張?zhí)煺?譚曉華,吳翠嬌

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東青島 266071 1 人體解剖與組織胚胎學(xué)系; 2 病理學(xué)系)

腎缺血再灌注是指腎臟外科手術(shù)或腎實(shí)質(zhì)性損傷會(huì)阻斷腎臟血流造成缺血低氧,給予再灌注后,腎臟的血流和功能恢復(fù)。再灌注經(jīng)常伴隨著再氧化,會(huì)加重前期缺血低氧的組織損傷,造成再灌注損傷。在臨床上,腎缺血再灌注損傷是導(dǎo)致急性腎損傷的主要原因之一[1-2]。急性腎損傷后近端小管持續(xù)的炎癥狀態(tài)等病理改變會(huì)導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生,從而增加慢性腎臟病和終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。缺血再灌注損傷的病理生理過程復(fù)雜,涉及腎微血管病變、線粒體功能障礙、自噬、炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多個(gè)方面[4-6]。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,是除了死亡受體和線粒體功能障礙凋亡途徑外,新發(fā)現(xiàn)的第三種細(xì)胞凋亡途徑,也是缺血再灌注所致腎損傷的細(xì)胞反應(yīng)。已有研究結(jié)果證明,在腎缺血再灌注損傷后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的強(qiáng)度增強(qiáng),細(xì)胞凋亡增加,組織損傷加重[7-8]。減輕再灌注損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激強(qiáng)度或減少其持續(xù)時(shí)間,以降低器官組織結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙,成為研究熱點(diǎn)。有研究通過給予腎臟缺血前處理(IPC)證明,IPC對(duì)缺血再灌注導(dǎo)致的腎損傷具有保護(hù)作用[9]。但由于器官缺血時(shí)間的不可預(yù)知性,IPC處理具有明顯的臨床局限。另研究表明,缺血后處理(IPO)可以減輕缺血再灌注器官(心、肝、腎、腸、胃)的損傷[10]。主要認(rèn)為IPO 通過減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞自噬等機(jī)制,來減輕缺血再灌注引發(fā)的腎損傷[11-13]。但是有關(guān)缺血再灌注損傷后IPO 影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而影響組織損傷的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)通過建立動(dòng)物模型,運(yùn)用形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫熒光等技術(shù),檢測(cè)重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡因子的表達(dá),來進(jìn)一步探討IPO 如何影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而減輕缺血再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠36只,體質(zhì)量180～200 g,由青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 免疫顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;TUNEL 染色試劑盒購自德國曼海姆公司;抗體GRP78、CHOP、E-Cadherin均購自英國Abcam 公司;抗體Cleaved Caspase3購自美國Cell Signaling Technology公司;第二抗體購自索萊寶生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham 組)、缺血再灌注組(IR 組)和IPO組,每組12只。IR 組參照TAN 等[14]的研究建立腎缺血再灌注模型。術(shù)前大鼠禁食12 h,可自由飲水。術(shù)時(shí)大鼠腹腔注射100 g/L 水合氯醛5 m L/kg,麻醉后仰臥位將大鼠固定于鼠臺(tái)上,開腹暴露左、右腎,切除右腎,鈍性分離左腎,暴露左腎動(dòng)脈,用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾住左腎動(dòng)脈,觀察腎臟顏色由鮮紅色變?yōu)榘瞪创_認(rèn)腎臟血流阻斷,為缺血狀態(tài)。夾閉45 min后松開動(dòng)脈夾,觀察腎臟顏色由暗紅恢復(fù)成鮮紅色即確認(rèn)為血流恢復(fù),縫合腹部切口。大鼠蘇醒后放回鼠籠,予正常飲食,24 h后IR 模型制備成功。IPO 組在左腎動(dòng)脈夾閉45 min后,松開動(dòng)脈夾3 min,再夾閉左腎動(dòng)脈30 s,松開30 s,共6次,其余操作同IR 組。Sham 組只行開腹并切除右腎,游離左腎,分離出左腎動(dòng)脈不夾閉,切口用生理鹽水紗布覆蓋,45 min后關(guān)腹。建模24 h后,麻醉大鼠,開腹,用注射器采集下腔靜脈血2 m L,置于EP 管中,放冰上暫存。然后摘取右腎,處死大鼠。

