莫芮，陳松，蘇志桂*

(1.中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011)

心腦血管疾病是全球?qū)е滤劳鋈藬?shù)最多的一類疾病，而動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要誘因[1-2]。AS起因復(fù)雜，與高血脂、高血壓、吸煙和糖尿病等有關(guān)[3-4]。研究表明，膽固醇結(jié)晶是AS斑塊中的重要組成部分，是促進(jìn)AS病程進(jìn)展的關(guān)鍵因素，可造成血管內(nèi)皮功能紊亂，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加速斑塊壞死核心形成以及去穩(wěn)定化。在AS病程晚期，膽固醇結(jié)晶極易誘導(dǎo)斑塊破裂，從而造成急性心腦血管事件[5]。因此，清除膽固醇結(jié)晶或抑制膽固醇結(jié)晶的形成將有利于控制AS病程進(jìn)展和促進(jìn)AS歸轉(zhuǎn)，對(duì)降低AS相關(guān)心腦血管疾病的發(fā)生具有重要的臨床意義。并且，目前臨床采用的或在研的治療AS藥物主要為具有降血脂作用的藥物來(lái)間接控制AS病情的發(fā)展，其療效有限且具有橫紋肌溶解、腎衰竭、肝酶異常等藥物不良反應(yīng)[6]。由于AS斑塊內(nèi)膽固醇的蓄積以及膽固醇結(jié)晶的形成對(duì)AS的進(jìn)展具有顯著促進(jìn)作用，而直接針對(duì)AS斑塊內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)及清除膽固醇結(jié)晶的治療策略目前研究較少，是開發(fā)治療AS新藥物的熱點(diǎn)方向。為此，本文將綜述近年來(lái)斑塊中膽固醇結(jié)晶的形成過(guò)程和特點(diǎn)、膽固醇結(jié)晶促進(jìn)AS病程進(jìn)展機(jī)制、清除或抑制斑塊膽固醇結(jié)晶的策略及治療AS作用等方面的研究進(jìn)展，為開發(fā)以斑塊膽固醇結(jié)晶為靶點(diǎn)的抗AS藥物提供理論依據(jù)和參考。

1 斑塊膽固醇結(jié)晶的形成

1.1 胞內(nèi)膽固醇結(jié)晶形成 研究表明，在AS早期即可在內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)晶。一般認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞激活并增強(qiáng)攝取血液循環(huán)中的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生膽固醇結(jié)晶。LDL中的膽固醇以膽固醇酯的形式存在[5]，被血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取的LDL可轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)涵體/溶酶體并發(fā)生降解，其中膽固醇酯被降解為游離膽固醇[7]。游離膽固醇借助血管內(nèi)皮細(xì)胞中常見的多囊泡體實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。由于激活狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞大量攝取LDL，造成ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1蛋白(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子G1蛋白(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)介導(dǎo)的游離膽固醇外排功能缺陷，最終導(dǎo)致游離膽固醇的胞內(nèi)蓄積，并形成盤狀或針狀結(jié)構(gòu)的膽固醇結(jié)晶[7]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)膽固醇結(jié)晶的形成加劇血管內(nèi)皮功能紊亂，使血管通透性增加，從而有利于LDL滲透過(guò)血管內(nèi)皮而在動(dòng)脈壁內(nèi)蓄積。伴隨著血管內(nèi)皮持續(xù)受損和炎癥反應(yīng)的加劇，大量的免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等被招募至受損血管局部，并釋放活性氧及髓過(guò)氧化物等成分，將LDL氧化成為氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)[9-10]。Ox-LDL可被單核細(xì)胞分化而成的巨噬細(xì)胞識(shí)別和吞噬，而巨噬細(xì)胞吞噬大量ox-LDL后將轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞[11]。進(jìn)入巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞中的ox-LDL在晚期內(nèi)涵體中降解，其中膽固醇酯被水解為游離膽固醇[12]。目前報(bào)道，游離膽固醇在巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑包括：①經(jīng)循環(huán)內(nèi)涵體途徑轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜儲(chǔ)存；②經(jīng)晚期內(nèi)涵體/溶酶體中尼曼-匹克C1型蛋白(Niemann-Pick type C1，NPC1)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上的ABCA1和ABCG1并主動(dòng)外排出細(xì)胞，經(jīng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制輸送回肝臟代謝；③經(jīng)NPC1轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重新脂化并在脂質(zhì)微粒中儲(chǔ)存；④轉(zhuǎn)移到線粒體中經(jīng)Cyp27A1酶作用下形成27-羥基膽固醇再通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散的形式釋放到細(xì)胞外，經(jīng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制輸送回肝臟代謝[13-14]。在AS持續(xù)病變狀態(tài)下，由于游離膽固醇的生成量遠(yuǎn)超過(guò)了巨噬細(xì)胞或泡沫細(xì)胞自身的處置能力，剩余的游離膽固醇隨晚期內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體蓄積，形成膽固醇結(jié)晶[15-16]。

