劉偉

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東青島 266071)

阿爾茨海默病(AD)又稱為老年癡呆癥,是一種多發(fā)于老年人群的神經(jīng)退行性疾病,也是癡呆癥最常見的病因。隨著預(yù)期壽命的持續(xù)增長,AD 發(fā)病率將會(huì)越來越高。到2050年,全世界癡呆癥的人數(shù)預(yù)計(jì)將增加到1.315億[1]。盡管進(jìn)行了數(shù)十年的研究,但該病至今尚未找到有效的治療方法。AD 的病因復(fù)雜,涉及遺傳、環(huán)境等多種因素。目前關(guān)于AD 病因的假說有很多,包括膽堿能假說、β淀粉樣蛋白(Aβ)毒性假說、tau蛋白異常修飾假說、鈣穩(wěn)態(tài)假說等,其中被廣泛認(rèn)同的是Aβ毒性假說[2-3]。離子通道假說是Aβ發(fā)揮毒性的一種機(jī)制,該假說認(rèn)為,Aβ變構(gòu)、組裝成離子通道結(jié)構(gòu),嵌入脂質(zhì)雙層膜,造成膜泄漏和鈣穩(wěn)態(tài)失衡,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡[4-5]。

Anle138b是一種低聚物調(diào)節(jié)劑,具有出色的口服生物利用度和血-腦脊液屏障滲透性,并且在治療劑量下沒有可檢測到的毒性[6]。分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)表明,Anle138b可以有效地阻斷肽鏈相互作用并阻止自發(fā)形成有序的β-折疊結(jié)構(gòu)[7]。2018年,MARTINEZ HERNANDEZ等[8]對(duì)AD 大鼠模型及人工膜的研究表明,Anle138b可以阻止Aβ打孔的活動(dòng),而不會(huì)改變膜嵌入的Aβ低聚物結(jié)構(gòu)。Anle138b是首個(gè)被報(bào)道的能夠在通道形成后將其阻斷并改善Aβ病理變化的化合物,并且還可以減少病理性tau蛋白聚集體,是治療AD 相關(guān)病理改變的新型且有希望的化合物,但是該藥在細(xì)胞模型上的研究結(jié)果較少[9]。因此,本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞模型上通過對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡損傷情況的檢測,觀察了Aβ通道抑制劑Anle138b對(duì)慢性Aβ寡聚體(AβOs)誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元毒性作用的影響,為開發(fā)治療AD 新型藥物提供思路?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞(從大鼠新生鼠腦內(nèi)獲取),DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胰蛋白酶(美國Hyclone公司),胎牛血清(FBS,美國Gibco公司),Anle138b(Medchem Express公司),青霉素-鏈霉素溶液(100×,北京索萊寶科技有限公司),Aβ42單體粉末(杭州丹港生物科技有限公司),BCA 蛋白定量檢測試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司),D-多聚賴氨酸(美國Sigma公司),cleaved caspase-3 抗體(上海Cell Signaling 公司),ECL 發(fā)光液以及PAGE凝膠快速制備試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司),乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AβOs制備 取1 mg的Aβ42粉末和六氟異丙醇(HFIP)置于冰上預(yù)冷,向裝有Aβ42粉末的EP管中加入222μL的HFIP,密封,渦旋混勻,室溫下孵育60 min,直到液體澄清,得到1 mmol/L 的Aβ-HFIP溶液。將Aβ-HFIP溶液置于冰上5 min,取4只無菌EP管,分裝Aβ-HFIP溶液55μL,在通風(fēng)櫥中將HFIP揮干,得到無色透明Aβ肽膜,置-20 ℃冰箱保存。使用前,取1支分裝管,在冰上加入二甲基亞砜(DMSO)11μL,水浴超聲(300 W,35 Hz)處理10 min,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)539μL,渦旋混勻,置于冰箱中4℃孵育1 d。使用離心機(jī)在4℃下以13 000 r/min離心10 min,上清即為100μmol/L的AβOs[10]。

1.2.2 海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)前先將所有實(shí)驗(yàn)器械高壓滅菌以確保細(xì)胞不被污染。12孔板用

