宓曉晴,謝俊霞,宋寧

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東青島 266071)

帕金森病(PD)是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病,其確切病因至今尚未完全明了[1-3],其主要病理特征為黑質(zhì)致密部多巴胺(DA)能神經(jīng)元缺失和路易小體(LB)形成,臨床主要表現(xiàn)有肌強(qiáng)直、靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩以及姿勢不穩(wěn)等[4-7]。α-突觸核蛋白(α-syn)是SNCA編碼的由140個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì),是LB的主要成分[8-10]。大量研究結(jié)果表明,PD 等突觸核蛋白病病人腦脊液中的α-syn水平較正常人顯著降低[11-12]。然而,長期追蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn),PD 病人腦脊液中的α-syn水平會(huì)隨著疾病進(jìn)展逐漸回升,而且α-syn水平的升高與PD 病人后期運(yùn)動(dòng)功能的下降存在緊密聯(lián)系[13-14]。單胺氧化酶B(MAO-B)是一種線粒體膜蛋白,是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的主要氧化脫氨酶,可分解DA 產(chǎn)生3,4-二羥基苯基乙醛(DOPAL)等代謝產(chǎn)物[15-16]。有文獻(xiàn)報(bào)道,αsyn以及α-syn 1～103片段均可直接結(jié)合MAO-B而增強(qiáng)其酶活性,最終導(dǎo)致DA 能神經(jīng)元變性[17]。本文通過給予小鼠側(cè)腦室注射不同濃度α-syn,以評價(jià)其運(yùn)動(dòng)功能以及紋狀體和黑質(zhì)區(qū)MAO-B蛋白表達(dá)的變化?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級雄性C57BL/6小鼠,8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于可自由飲水取食、室溫(19±2)℃、濕度(50±5)%、晝夜循環(huán)光照(12 h/12 h)的清潔環(huán)境中。主要試劑:α-syn購自美國r Peptide公司;酪氨酸羥化酶(TH)一抗購自德國Sigma 公司;MAO-B一抗購自美國GeneTex公司;Rabbit Antiβ-actin購自中國博奧森公司;Goat Anti-Rabbit IgG二抗購自中國愛必信公司。

1.2 動(dòng)物分組與處理

將40只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(A 組)以及0.04、0.20和2.00 ngα-syn組(B、C、D 組),每組10只。小鼠用異戊烷麻醉后固定在腦立體定位儀上。剪開小鼠顱腦背側(cè)皮膚,用體積分?jǐn)?shù)0.03的過氧化氫溶液擦拭顱骨表面至顱縫和前后囟清晰可見。確定坐標(biāo)(右側(cè)側(cè)腦室立體定位坐標(biāo)為前囟后0.3 mm、右旁開1.0 mm、深度2.2 mm)后,將長5.2 mm 的套管垂直埋入側(cè)腦室2.2 mm。以1μL/min的流量注射生理鹽水或α-syn 2μL,每天1次,連續(xù)7 d。

1.3 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上適應(yīng)2 min后,將旋轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速設(shè)置為4～40 r/min,使小鼠隨旋轉(zhuǎn)棒自主運(yùn)動(dòng),記錄小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上運(yùn)動(dòng)的時(shí)間。測量2 次(間隔30 min)取平均值。

1.4 免疫印跡法檢測TH 和MAO-B蛋白表達(dá)

小鼠斷頭,根據(jù)小鼠大腦圖譜取紋狀體和黑質(zhì)樣本并稱質(zhì)量。按照25μL/mg的比例向樣本中加入蛋白裂解液,充分研磨后以12 000 r/min 離心20 min,取上清,用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度,加入1/4體積的Loading Buffer后95 ℃金屬浴5 min。處理好的蛋白樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜(0.45μm 的PVDF 膜)。以50 g/L 的脫脂奶粉室溫封閉2 h 后加入一抗TH(1∶3 000)、MAO-B(1∶1 000)、β-actin(1∶10 000)4 ℃孵育過夜,次日用山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,ECL 方法顯影。用Image J軟件分析條帶灰度值,TH 和MAO-B蛋白表達(dá)水平以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值來表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 側(cè)腦室注射不同濃度α-syn對小鼠行為學(xué)的影響

生理鹽水組以及0.04、0.20和2.00 ngα-syn組小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上運(yùn)動(dòng)的時(shí)間分別為(221.867±38.855)、(213.905±63.634)、(145.556±54.844)和(138.111±40.932)s,4 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.877,P＜0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與生理鹽水組相比較,0.04 ngα-syn組小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間無明顯變化(P＞0.05),而0.20和2.00 ngα-syn組小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯縮短,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.907、4.288,P＜0.05)。

2.2 側(cè)腦室注射不同濃度α-syn 對紋狀體區(qū)TH和MAO-B蛋白表達(dá)的影響

本研究4組小鼠紋狀體區(qū)TH 蛋白表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。4組小鼠紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.662,P＜0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與生理鹽水組相比較,0.04 ngα-syn組小鼠紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化(P＞0.05),0.20和2.00 ng的α-syn組小鼠紋狀體區(qū)MAO-B 蛋白表達(dá)水平顯著升高(q=4.281、6.993,P＜0.05)。見表1。

