蓋文彬,畢明霞,姜宏

(青島大學(xué)國家生理學(xué)重點(培育)學(xué)科,山東青島 266071)

膽固醇酯化酶甾醇O-?；D(zhuǎn)移酶1(SOAT1)是膽固醇酯生物合成的關(guān)鍵酶[1],對維持細(xì)胞內(nèi)脂代謝的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。SOAT1在多種腫瘤中異常高表達(dá),與原發(fā)性肝癌、胰腺癌、腎癌和前列腺癌等的預(yù)后不良密切相關(guān),提示SOAT1或可作為多種腫瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。在肝癌細(xì)胞中SOAT1通過促進(jìn)膽固醇的合成,進(jìn)而影響癌細(xì)胞的生長和遷移,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2-5]。因此,研究肝癌細(xì)胞中SOAT1蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機制,可以為深入了解肝癌的發(fā)病機制及尋找新型藥物治療提供新的思路。

在腫瘤中SOAT1 轉(zhuǎn)錄水平并沒有明顯變化,而蛋白表達(dá)上調(diào)卻十分顯著,提示腫瘤中異常高表達(dá)的SOAT1 主要受到蛋白水平的調(diào)控[3]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是生物體內(nèi)維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要途徑,蛋白發(fā)生泛素化修飾后會被蛋白酶體降解。泛素化修飾是一種依賴ATP 的級聯(lián)反應(yīng),需要泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3的參與[6-8]。泛素化修飾是一種可逆的動態(tài)過程,除了上述酶分子,去泛素化酶(DUB)也參與其中,它與泛素連接酶E3共同維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[9]。已有研究證實,SOAT1的表達(dá)受到泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的調(diào)控[10],但維持其蛋白穩(wěn)定性的DUB卻未見報道。本研究旨在鑒定SOAT1的DUB,揭示在肝癌細(xì)胞中SOAT1蛋白異常高表達(dá)的分子機制,為研發(fā)靶向SOAT1的腫瘤治療藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Protein A/G-agarose beads、GAPDH、SOAT1抗體、Normal IgG、相關(guān)二抗購自Santa Cruz公司;Flag抗體、蛋白酶體抑制劑MG132購自Sigma公司;HA-Ubiquitin 抗體購自MBL 公司;Lipofectamine2000購自Invitrogen 公司;OTUD3 抗體購自abcam 公司;RPMI-1640(1∶1)培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、MEM 和DMEM 購自Gibco公司;Super-Signal west pico chemiluminescence substract購自Thermo公司;PBS粉末、抗原修復(fù)液購自北京中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人腎上皮細(xì)胞系HEK293T、人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞HCCLM3、人肝星形細(xì)胞LX2、人肝癌細(xì)胞SK-HEP-1、人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞97 H 培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS、100 mg/L 青鏈霉素混合液的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液中;正常人肝上皮細(xì)胞HL-7702、人肝癌細(xì)胞系SSMC7721、人肝癌細(xì)胞BEL-7402培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS、100 mg/L 青鏈霉素混合液的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中;肝癌亞力山大細(xì)胞PLC/PRF/5培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS、100 mg/L青鏈霉素混合液的MEM 細(xì)胞培養(yǎng)液中。上述細(xì)胞均應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)皿,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。傳代時用與細(xì)胞等滲的PBS洗去血清,加入2.5 g/L 胰蛋白酶進(jìn)行消化,并根據(jù)實驗需要將細(xì)胞鋪于不同規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中。

1.3 質(zhì)粒及引物構(gòu)建

人源DUB文庫(載體pCMV6-entry)購自O(shè)ri-Gene 公司。OTUD3 及OTUD3 的酶活突變體C76A 購自生物工程(上海)公司。引物序列見表1。

表1 載體引物序列

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑。在無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入需要轉(zhuǎn)入細(xì)胞的質(zhì)粒DNA 和所需量的脂質(zhì)體,單獨混合室溫放置,5 min后將含有質(zhì)粒DNA 和所需量脂質(zhì)體的無血清培養(yǎng)液混合孵育,30 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,37 ℃培養(yǎng)4 h后棄去含DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液,換成含血清和抗生素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 免疫共沉淀實驗