1.2 胞外膽固醇結(jié)晶形成 血管內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生的膽固醇結(jié)晶會(huì)被分泌到內(nèi)皮下的基底側(cè)[7]，并且蓄積了大量膽固醇酯和膽固醇結(jié)晶的泡沫細(xì)胞在死亡后也會(huì)將這些脂質(zhì)釋放到胞外區(qū)域，從而導(dǎo)致胞外膽固醇結(jié)晶增多[5]。此外，從受損血管中滲透至斑塊的紅細(xì)胞細(xì)胞膜中的膽固醇，也會(huì)導(dǎo)致胞外膽固醇結(jié)晶的形成[17]。除上述提到的原因外，伴隨AS進(jìn)展斑塊中的高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)逆轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇功能發(fā)生明顯障礙，因而不能及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞分泌的游離膽固醇，也是促進(jìn)胞外形成膽固醇結(jié)晶的關(guān)鍵因素[18]。當(dāng)斑塊局部微環(huán)境的物理化學(xué)條件滿足結(jié)晶生長(zhǎng)要求時(shí)，被分泌到胞外的膽固醇結(jié)晶會(huì)與血管內(nèi)皮下的其他脂質(zhì)晶體以及游離脂質(zhì)液滴融合進(jìn)而生長(zhǎng)成為大的膽固醇結(jié)晶[7]。研究表明，在AS晚期斑塊中的膽固醇結(jié)晶以膽固醇一水合物結(jié)晶為主要晶型[19-20]，膽固醇分子的羥基和水分子間形成二維氫鍵網(wǎng)絡(luò)，并呈現(xiàn)厚的菱形結(jié)構(gòu)和薄平的盤狀結(jié)構(gòu)[21]。

2 膽固醇結(jié)晶促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病程進(jìn)展

膽固醇結(jié)晶伴隨AS發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程[15，22]。在AS早期，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放至基底側(cè)的膽固醇結(jié)晶不僅會(huì)嚴(yán)重?fù)p害血管內(nèi)皮屏障的完整性，還可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生[7，23]，最終促進(jìn)LDL以及免疫細(xì)胞的跨血管內(nèi)皮遷移并在血管內(nèi)皮下蓄積，為AS病程進(jìn)展提供物質(zhì)基質(zhì)。此外，Duewell等[15，24]報(bào)道斑塊中的膽固醇結(jié)晶還可作為第二信號(hào)分子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NOD樣受體蛋白3(nod-like receptor related protein，NLRP3)炎癥小體，并使caspase-1活化，增加促炎因子白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的分泌[21，25]。IL-1β被認(rèn)為具有極強(qiáng)的促AS進(jìn)展作用，與AS的惡化程度呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，斑塊中的膽固醇結(jié)晶能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)，而NETs可激活巨噬細(xì)胞使其產(chǎn)生IL-1β前體(pro-IL-1β)，從而促進(jìn)IL-1β的釋放[26]。此外，NET形成的同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，從而改變斑塊局部微環(huán)境pH值，進(jìn)一步促進(jìn)膽固醇結(jié)晶生長(zhǎng)[27]。斑塊大量膽固醇結(jié)晶的出現(xiàn)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞凋亡和壞死，由于斑塊中清除凋亡和壞死細(xì)胞的胞葬作用僅為正常水平的1/20[28-29]，因而無(wú)法及時(shí)清除的凋亡或壞死細(xì)胞將加速斑塊壞死核心形成[30]。在壞死核心中，膽固醇結(jié)晶的生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致體積膨脹從而拉伸斑塊纖維帽，使纖維帽變薄而促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊形成[5]。臨床病理研究表明，以針狀結(jié)晶形式存在于斑塊中的膽固醇結(jié)晶更易于刺穿覆蓋于斑塊表面的纖維帽[31-32]，從而導(dǎo)致斑塊破裂和血栓形成，出現(xiàn)急性心腦血管疾病[21,33]?；谀懝檀冀Y(jié)晶在AS斑塊形成及心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中所起的關(guān)鍵作用，以膽固醇結(jié)晶作為AS治療的靶點(diǎn)將具有重要的臨床意義。

