78%)，<50 μm絮體組芽孢桿菌綱顯著高于未分級(jí)絮體組和>50 μm絮體組(P<0.05)(圖5b)。鞘脂桿菌綱、噬纖維菌綱、δ變形菌綱、黃桿菌綱、暖繩菌綱、芽單胞菌綱、藍(lán)細(xì)菌、梭菌綱等豐度均低于5%，且不同粒徑絮團(tuán)差異不顯著(P>0.05)。

屬的分類水平上，將相對(duì)比例小于0.5%的歸為其他，占21.37%～24.51%(圖5c)。未分級(jí)絮體組和>50 μm絮體組優(yōu)勢(shì)菌屬包括紅球菌屬(Rhodococcus)(未分級(jí)絮體組16.45%，>50 μm絮體組17.84%，<50 μm絮體組11.58%)、微桿菌屬(Microbacterium)(未分級(jí)絮體組8.91%，>50 μm絮體組8.86%，<50 μm絮體組9.69%)和噬氫菌屬(Hydrogenophaga)(未分級(jí)絮體組6.50%，>50 μm絮體組4.41%，<50 μm絮體組4.89%)；此外，<50 μm絮體組中芽孢桿菌屬(Bacillus)(<50 μm絮體組19.49%，未分級(jí)絮體組5.40%，>50 μm絮體組7.71%)顯著高于其他兩組(P<0.05)。其余菌屬副球菌屬(Paracoccus)、Caldilineaceaenorank、假單胞菌屬(Pseudomonas)、柔發(fā)菌屬(Flexithrix)、水單胞菌屬(Aquimonas)、申氏桿菌屬(Shinella)、Gemmobacter、Algoriphagus、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、Arenibacter、絲狀菌屬(Candidatus_Alysiosphaera)、突柄桿菌屬(Prosthecobacter)及不知名屬等均低于5%。

3 討 論

3.1 不同絮體粒徑對(duì)氮素轉(zhuǎn)化的影響

Yang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水體中氨氮的質(zhì)量濃度大于10 mg/L時(shí)，水體中硝化細(xì)菌的硝化反應(yīng)將會(huì)受到抑制。本試驗(yàn)中氨氮轉(zhuǎn)化監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)前2 h氨氮質(zhì)量濃度先升后降，亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮均有小幅下降再回升，可能是此時(shí)段硝化反應(yīng)提速。而后，在碳源充足的條件下，生物絮團(tuán)異養(yǎng)細(xì)菌的同化作用快于水體中硝化細(xì)菌的硝化作用。8 h后，氨氮持續(xù)降低，亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮開(kāi)始上升，說(shuō)明此時(shí)絮團(tuán)進(jìn)行硝化過(guò)程。

3.2 不同絮體粒徑絮團(tuán)的營(yíng)養(yǎng)成分和微生物群落組成

本試驗(yàn)中，生物絮團(tuán)中粗蛋白水平分別為(31.91±1.58)%、(34.40±0.39)%、(34.67±1.59)%，與Emerenciano等[23]在圣保羅對(duì)蝦(Farfantepenaeuspaulensis)養(yǎng)殖系統(tǒng)中用蔗糖和麥麩作為碳源，Xu等[24]在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)養(yǎng)殖系統(tǒng)以蔗糖作為碳源，其所培養(yǎng)生物絮團(tuán)中粗蛋白水平一致，說(shuō)明生物絮團(tuán)是一種水產(chǎn)動(dòng)物潛在的重要食物來(lái)源。在生物絮團(tuán)系統(tǒng)中添加碳源可以提高微生物群落的多樣性、穩(wěn)定性和緩沖性[25-27]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著碳源的添加，生物絮團(tuán)異養(yǎng)微生物的生物代謝率遠(yuǎn)高于硝化細(xì)菌的生物代謝率，生物絮團(tuán)微生物群落結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌的結(jié)構(gòu)。已有研究證實(shí)了生物絮團(tuán)系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況[6,27]。隨著溶解性有機(jī)碳的降低，微生物群落多樣性降低。本次試驗(yàn)絮體檢測(cè)后均發(fā)現(xiàn)，<50 μm絮體組中芽孢桿菌屬為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，且顯著高于其他兩組，說(shuō)明粒徑對(duì)厚壁菌門