用25 cm2的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞到70%融合,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h 后收集細(xì)胞;用預(yù)冷的PBS 洗滌3 次,4 ℃下以3 000 r/min離心5 min;用HEPES裂解液裂解細(xì)胞,超聲處理2 min;4 ℃下以12 000 r/min離心10 min,取上清,除少量作為lysate蛋白樣品外,其余上清中加入相應(yīng)抗體1μg,4 ℃下在旋轉(zhuǎn)混合器上混勻3 h;加入protein A/G-agarose,4 ℃混勻8 h以上;4℃下以3 000 r/min離心5 min,用裂解液洗滌3次,加入2×Sample buffer,100 ℃變性15 min,樣品進(jìn)行免疫印跡檢測。

1.6 體內(nèi)泛素化修飾實驗

應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)入各種目的質(zhì)粒;收獲細(xì)胞前8 h 加入20μmol/L MG132 處理;36～48 h后用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞,并超聲破碎;收集部分裂解液檢測各種質(zhì)粒的表達(dá);加入相應(yīng)抗體進(jìn)行免疫沉淀,4 ℃混勻8 h以上;用RIPA 裂解液洗滌,加入2×Sample buffer,100 ℃變性15 min,樣品進(jìn)行免疫印跡檢測。

1.7 免疫印跡檢測

收集細(xì)胞后,加入實驗所需的細(xì)胞裂解液及等量的2×Sample buffer混合,100 ℃沸水煮15 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳;分離實驗所需目的條帶的SDS變性膠,將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,置含50 g/L脫脂牛奶的TBST 緩沖液中封閉90 min;然后加一抗室溫孵育3 h或4 ℃過夜,用TBST 緩沖液洗膜3次,每次10 min;加耦聯(lián)HRP的二抗孵育1 h,用TBST 洗膜3次后,加入底物化學(xué)發(fā)光劑,于暗室中進(jìn)行X 線片曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對SOAT1蛋白表達(dá)影響

免疫印跡檢測結(jié)果顯示,SOAT1 在不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平不同(圖1A),選擇SOAT1表達(dá)較低的HCCLM3細(xì)胞系,加入蛋白酶體抑制劑MG132后,SOAT1的蛋白表達(dá)水平回升(圖1B)。此外,SOAT1可以在肝癌細(xì)胞HCCLM3中發(fā)生多聚泛素化修飾(圖1C)。該結(jié)果表明,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與調(diào)控SOAT1的蛋白穩(wěn)定性。

圖1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對SOAT1蛋白表達(dá)影響

2.2 OTUD3與SOAT1的相互作用

選用人腎上皮細(xì)胞系HEK293T 進(jìn)行實驗,在人源去泛素化酶OTU 家族成員中進(jìn)行無偏性相互作用篩選,結(jié)果顯示,OTUD3 可以特異地與內(nèi)源SOAT1發(fā)生相互作用(圖2)。

圖2 OTUD3與SOAT1相互作用的免疫共沉淀實驗檢測

2.3 OTUD3對SOAT1多聚泛素化的影響

選用人腎上皮細(xì)胞系HEK293T 進(jìn)行泛素化實驗,結(jié)果顯示,過表達(dá)OTUD3能有效去除SOAT1蛋白的多聚泛素化(圖3A)。并且,只有野生型的OTUD3可以去泛素化修飾SOAT1,而酶活突變體OTUD3-C76A 無法去除SOAT1 蛋白的多聚泛素化(圖3B),說明OTUD3的去泛素化酶活性對穩(wěn)定SOAT1至關(guān)重要。