1.2.2 腎功能指標(biāo)檢測(cè) 將裝有大鼠下腔靜脈血的EP管在4℃下以4 000 r/min離心10 min,用加樣器收集上層血清成分(不要吸到下層血細(xì)胞),將收集到的血清做好標(biāo)記后置-80 ℃冰箱保存。最后送醫(yī)院檢驗(yàn)科使用半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐和尿素氮濃度。

1.2.3 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 以40 g/L的中性甲醛溶液固定腎組織48 h,常規(guī)石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。腎小管損傷評(píng)分[15]:切片HE染色后在病變嚴(yán)重處采用Paller法對(duì)腎小管損傷程度進(jìn)行評(píng)分,即每個(gè)高倍視野隨機(jī)選擇10個(gè)有病變的腎小管區(qū)域按100個(gè)腎小管計(jì)分。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):腎小管明顯擴(kuò)張、細(xì)胞扁平1分,刷狀緣損傷或脫落1分或2分,管型2分,腎小管管腔內(nèi)有脫落的、壞死的細(xì)胞以及未成管型或細(xì)胞碎片1分。

1.2.4 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腎組織中Cleaved Caspase3蛋白表達(dá) 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟及乙醇梯度水化后,用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)(檸檬酸鈉,p H 值6.0),加Cleaved Caspase3抗體(1∶200)4℃過夜孵育。次日,室溫復(fù)溫40 min,以PBS洗片,加二抗(羊抗兔)37 ℃孵育1 h,以PBS 洗片后進(jìn)行DAB染色,水洗終止染色后用蘇木精復(fù)染12 s。最后采用乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,在光鏡下觀察。

1.2.5 Western blotting法檢測(cè)腎組織中Cleaved Caspase3蛋白表達(dá) 制作腎組織勻漿后提取蛋白。分別制作100、120 g/L 的SDS-PAGE 分離膠和50 g/L的濃縮膠,在膠板上按照25μg的加樣量上樣,電泳1 h,然后電轉(zhuǎn)50 min。電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜后以50 g/L脫脂奶粉封閉3 h,然后加Cleaved Caspase3抗體(1∶1 000)4 ℃過夜孵育。次日,以1×TBST 洗PVDF膜后,再加入二抗孵育2 h。以1×TBST 洗PVDF膜后,在膜上加顯影液用顯影儀顯影。然后用Image J軟件分析條帶的灰度值,以β-actin為內(nèi)參照,計(jì)算蛋白表達(dá)量。蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.2.6 TUNEL染色檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡 常規(guī)石蠟包埋制作腎組織切片(5μm),切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化后,用PBS洗滌3次,每次5 min。用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體,立即在切片上加2滴Td T 酶緩沖液,室溫放置5 min。用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體,立即在切片上滴加54μL Td T 酶反應(yīng)液,置濕盒中于37 ℃反應(yīng)1 h。將切片置于染色缸中,加入已預(yù)熱到37 ℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液,于37 ℃保溫30 min,每10 min將載玻片輕輕提起和放下1次,使液體輕微攪動(dòng)。組織切片用PBS洗滌3次,每次5 min。直接在切片上滴加2滴過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體,于濕盒中室溫反應(yīng)30 min。用PBS洗3次,每次5 min。在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.5 g/L的DAB 溶液,室溫顯色5 min。用蒸餾水洗4次,前3次每次1 min,最后1次5 min。于室溫下用甲基綠復(fù)染10 min。用蒸餾水洗3次,前2次將載玻片提起放下10次,最后1次靜置30 s。依同樣方法再用正丁醇洗3次,用二甲苯脫水。封片、干燥后在光學(xué)顯微鏡下取5個(gè)不同的視野,分別計(jì)數(shù)總的細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù),計(jì)算細(xì)胞凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/總的細(xì)胞數(shù))。