多聚賴氨酸包被,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置2 h以上,實(shí)驗(yàn)前用高壓后的雙蒸水沖洗3次,去除多聚賴氨酸,放于培養(yǎng)箱中備用。將小鼠浸泡于體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇中消毒,用剪刀剪下頭部后取出大腦,將其置于盛有基礎(chǔ)培養(yǎng)液預(yù)冷的培養(yǎng)皿中,在解剖顯微鏡下取出海馬體(位于大腦皮質(zhì)內(nèi),有較為明顯的血管膜界限),并去除血管膜。加入胰蛋白酶5 m L,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化5 min,使用含有FBS的完全培養(yǎng)液終止消化。使用移液槍將海馬體移至新的培養(yǎng)皿中,將其吹打均勻,沉淀后轉(zhuǎn)移上清至離心管中,以1 000 r/min離心5 min,棄上清,用含B27 的培養(yǎng)液輕輕吹打混勻。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度約為7×108/L。將細(xì)胞懸液以每孔1.5 m L接種于6 孔板中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔3 d進(jìn)行1次半換液,細(xì)胞培養(yǎng)7～8 d后觀察細(xì)胞狀態(tài),待神經(jīng)元胞體發(fā)育飽滿、突觸連接明顯后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(A組,無處理措施)、AβOs處理組(B 組,用0.1μmol/L的AβOs處理7 d)和Anle138b處理組(C 組,用0.1μmol/L的AβOs處理7 d,在AβOs處理后5 d加用0.1μmol/L的Anle138b)。

1.2.4 海馬神經(jīng)元LDH 釋放量檢測 細(xì)胞處理結(jié)束后,轉(zhuǎn)移各組上清至EP管中,并置于冰上。按照試劑盒說明書進(jìn)行LDH 檢測,操作過程應(yīng)謹(jǐn)慎迅速,防止LDH 降解。將待測樣本轉(zhuǎn)移到96 孔板中,加入基質(zhì)緩沖液和輔酶Ⅰ后,37℃孵育15 min;加入2,4-二硝基苯肼,37 ℃孵育15 min;加入NaOH 溶液,室溫孵育5 min;用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm 波長處的吸光度值,按照試劑盒說明書的公式計(jì)算培養(yǎng)液中LDH 含量。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)方法檢測cleaved caspase-3 的表達(dá) 將待測樣本轉(zhuǎn)移到12孔板中,每孔加入蛋白裂解液60μL,在冰上裂解30 min,使用刮板將貼附在板底的海馬神經(jīng)元細(xì)胞刮凈,轉(zhuǎn)移裂解液和細(xì)胞至EP 管中,在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min,吸取上清至新的EP 管中,使用BCA 試劑盒測定樣品蛋白濃度。加入1/4上清量的5×Loading Buffer,95℃加熱5 min,樣品置于-20 ℃保存。使用125 g/L 的PAGE 凝膠進(jìn)行電泳,將制備好的蛋白樣品加入膠孔中,以80 V電壓跑濃縮膠,120 V 電壓跑分離膠。電泳結(jié)束后,取出凝膠,應(yīng)用0.22μm 的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,以300 m A 恒定電流在冰上轉(zhuǎn)膜約90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用封閉液封閉2 h,根據(jù)分子量大小裁膜,得到相關(guān)蛋白條帶后加入一抗(稀釋比例1∶800),4 ℃搖床孵育過夜,TBST 洗3次,每次10 min;加入二抗(稀釋比例1∶10 000)后室溫孵育1 h,TBST 洗3次,每次10 min。ECL發(fā)光試劑顯影后,用Image J軟件進(jìn)行灰度分析,結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白β-actin的灰度值之比表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s的形式表示,多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,并繼以Tukey法進(jìn)行多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Anle138b 對(duì)AβOs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型LDH釋放量的影響

與空白對(duì)照組相比,AβOs處理組海馬神經(jīng)元細(xì)胞LDH 釋放量增加(F=14.810,q=7.481,P＜0.01);與AβOs處理組相比較,Anle138b處理組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的LDH 釋放量降低(q=5.310,P＜0.05)。見表1。