3 清除膽固醇結(jié)晶治療動(dòng)脈粥樣硬化的策略

3.1 增溶策略清除膽固醇結(jié)晶

3.1.1 熊去氧膽酸 熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)是一種天然親水性膽汁酸，具有良好的耐受性且?guī)缀鯚o(wú)毒副作用。研究表明，口服給予ApoE-/-小鼠UDCA可以促進(jìn)膽固醇外排并減少AS斑塊中的膽固醇結(jié)晶，從而抑制AS病程進(jìn)展。UDCA介導(dǎo)的AS保護(hù)作用的潛在機(jī)制一方面是通過(guò)增溶膽固醇結(jié)晶從而提高膽固醇代謝轉(zhuǎn)化，同時(shí)，胞內(nèi)游離膽固醇的增加可上調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá)[34]，促進(jìn)膽固醇外排。另一方面，UDCA增溶膽固醇結(jié)晶后也可以顯著抑制由膽固醇結(jié)晶誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活，從而減少IL-1β釋放，抑制AS炎癥發(fā)展[35]。Abendan等[36]對(duì)UDCA增溶膽固醇結(jié)晶的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，UDCA增溶膽固醇結(jié)晶與其在水中形成膠束有關(guān)，與膽固醇結(jié)晶發(fā)生作用時(shí)，UDCA膠束對(duì)膽固醇結(jié)晶的溶解從最頂層開始并逐層溶解。

3.1.2 β-環(huán)糊精及其衍生物 環(huán)糊精是一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，目前最常用的環(huán)糊精是由7個(gè)葡萄糖分子組成的β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)[37]。β-CD具有外周親水和內(nèi)腔疏水的特征，因此在水性介質(zhì)中β-CD與疏水性分子可通過(guò)主-客體相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)疏水性分子的增溶[38]。β-CD通過(guò)這種增溶作用可以從細(xì)胞膜中提取膽固醇，當(dāng)β-CD濃度足夠高時(shí)會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞發(fā)生溶血[37]。為了增加水溶性以及降低β-CD的溶血副作用，目前已有多種β-CD衍生物被開發(fā)出來(lái)，其中羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)和磺丁基-β-環(huán)糊精(sulfobutyl ether-β-cyclodextrin，SBE-β-CD)已被FDA批準(zhǔn)用于注射給藥。