1.2.7 免疫熒光檢測(cè)GRP78、CHOP和E-Cadherin蛋白表達(dá) 切片經(jīng)二甲苯脫蠟及乙醇梯度水化后,用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)(檸檬酸鈉,p H 值6.0),加一抗4 ℃過夜孵育。次日,室溫復(fù)溫30 min,以PBS洗片后加熒光二抗孵育1 h(此后實(shí)驗(yàn)步驟避光操作),以DIPA 染色10 min,用防淬滅熒光劑封片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并隨機(jī)采集圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示,多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組腎功能生化指標(biāo)比較

Sham 組血清肌酐和尿素氮濃度在正常范圍內(nèi),IR 組的濃度明顯高于Sham 組,IPO 組的濃度明顯低于IR 組(F=202.726、496.013,P＜0.05)。見表1。

表1 各組腎功能生化指標(biāo)的比較(n=12,±s)

表1 各組腎功能生化指標(biāo)的比較(n=12,±s)

各組血清肌酐和尿素氮比較,F=202.76、496.013,P＜0.05。

組別肌酐(c/μmol·L-1)尿素氮(ρ/mg·L-1)Sham組71.60± 8.41 114.0±11.4 IR 組445.60±49.39 530.0±36.1 IPO 組200.00±12.73 164.0±14.1

2.2 腎組織的形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下可見,Sham 組皮質(zhì)迷路深部的腎小體較大,腎小體內(nèi)的血管球呈現(xiàn)大量毛細(xì)血管切面,腎小囊包繞血管球外,中間有腎小囊腔相隔;近端小管切面多,管壁厚,管腔小而不規(guī)則,上皮細(xì)胞為立方形或錐形,細(xì)胞體較大、分界不清,腔面有刷狀緣,胞質(zhì)呈強(qiáng)嗜酸性,細(xì)胞核圓形,位于近基底部;遠(yuǎn)端小管切面少,管壁薄,管腔大而規(guī)則,上皮細(xì)胞為立方形,細(xì)胞體較小、分界清楚,游離面無刷狀緣,胞質(zhì)呈弱嗜酸性,細(xì)胞核圓形,位于中央。IR 組病理改變明顯,血管球和腎小囊變形,血管球內(nèi)毛細(xì)血管嚴(yán)重淤血,腎小囊腔變窄或消失;近端小管改變明顯,上皮變厚,管腔變窄,上皮細(xì)胞腫脹,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多空泡變性,腔面刷狀緣消失,小管腔內(nèi)出現(xiàn)壞死細(xì)胞碎片,間質(zhì)水腫,小血管淤血。IPO 組腎組織改變比IR 組明顯減輕,腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫,有少量小的空泡,腎小管管腔內(nèi)可見少量脫落的上皮細(xì)胞,管周可見少量淤血;血管球內(nèi)毛細(xì)血管輕度淤血,腎小囊腔部分狹窄,間質(zhì)充血。提示IPO 可以有效減輕缺血再灌注損傷后的腎損害。見圖1A。

Sham 組、IR 組和IPO 組腎小管損傷評(píng)分分別為(0.10±0.32)、(5.20±1.48)和(1.90±0.99)分(n=12)。IR 組腎小管損傷程度明顯高于Sham組,IPO 組明顯低于IR 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=61.439,P＜0.01)。

2.3 各組Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)比較

免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)結(jié)果顯示,Sham 組腎組織近端小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)可見極少陽性著色;IR 組近端小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)大量棕褐色著色,表明Cleaved Caspase3蛋白在IR 組呈強(qiáng)陽性表達(dá),提示Cleaved Caspase3 蛋白激活,細(xì)胞凋亡嚴(yán)重;IPO 組近端小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)有少量黃棕色著色,表明Cleaved Caspase3 蛋白在IPO 組陽性表達(dá)較低,提示Cleaved Caspase3蛋白部分激活,細(xì)胞凋亡減少。見圖1B。

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示,Sham 組、IR組和IPO 組Cleaved Caspase3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.12±0.01、1.27±0.11和0.32±0.02(n=12)。IR 組Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)量明顯高于Sham 組,IPO 組明顯低于IR 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=439.230,P＜0.01)。表明IPO 可以通過抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡來減輕腎損傷。見圖2。