2.2 Anle138b對(duì)AβOs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,AβOs處理組細(xì)胞凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)升高(F=6.677,q=4.816,P＜0.05);與AβOs處理組相比較,Anle138b 處理組海馬神經(jīng)元細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)有下降趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.255,P＞0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞LDH 釋放量及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)

表1 各組細(xì)胞LDH 釋放量及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)

組別LDH 釋放量(n=4,z/U·L-1)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)(n=6)A 組46.920±7.349 0.789±0.072 B組107.300±9.372 1.480±0.155 C組64.430±7.312 1.014±0.112

3 討 論

隨著社會(huì)老齡化的加劇,在中老年人群中AD患病率成倍增加,給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的治療AD 藥物主要有兩類,一類是膽堿酯酶抑制劑,另一類是興奮性氨基酸受體拮抗劑[11]。盡管已證明這些藥物對(duì)AD癥狀的控制具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但它們的治療效果并不穩(wěn)定,并且作用持續(xù)時(shí)間有限[12]?；诂F(xiàn)有療法的低效率,迫切需要開發(fā)能阻止疾病發(fā)展的藥劑,找到AD 的新療法。而Aβ通道小分子阻斷劑將會(huì)是治療AD 相關(guān)病理改變的一種新穎且有希望的化合物[9]。Anle138b是首個(gè)被報(bào)道的能夠在通道形成后將其阻斷并改善Aβ病理變化的化合物,但是該藥物在細(xì)胞模型上的研究結(jié)果較少,因此本實(shí)驗(yàn)使用體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元作為實(shí)驗(yàn)材料,并且降低AβOs給藥濃度,采用連續(xù)7 d慢性給藥的方式,研究Anle138b對(duì)慢性AβOs誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元毒性作用的影響。相較于人工膜以及急性分離模型,原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元可以形成較為發(fā)達(dá)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),細(xì)胞間可以進(jìn)行突觸傳遞和信號(hào)交流,更加接近生理環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)先給予AβOs處理5 d,再用Anle138b和AβOs共處理2 d,這種給藥方式更能表現(xiàn)出Anle138b能夠在Aβ通道形成后將其阻斷的作用機(jī)制,這也是本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的創(chuàng)新性所在。

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與AβOs處理組相比,Anle138b處理能夠降低海馬神經(jīng)元細(xì)胞LDH 釋放量,并且凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)也呈下降趨勢。表明Anle138b在慢性AβOs誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡模型中有一定的保護(hù)作用。后續(xù)研究尚需進(jìn)一步加大樣本量,這樣cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量的下降將可能有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)更明確且具有說服力。近年來,Aβ如何影響神經(jīng)元和突觸功能受到關(guān)注[13-15]。而Aβ與質(zhì)膜的相互作用是AD 發(fā)展的關(guān)鍵,二者相互作用的結(jié)果之一就是形成離子通道[16-18]。離子通道形成后,會(huì)造成膜泄漏和鈣穩(wěn)態(tài)失衡進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡[19]。本研究Anle138b表現(xiàn)出對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用可能就是通過阻斷Aβ通道的作用。到目前為止,在包括輕度至中度AD 病人的臨床試驗(yàn)中,大部分治療方法均未成功通過Ⅲ期臨床試驗(yàn),進(jìn)行分析時(shí),在疾病過程中采取干預(yù)措施開始太晚是解釋此類失敗的經(jīng)常性的論據(jù)之一,認(rèn)為早期的預(yù)防性治療將帶來好處[20]。aducanumab抗體的臨床試驗(yàn)也是集中在早期或中期病人[21-23],然而實(shí)際上AD 病人被確診基本處于發(fā)病后期,并且目前AD 發(fā)病早期的診斷尚不成熟[24]。因此,尋求一種能在AD 發(fā)病后期發(fā)揮重要作用的藥物非常重要。而在本實(shí)驗(yàn)中,Anle138b加藥時(shí)間是在AβOs處理一定時(shí)間之后,故像Anle138b這種小分子阻斷劑可能在該病的治療中有很大的潛力[25]。