最近研究表明，皮下注射給予載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠HP-β-CD可顯著縮小AS斑塊處的膽固醇結(jié)晶面積，從而有效抑制AS的發(fā)生發(fā)展。HP-β-CD發(fā)揮抗AS作用的機(jī)制研究表明，HP-β-CD可與膽固醇結(jié)晶表面的膽固醇分子發(fā)生主-客體相互作用，形成水溶性包合物，從而把膽固醇分子從晶格中萃取出來(lái)。HP-β-CD增溶的膽固醇可經(jīng)乙酰輔酶A(acetyl-coenzyme A，CoA)乙酰轉(zhuǎn)移酶催化后轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，儲(chǔ)存于脂質(zhì)滴中，從而防止膽固醇向結(jié)晶態(tài)的相轉(zhuǎn)變[39]。此外，HP-β-CD增溶的膽固醇也可以轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體中被Cyp27A1氧化成水溶性的27-羥基膽固醇，并通過(guò)自由擴(kuò)散的方式跨越細(xì)胞膜進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)，27-羥基膽固醇具有調(diào)節(jié)肝臟X受體(liver X receptor，LXR)轉(zhuǎn)錄活性的功能，從而調(diào)控Abca1和Abcg1基因，促進(jìn)膽固醇外排及逆轉(zhuǎn)運(yùn)[2，40]。并且，HP-β-CD增溶的膽固醇也可以直接被機(jī)體經(jīng)尿或糞便排泄出體外[39]。已有研究報(bào)道，大劑量口服給予HP-β-CD已用于治療因NPC-1基因缺陷而導(dǎo)致的脂質(zhì)在肝、脾及腦部沉積所引起的尼曼-匹克C型病[41]，但是HP-β-CD是否可以用于臨床治療AS仍有待進(jìn)一步的研究。

3.2 抑制膽固醇結(jié)晶形成策略

3.2.1 他汀類藥物 他汀類藥物通過(guò)抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，來(lái)減緩膽固醇的產(chǎn)生，并能夠促進(jìn)受體介導(dǎo)LDL從血漿中移除，發(fā)揮降血脂抗AS作用[42]。近年來(lái)的研究表明，他汀類藥物除了降血脂功能外，還可通過(guò)抑制斑塊炎癥、促進(jìn)斑塊局部胞葬作用和抑制斑塊膽固醇結(jié)晶形成而發(fā)揮治療AS作用[43-44]。他汀類藥物抑制斑塊膽固醇結(jié)晶形成有兩種機(jī)制，一方面他汀類藥物可直接抑制膽固醇結(jié)晶生長(zhǎng)，如阿托伐他汀的代謝物可以通過(guò)抗氧化機(jī)制抑制細(xì)胞膜上膽固醇結(jié)晶的形成[45]。另一方面，他汀類藥物還能夠改變膽固醇的結(jié)晶方式，從而降低膽固醇結(jié)晶時(shí)的體積膨脹峰值，并且將膽固醇結(jié)晶由尖銳的、菱形的晶體形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殁g化的、破碎的晶體形態(tài)。上述作用的發(fā)揮主要是因?yàn)樗☆愃幬锬軌蛲ㄟ^(guò)與膽固醇分子發(fā)生疏水相互作用，從而干擾膽固醇結(jié)晶的晶格形成。此外，體外研究還顯示，辛伐他汀、阿托伐他汀和普伐他汀可以顯著溶解人離體冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和股動(dòng)脈斑塊中的膽固醇結(jié)晶，且他汀類藥物溶解膽固醇結(jié)晶的機(jī)制類似于乙醇溶解結(jié)晶的作用過(guò)程[44]。

3.2.2 環(huán)磷酸腺苷增強(qiáng)劑 環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是一種“屏障穩(wěn)定劑”，可以降低血管內(nèi)皮滲透性[46]。毛喉素(Forskolin)和咯利普蘭(Rolipram)是cAMP增強(qiáng)劑。Forskolin通過(guò)直接結(jié)合和激活腺苷酸環(huán)化酶亞型來(lái)增加cAMP的合成[47]。Rolipram通過(guò)抑制磷酸二酯酶PDE4家族來(lái)抑制cAMP的降解[48]。Baumer等[7]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給予Forskolin和Rolipram能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中膽固醇結(jié)晶形成和降低膽固醇酯的含量[]。體內(nèi)研究表明，在AS早期，F(xiàn)orskolin和Rolipram能夠顯著抑制主動(dòng)脈竇斑塊中的膽固醇結(jié)晶生成，從而恢復(fù)血管內(nèi)皮健康狀態(tài)。然而，盡管Forskolin和Rolipram具有增強(qiáng)血管內(nèi)皮屏障的作用，但二者減少斑塊膽固醇結(jié)晶的機(jī)制還有待研究[49-50]。