圖3 OTUD3對SOAT1多聚泛素化的影響

2.4 OTUD3對SOAT1蛋白穩(wěn)定性的影響

在HEK293T 細(xì)胞中梯度過表達(dá)OTUD3,可特異性上調(diào)SOAT1的蛋白表達(dá)水平(圖4),表明OTUD3通過去除SOAT1的多聚泛素化修飾維持SOAT1的蛋白穩(wěn)定性。

圖4 OTUD3對SOAT1蛋白穩(wěn)定性的影響

3 討 論

本研究鑒定出了調(diào)控SOAT1 蛋白表達(dá)的DUB分子OTUD3,OTUD3依賴其去泛素化酶活性,通過特異性去除SOAT1的多聚泛素化修飾,維持SOAT1的蛋白穩(wěn)定性。

SOAT1是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的5 次跨膜蛋白[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成和折疊的重要場所,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白穩(wěn)態(tài)由一套精細(xì)的質(zhì)量控制系統(tǒng)調(diào)控。當(dāng)新合成的蛋白質(zhì)發(fā)生錯誤折疊時,它最終會從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被逆向轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì),隨后被泛素化降解,這一途徑被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解,簡稱為ERAD[7,11]。近年來的研究結(jié)果表明,ERAD 減輕了蛋白質(zhì)錯誤折疊引起的細(xì)胞毒性,其對突變蛋白的降解在多種疾病中發(fā)揮作用[12-14]。在ERAD 過程中,已經(jīng)鑒定出的泛素連接酶E3數(shù)量并不多[11],并且在底物的特異性識別過程中DUB承擔(dān)關(guān)鍵的作用[15]。因此,鑒定出SOAT1 的DUB 對于闡明維持SOAT1蛋白穩(wěn)態(tài)的分子機制尤為重要。

膽固醇是生物體內(nèi)一種重要的分子,它既是細(xì)胞膜的重要組成部分,也是很多固醇類激素的前體[1,16]。但是,細(xì)胞內(nèi)的游離膽固醇過多是有害的,其會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被?；?以疏水的膽固醇酯的形式儲存起來,這一過程由SOAT1催化[1,12,17-19]。有研究表明,癌細(xì)胞中高表達(dá)的SOAT1通過影響膽固醇酯的合成,促進(jìn)癌癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[3],敲除或者抑制SOAT1后,肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力降低[3]。SOAT1高表達(dá)與肝癌、甲狀腺癌、頭頸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、胰腺癌等不良預(yù)后均有關(guān),有望被用作多種腫瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點[17,20-22]。近年來,腫瘤免疫治療備受關(guān)注,已有研究結(jié)果顯示,聯(lián)合應(yīng)用SOAT1 抑制劑Avasimibe和抗程序性死亡受體1抗體對小鼠黑色素瘤進(jìn)展的控制效果優(yōu)于單用Avasimibe[23]。因此,研究維持SOAT1蛋白穩(wěn)定性的分子機制對于疾病的治療及預(yù)后評估具有重要意義。

SOAT1的蛋白穩(wěn)定性受到泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的調(diào)控[10],泛素化與去泛素化作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在控制底物降解中起著至關(guān)重要的作用,參與了調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白穩(wěn)態(tài)和各項生命活動[2]。目前,調(diào)控SOAT1的泛素連接酶E3未見文獻(xiàn)報道,本研究鑒定出的SOAT1 的去泛素化酶OTUD3,可特異性去除SOAT1 的多聚泛素化修飾,從而維持其蛋白穩(wěn)定性。OTUD3是OTU 家族的去泛素化酶。本實驗室前期研究顯示,在乳癌、結(jié)腸癌、肝癌和宮頸癌中,OTUD3 通過穩(wěn)定人第10號染色體缺失的磷酸酶以及張力蛋白同源物基因(PTEN)發(fā)揮抑癌作用[24];而在肺癌中,OTUD3通過穩(wěn)定促癌蛋白GRP78發(fā)揮促癌作用[25]。

綜上所述,本研究首次揭示OTUD3是SOAT1的去泛素化酶,該結(jié)果對于明確SOAT1蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機制以及靶向SOAT1的腫瘤治療具有重要意義。