表1 各組小鼠紋狀體區(qū)TH 和MAO-B蛋白表達(dá)水平比較(n=6,±s)

表1 各組小鼠紋狀體區(qū)TH 和MAO-B蛋白表達(dá)水平比較(n=6,±s)

與A 組比較,F=9.662,*q=4.281、6.993,P＜0.05。

組別TH MAO-B A 組1.130±0.135 0.597±0.180 B組0.979±0.108 0.722±0.160 C組1.000±0.205 0.976±0.215*D組1.074±0.191 1.217±0.228*

2.3 側(cè)腦室注射不同濃度α-syn對黑質(zhì)區(qū)TH 和MAO-B蛋白表達(dá)的影響

本研究4組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH 和MAO-B蛋白表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與生理鹽水組相比,各濃度α-syn組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH 和MAO-B蛋白表達(dá)水平均沒有明顯改變(P＞0.05)。見表2。

表2 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH 和MAO-B蛋白表達(dá)水平比較(n=6,±s)

表2 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH 和MAO-B蛋白表達(dá)水平比較(n=6,±s)

組別TH MAO-B A 組0.968±0.224 0.901±0.402 B組0.901±0.122 0.868±0.414 C組1.016±0.180 0.825±0.324 D組0.882±0.131 1.000±0.279

3 討 論

編碼α-syn的SNCA是首個(gè)被人們發(fā)現(xiàn)的與PD 相關(guān)的常染色體顯性遺傳基因[18]。無論是在遺傳性PD 還是在散發(fā)性PD 中,α-syn均可以在DA能神經(jīng)元中積聚形成LB[19]。生理狀態(tài)下的α-syn通常被認(rèn)為是舒展的可溶性結(jié)構(gòu),但當(dāng)其濃度升高時(shí)α-syn易聚合折疊形成寡聚體,對神經(jīng)元膜有毒性作用,可改變膜滲透性,導(dǎo)致鈣大量內(nèi)流,引起膜除極;也可引起細(xì)胞氧化損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。細(xì)胞內(nèi)的α-syn還可以被釋放到細(xì)胞外。人的腦脊液和血漿中存在一定濃度的α-syn[21]。大量研究發(fā)現(xiàn),PD 病人腦脊液中的α-syn水平降低[11-12],但隨著疾病進(jìn)展,α-syn水平回升且與病人的認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)功能緊密相關(guān)[13-14]。

單胺氧化酶是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中催化DA、5-羥色胺和去甲腎上腺素等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的主要氧化脫氨酶。MAO-B 通過分解DA 產(chǎn)生DOPAL并產(chǎn)生活性氧(ROS)物質(zhì)和內(nèi)源性神經(jīng)毒素[16]。年齡相關(guān)的MAO-B 表達(dá)增加與自由基損傷和ROS增加存在密切關(guān)聯(lián),可導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體功能降低,導(dǎo)致黑質(zhì)致密部神經(jīng)元活力降低以至神經(jīng)變性[22]。MAO-B 抑制劑常被作為有效的PD治療藥物[23-24]。本研究結(jié)果表明,側(cè)腦室注射αsyn 7 d可引起C57BL/6小鼠紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達(dá)升高和運(yùn)動(dòng)功能障礙,但黑質(zhì)區(qū)MAO-B 蛋白表達(dá)不變。MAO-B 主要位于星形膠質(zhì)細(xì)胞,在星形膠質(zhì)細(xì)胞激活時(shí)MAO-B 蛋白表達(dá)明顯上調(diào),因此MAO-B可能作為星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的生化標(biāo)記物[25]。α-syn可以通過Toll樣受體4(TLR4)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞[26]。因此我們推測,紋狀體MAOB表達(dá)升高可能與側(cè)腦室注射的α-syn到達(dá)紋狀體后激活星形膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān),這尚需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。此外,MAO-B是DA 酶解途徑之一,當(dāng)MAO-B表達(dá)增加時(shí),一方面MAO-B 可促進(jìn)DA分解;另一方面,DA 分解產(chǎn)生的DOPAL 還可以激活δ分泌酶,在N103位置裂解α-syn。α-syn以及α-syn 1～103片段均可直接結(jié)合MAO-B而增強(qiáng)其酶活性[17,27]。我們推測,MAO-B 表達(dá)和活性的增加,可能在未造成DA 能神經(jīng)元損傷之前(本實(shí)驗(yàn)觀察到黑質(zhì)和紋狀體區(qū)TH 表達(dá)均不變)顯著促進(jìn)了紋狀體區(qū)DA 的分解,造成了小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙。與其他腦區(qū)相比較,黑質(zhì)中星形膠質(zhì)細(xì)胞分布相對較少[28],這可能是側(cè)腦室注射α-syn未引起黑質(zhì)區(qū)MAO-B蛋白表達(dá)變化的原因。

綜上所述,側(cè)腦室注射α-syn可引起C57BL/6小鼠紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達(dá)增加和運(yùn)動(dòng)功能障礙。本文研究結(jié)果為進(jìn)一步探討腦脊液中α-syn的變化影響PD 疾病進(jìn)程提供了新的實(shí)驗(yàn)思路和理論依據(jù)。