3.3 納米藥物遞送系統(tǒng)清除膽固醇結(jié)晶 基于納米藥物遞送系統(tǒng)高載藥量、高穩(wěn)定性、可控藥物釋放及AS斑塊特異靶向的功能特點(diǎn)，目前納米藥物遞送系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于AS靶向治療研究。針對(duì)斑塊中富含膽固醇結(jié)晶的特點(diǎn)，Li等[51]將β-CD修飾在超順磁鐵納米粒表面，旨在利用β-CD與膽固醇結(jié)晶間的親和力實(shí)現(xiàn)靶向檢測(cè)AS中膽固醇結(jié)晶的目的。為了清除泡沫細(xì)胞中的膽固醇，Ravishankar等[52]利用銅催化點(diǎn)擊反應(yīng)將鐵蛋白和β-CD連接起來(lái)獲得鐵蛋白納米籠，在鐵離子存在下鐵蛋白納米籠可自組裝形成納米聚集體。研究表明，該納米聚集體利用鐵蛋白和泡沫細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相互作用可有效遞送至泡沫細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)β-CD和細(xì)胞內(nèi)膽固醇分子間的主-客體作用實(shí)現(xiàn)增溶膽固醇，最終顯著降低泡沫細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量，顯示出抗AS潛力。AS斑塊中富含膽固醇和巨噬細(xì)胞，二者均為引發(fā)炎癥的關(guān)鍵因素。為此，Kim等[53]利用甲基β-CD與辛伐他汀之間的主-客體作用制得辛伐他汀/甲基β-CD包合物，并以磷脂為外殼將上述包合物作為內(nèi)核構(gòu)建納米復(fù)合物(CSNP)。研究表明，CSNP可利用斑塊局部血管內(nèi)皮滲透性增加的特點(diǎn)靶向富集于AS斑塊，同時(shí)由于斑塊內(nèi)膽固醇分子與甲基β-CD的親和力要遠(yuǎn)高于辛伐他汀與甲基β-CD的親和力，因此膽固醇分子將辛伐他汀從甲基β-CD的空腔中置換下來(lái)，實(shí)現(xiàn)釋放辛伐他汀和增溶膽固醇分子的目的，最終顯示出減少AS斑塊面積，降低斑塊內(nèi)膽固醇和巨噬細(xì)胞含量的作用結(jié)果。盡管上述的研究中均無(wú)納米藥物遞送系統(tǒng)直接清除膽固醇結(jié)晶的相關(guān)內(nèi)容，但是斑塊內(nèi)實(shí)現(xiàn)直接遞送β-CD意味著可發(fā)揮增溶膽固醇結(jié)晶的功能，因而可推測(cè)具有清除斑塊內(nèi)膽固醇結(jié)晶的作用。

4 總結(jié)

綜上所述，動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的關(guān)鍵誘因，而膽固醇結(jié)晶對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展具有顯著的促進(jìn)作用。合理的清除斑塊內(nèi)膽固醇結(jié)晶或抑制膽固醇結(jié)晶的形成均有利于抑制動(dòng)脈粥樣硬化病程進(jìn)展。盡管已有研究表明，利用增溶膽固醇結(jié)晶策略、抑制膽固醇結(jié)晶生長(zhǎng)策略以及納米藥物遞送系統(tǒng)等均在一定程度上減少斑塊中的膽固醇結(jié)晶或膽固醇含量，但是仍需要進(jìn)行深入的研究以闡明體內(nèi)增溶膽固醇結(jié)晶或抑制膽固醇結(jié)晶生長(zhǎng)的作用過(guò)程及機(jī)制、機(jī)體處置游離膽固醇的過(guò)程和機(jī)制。并且，針對(duì)上述的清除膽固醇結(jié)晶策略還需開展體內(nèi)安全性的研究，從而為基于膽固醇結(jié)晶為靶點(diǎn)的抗動(dòng)脈粥樣硬化新藥的發(fā)現(xiàn)提供充分理論依據(jù)和參考。