圖1 各組腎組織的形態(tài)學(xué)觀察以及Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

圖2 各組大鼠腎組織Cleaved Caspase3 蛋白表達(dá)的Western blotting檢測(cè)

2.4 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

TUNEL染色陽性定位于近端小管上皮細(xì)胞胞核內(nèi)。Sham 組近端小管上皮細(xì)胞胞核內(nèi)有極少棕褐色顆粒,幾乎沒有陽性表達(dá);IR 組近端小管可見大量的上皮細(xì)胞胞核呈深棕色,陽性表達(dá)明顯多于Sham 組;IPO 組近端小管有少量的上皮細(xì)胞胞核染色陽性。見圖1C。

Sham 組、IR 組和IPO 組細(xì)胞凋亡率分別為0.07±0.01、0.50±0.09和0.15±0.01(n=12)。IR組細(xì)胞凋亡率明顯高于Sham 組,IPO 組明顯低于IR 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=92.818,P＜0.01)。表明IPO 通過減少腎小管細(xì)胞凋亡來保護(hù)腎臟免受缺血再灌注損傷。

2.5 免疫熒光檢測(cè)GRP78、CHOP 和E-Cadherin蛋白表達(dá)

Sham 組GRP78和CHOP蛋白熒光信號(hào)極弱,E-Cadherin蛋白熒光信號(hào)強(qiáng),尤其是近端小管上皮細(xì)胞E-Cadherin 蛋白表達(dá)較強(qiáng)。IR 組GRP78 和CHOP蛋白熒光信號(hào)強(qiáng),在近端小管上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá);E-Cadherin 蛋白熒光信號(hào)弱,在近端小管上皮細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度明顯低于Sham 組。IPO組的GRP78和CHOP蛋白熒光信號(hào)較IR 組弱,較Sham 組強(qiáng);E-Cadherin蛋白的熒光信號(hào)介于IR 組和Sham 組之間。另外,在IPO 組還觀察到少量遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞E-Cadherin 蛋白熒光信號(hào)較強(qiáng)。上述結(jié)果表明,IR 組近端小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激強(qiáng)度大且細(xì)胞凋亡數(shù)量多,而IPO 可以減輕腎小管細(xì)胞凋亡。見圖3、4。

圖3 免疫熒光檢測(cè)各組GRP78和E-Cadherin蛋白表達(dá)

圖4 免疫熒光檢測(cè)各組CHOP和E-Cadherin蛋白表達(dá)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腎缺血再灌注模型,并給予IPO,探討IPO 對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。為保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行?對(duì)各組腎功能指標(biāo)(血清肌酐和尿素氮)及腎組織形態(tài)的變化進(jìn)行了觀察,結(jié)果顯示,血清肌酐和尿素氮的濃度在各組的表達(dá)變化明顯,IR 組明顯高于Sham 組,IPO組明顯低于IR 組,提示大鼠再灌注損傷后腎小球?yàn)V過功能嚴(yán)重下降,IPO 可使濾過功能得以改善。光鏡下觀察和腎小管損傷評(píng)分分析顯示,相對(duì)于正常組織形態(tài)的Sham 組,IR 組近端小管上皮細(xì)胞腫脹明顯,出現(xiàn)大量空泡,并有大量上皮細(xì)胞脫落到管腔內(nèi),腎小管損傷嚴(yán)重;IPO 組近端小管上皮細(xì)胞腫脹輕微,空泡變性較少,腎小管損傷程度比IR 組輕。上述結(jié)果表明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建模成功,IPO 可以減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡,減輕腎組織損傷。

