新型化合物EndiandrinA對(duì)脊髓損傷潛在治療的研究

錢然

摘要：脊髓損傷是一種高發(fā)病率和高死亡率的疾病，而嗅鞘細(xì)胞是脊髓神經(jīng)修復(fù)治療的一種有前途的方法，并且利用天然產(chǎn)物可以改善嗅鞘細(xì)胞移植后的功能。我們檢測(cè)了化合物Endiandrin A （End A）在神經(jīng)碎片因子的存在下，對(duì)嗅鞘細(xì)胞的影響。我們發(fā)現(xiàn)，End A（10 mM）在存在神經(jīng)碎片因子的情況下，刺激了嗅鞘細(xì)胞的增殖和遷移，證明了End A能調(diào)節(jié)嗅膠質(zhì)細(xì)胞的行為，從而改善移植后的生存、增殖和遷移，從而有利于神經(jīng)修復(fù)。

關(guān)鍵詞：脊髓損傷;EndiandrinA;嗅鞘細(xì)胞

脊髓損傷（SCI）是一種高發(fā)病率和高死亡率的疾病，會(huì)導(dǎo)致不可逆的軸突損傷和神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致感覺(jué)和自主神經(jīng)功能的永久性缺陷，從而導(dǎo)致慢性癱瘓[1]。除了最初的損傷外，一系列嚴(yán)重的生理并發(fā)癥，包括腸、膀胱、呼吸和心臟的缺陷也是主要的威脅。。目前，脊髓損傷的治療仍然主要是保守性的，包括處理疼痛綜合征和感覺(jué)喪失并發(fā)癥的臨床護(hù)理。幸運(yùn)的是，神經(jīng)生物學(xué)研究的進(jìn)展，預(yù)示著新的關(guān)鍵型神經(jīng)保護(hù)和恢復(fù)療法，這些治療性干預(yù)可能會(huì)降低傷后護(hù)理的成本。

細(xì)胞治療是治療脊髓損傷的一種很有前途的策略，近年來(lái)，大量的動(dòng)物研究表明，嗅球嗅鞘細(xì)胞（OB-OECs）和固有層嗅鞘細(xì)胞（LP-OECs）在神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)的各個(gè)區(qū)域都能促進(jìn)軸突再生。這些發(fā)現(xiàn)包括：（1）肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)和再髓鞘化;（2）促進(jìn)中風(fēng)小鼠模型神經(jīng)可塑性的能力[2]和（3）神經(jīng)元碎片[3]。OECs須在移植后存活，因?yàn)镺ECs的增殖是至關(guān)重要的。

從早期開(kāi)始，富含類黃酮的食物就被認(rèn)為具有神經(jīng)保護(hù)作用，這種作用是由黃酮類化合物的抗氧化能力介導(dǎo)的。天然產(chǎn)物姜黃素通過(guò)增加神經(jīng)碎片因子的增殖、遷移和增強(qiáng)其吞噬功能而成為治療脊髓損傷的一種潛在選擇，利用天然產(chǎn)物可以改善OECs移植后的生存、遷移和增殖功能。

材料和方法：

1. 劃痕遷移試驗(yàn)

嗅鞘細(xì)胞的遷移通過(guò)劃痕試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定：在劃痕試驗(yàn)前，嗅鞘細(xì)胞以3x103的密度被置于96孔板上48小時(shí)，以達(dá)到70%的愈合度，之后用200μl的移液管尖端在直徑為1400至2000μm的無(wú)細(xì)胞區(qū)域劃出劃痕。用培養(yǎng)基清洗孔以去除細(xì)胞碎片，并在含有1%HEPES的DMEM/F12中培養(yǎng)12小時(shí)，在0到12小時(shí)之間，每間隔15分鐘拍攝劃痕。

2. 活細(xì)胞成像

所有的形態(tài)學(xué)分析、劃痕遷移實(shí)驗(yàn)和單細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)都是用生命細(xì)胞成像技術(shù)來(lái)進(jìn)行的。OECs在含有1%HEPES的DMEM/F12培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且圖像是在定制的37°C的溫室里，不含有二氧化碳的環(huán)境下自動(dòng)采集的。在Olympus IX81 Cell R顯微鏡上使用Hamamatsu數(shù)碼相機(jī)，每10分鐘獲得一次12到36小時(shí)的熒光和微分干涉對(duì)比圖像。為了分析活細(xì)胞成像動(dòng)態(tài)圖，活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的延時(shí)記錄作為圖像系列輸出，并使用ImageJ進(jìn)行手動(dòng)分析。

結(jié)果：

與對(duì)照組相比，神經(jīng)碎片因子分別在12、24、36和48小時(shí)時(shí)抑制了OEC的遷移（圖1），但是，End A在濃度為10μM時(shí)，可使傷口愈合率提高68%左右。有趣的是，在有神經(jīng)碎片因子存在的情況下，End A的遷移率能增加約55%（圖1）。此外，延時(shí)圖像表明，治療組劃痕間隙處的神經(jīng)碎片因子數(shù)量減少，提示End A可能會(huì)吞噬神經(jīng)碎片因子。

討論：

我們使用延時(shí)顯微鏡觀察了End A對(duì)OEC遷移的影響（圖2），細(xì)胞運(yùn)動(dòng)很明顯受到鄰近細(xì)胞存在的影響。因此，我們用劃痕試驗(yàn)檢測(cè)了單個(gè)嗅鞘細(xì)胞的遷移，使細(xì)胞遷移到無(wú)細(xì)胞劃痕中，圖像顯示，細(xì)胞并沒(méi)有沿著直線遷移到劃痕處，而是沿著一條曲折的路線遷移。為了分析活細(xì)胞成像圖像，我們將活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的延時(shí)記錄導(dǎo)出為一個(gè)圖像序列，并使用圖像J進(jìn)行手動(dòng)分析，以確定其空間面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)End A和神經(jīng)碎片因子聯(lián)合應(yīng)用顯著增加了細(xì)胞遷移到劃痕處的距離[4]。通過(guò)使用聯(lián)合應(yīng)用End A和神經(jīng)碎片因子，OECs的生存能力可以顯著提高，并可能促進(jìn)移植后OECs的遷移和增殖，對(duì)脊髓損傷有治療幫助。

參考文獻(xiàn)：

1. Leal-Filho， M.B.， Spinal cord injury： From inflammation to glial scar. Surg Neurol Int， 2011. 2： p. 112.

2. Katoh， H.， et al.， The dual origin of the peripheral olfactory system： placode and neural crest. Mol Brain， 2011. 4： p. 34.

3. He， B.R.， et al.， Phagocytic removal of neuronal debris by olfactory ensheathing cells enhances neuronal survival and neurite outgrowth via p38MAPK activity. Mol Neurobiol， 2014. 49（3）： p. 1501-12.

4. Kuntzsch， D.， et al.， The plant-derived glucocorticoid receptor agonist Endiandrin A acts as co-stimulator of colonic epithelial sodium channels （ENaC） via SGK-1 and MAPKs. PLoS One， 2012. 7（11）： p. e49426.