芽孢桿菌的含量影響顯著。

3.3 不同絮體粒徑對(duì)絮團(tuán)功能的影響

組成生物絮團(tuán)的細(xì)菌群落是復(fù)雜多樣的，需要借助功能基因的研究來(lái)揭示細(xì)菌群體感應(yīng)的影響機(jī)制和作用機(jī)理。異養(yǎng)細(xì)菌是生物絮團(tuán)系統(tǒng)中總氨氮去除的主要力量[28]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在兩次氨氮快速轉(zhuǎn)化過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、浮霉菌門和芽單胞菌門等異養(yǎng)細(xì)菌，其中放線菌和擬桿菌是常見(jiàn)的益生菌[29]。變形菌門細(xì)菌的功能主要是清除水中有機(jī)物[30-31]，變形菌門占據(jù)優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)有效調(diào)節(jié)水質(zhì)起到至關(guān)重要的作用。浮霉菌門的細(xì)菌具有介導(dǎo)參與厭氧氨氧化，使亞硝態(tài)氮和氨氮直接轉(zhuǎn)化成氮?dú)獾哪芰32]。厚壁菌門為革蘭氏陽(yáng)性、低G+C含量的一類原核微生物[33]。芽孢桿菌綱和梭菌綱構(gòu)成了厚壁菌門的主體。其中芽孢桿菌綱內(nèi)的物種由于大多可形成抗逆性極強(qiáng)的芽孢，因而具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。迄今為止，已篩選出的異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌主要集中于副球菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)與芽孢桿菌屬等。本試驗(yàn)中，氨氮快速轉(zhuǎn)化絮團(tuán)中均檢測(cè)到芽孢桿菌，芽孢桿菌是一類重要的產(chǎn)絮菌[34-35]，具有異養(yǎng)硝化—好氧反硝化能力[36]，能改善養(yǎng)殖用水水質(zhì)[37]，作為飼料添加劑使用時(shí)可促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)，提高機(jī)體免疫及抗病能力[38-40]。本試驗(yàn)在絮團(tuán)中均檢測(cè)到芽孢桿菌屬，分析菌群豐度可知，芽孢桿菌屬在<50 μm絮體組中為主要優(yōu)勢(shì)菌，豐度顯著高于其他兩組。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，3組不同粒徑絮體組對(duì)氨氮的同化去除速度相同，對(duì)水體中氨氮快速轉(zhuǎn)化效果差異不顯著。高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，不同粒徑絮體組在門、綱、屬水平上的微生物群落組成基本相似，生物絮團(tuán)培養(yǎng)過(guò)程中主要生物類群隸屬于6個(gè)綱即放線菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、芽孢桿菌綱和鞘脂桿菌綱。在屬水平上，紅球菌屬、微桿菌屬、噬氫菌屬和芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，其余為副球菌屬、假單孢菌屬、水單胞菌屬、分支桿菌屬、絲狀菌屬等多個(gè)菌屬和一些未知菌屬。氨氮快速轉(zhuǎn)化絮團(tuán)檢測(cè)結(jié)果顯示，<50 μm絮體組厚壁菌門(芽孢桿菌屬)菌群豐度顯著高于其余兩組，粒徑對(duì)厚壁菌門(芽孢桿菌屬)的含量影響差異性顯著；碳源添加可以提高微生物群的多樣性、穩(wěn)定性，隨著溶解性有機(jī)碳的降低，微生物多樣性降低。由試驗(yàn)結(jié)果可知，控制生物絮團(tuán)—水產(chǎn)養(yǎng)殖中絮體粒徑<50 μm的絮團(tuán)占主要地位，有利于芽孢桿菌的富集生長(zhǎng)，對(duì)調(diào)控同化作用和硝化作用的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系起至關(guān)重要的作用。