缺血再灌注損傷可致細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活,出現(xiàn)級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和凋亡的發(fā)生。Caspase家族是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶。其中Caspase12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過多蛋白積聚時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可激活Caspase12,活化Caspase12 可進(jìn)一步剪切Caspase3[16]。Caspase3為Caspase家族的核心成員,是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶,因此也被稱為“死亡蛋白酶”,是目前已知細(xì)胞凋亡最后執(zhí)行因子,在腫瘤、缺血再灌注損傷等許多疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[17]。Cleaved Caspase3是Caspase3活化過程中經(jīng)剪切產(chǎn)生的活性片段,其表達(dá)水平可以反映Caspase3的活性和細(xì)胞凋亡情況[18]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)Cleaved Caspase3蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)和Western blotting檢測(cè),并采用TUNEL 染色對(duì)細(xì)胞凋亡的情況進(jìn)行分析。3種技術(shù)檢測(cè)得到的結(jié)果一致。Sham 組近端小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)有極少Cleaved Caspase3蛋白陽性表達(dá),黃色顆粒極少,TUNEL染色陽性表達(dá)也非常弱,屬于正常生理性的細(xì)胞凋亡;IR 組大量近端小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中Cleaved Caspase3蛋白高表達(dá),棕褐色顆粒在近端小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)分布廣泛,TUNEL 染色呈強(qiáng)陽性表達(dá);IPO 組近端小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中有少量Cleaved Caspase3蛋白陽性表達(dá),褐色顆粒稀少,表達(dá)量介于Sham 組和IR 組之間,TUNEL 染色有少量陽性表達(dá)。表明腎臟缺血再灌注后發(fā)生損傷,Caspase3被激活,啟動(dòng)細(xì)胞凋亡,使近端小管上皮細(xì)胞大量凋亡;但I(xiàn)PO 抑制了Caspase3的激活,減弱了缺血再灌注后腎小管上皮細(xì)胞的凋亡,對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)因子GRP78 和CHOP 蛋白以及上皮標(biāo)志物ECadherin蛋白的表達(dá)。GRP78 是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的多功能鈣結(jié)合蛋白,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)維持、細(xì)胞信號(hào)控制、細(xì)胞生存等多方面起著關(guān)鍵作用[19]。在應(yīng)激過程中,作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶及鈣結(jié)合蛋白,過表達(dá)的GRP78可與錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的疏水性殘基端以及鈣離子結(jié)合,減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的積累并維持鈣離子平衡,恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能;此外,GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白,可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的促凋亡受體結(jié)合,抑制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而保護(hù)細(xì)胞,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[20]。CHOP 作為核轉(zhuǎn)錄因子可抑制抗凋亡基因Bcl-2表達(dá),促進(jìn)Bim、PUMA、TRB3等多種凋亡相關(guān)基因表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。E-Cadherin是鈣黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亞型的一種,主要分布于上皮組織中,對(duì)維持上皮細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性起著重要作用。作為上皮細(xì)胞間彼此連接的主要蛋白,E-Cadherin在正常細(xì)胞組織中保持高表達(dá),從而維持細(xì)胞之間的聚集功能;若其低表達(dá),則表明細(xì)胞的完整性受損[22]。本實(shí)驗(yàn)觀察到,Sham 組近端小管上皮細(xì)胞中幾乎沒有GRP78和CHOP蛋白熒光信號(hào),而E-Cadherin蛋白熒光信號(hào)較強(qiáng);IR 組近端小管上皮細(xì)胞中GRP78和CHOP蛋白熒光信號(hào)增強(qiáng),而E-Cadherin蛋白熒光信號(hào)減弱;IPO 組近端小管上皮細(xì)胞中GRP78、CHOP 和E-Cadherin蛋白的熒光信號(hào)強(qiáng)度介于Sham 組和IR 組之間。上述結(jié)果表明,缺血再灌注損傷后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生并處于持續(xù)應(yīng)激狀態(tài),細(xì)胞黏著連接受損嚴(yán)重;IPO 后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)減弱,上皮細(xì)胞間的連接增強(qiáng)。

綜上所述,缺血再灌注可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78、CHOP 在腎小管上皮細(xì)胞中高表達(dá),激活Cleaved Caspase3,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞大量凋亡,從而導(dǎo)致急性腎損傷,使腎功能受損;IPO 能夠抑制缺血再灌注所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子的表達(dá),阻止細(xì)胞凋亡,減輕腎損傷。IPO 作用的發(fā)揮與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激強(qiáng)度有關(guān),IPO 可通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),穩(wěn)定腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu),減少細(xì)胞凋亡,從而減輕因缺血再灌注損傷造成的腎小管上皮細(xì)胞功能障礙或喪失,減輕缺血再灌注后腎組織損傷。