陳星伊，王旭，周陶，楊勇

(中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院，江蘇 南京 211198)

自“Warburg效應(yīng)”被提出后[1]，腫瘤代謝研究的加速持續(xù)改變著研究者對腫瘤學(xué)的理解和認(rèn)知，多個(gè)最新的研究揭示了氨基酸在腫瘤代謝中的重要作用。氨基酸具有氧化還原平衡、能量調(diào)節(jié)、生物合成支持和維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的基本功能，其廣泛的功能使得氨基酸代謝在腫瘤研究中倍受歡迎。在腫瘤發(fā)展過程中，由于其異常增殖，腫瘤細(xì)胞需要大量營養(yǎng)物質(zhì)來維持生長所需，同時(shí)還需要逃避來自宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，這些過程腫瘤細(xì)胞都是以獨(dú)特的代謝方式實(shí)現(xiàn)的。T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷相似的代謝重編程，激活的T細(xì)胞同樣依賴于持續(xù)的營養(yǎng)供應(yīng)，以確保其正確分化和正常功能維持[2]。本綜述主要討論了氨基酸代謝在腫瘤微環(huán)境中的重要性及對腫瘤免疫的影響，并論述其未來成為腫瘤免疫治療方向的潛力。

1 腫瘤微環(huán)境中的精氨酸代謝和色氨酸代謝

1.1 精氨酸代謝與抗腫瘤免疫 精氨酸(arginine，Arg)具有重要的營養(yǎng)和生理意義，是蛋白質(zhì)/尿素/肌酸/谷氨酸/一氧化氮和胍丁胺等信號分子的重要前體物質(zhì)。精氨琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthase,ASS1)和精氨琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ASL)將瓜氨酸催化合成精氨酸，精氨酸由精氨酸酶1(arginase，ARG1)分解為鳥氨酸和尿素，鳥氨酸通過精氨酸酶(arginase，ARG)和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ornithine transcarbamylase,OTC)轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，并使其能在線粒體中再循環(huán)。

精氨酸雖然是一種非必需氨基酸，但在特定生理?xiàng)l件或疾病狀態(tài)下非常重要[3]。精氨酸缺乏導(dǎo)致T細(xì)胞的蛋白質(zhì)生物合成介導(dǎo)的細(xì)胞耗盡，從而導(dǎo)致T細(xì)胞失去其抗腫瘤活性[4]。精氨酸激活基因表達(dá)程序，增強(qiáng)T細(xì)胞的生物能量，導(dǎo)致像T細(xì)胞狀態(tài)的中央記憶和提高抗腫瘤活性[5]。許多腫瘤生長依賴外源性精氨酸，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈SS1表達(dá)[6]。Kobayashi等[7]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者ASS1缺乏會導(dǎo)致腫瘤肺轉(zhuǎn)移，通常與侵襲性表型有關(guān)，患者預(yù)后較差。這種ASS1缺乏導(dǎo)致腫瘤侵襲性變強(qiáng)的現(xiàn)象，可以通過腫瘤需要更有效地利用腫瘤微環(huán)境中的外源性精氨酸來解釋。哺乳動物中ARG包括ARG1和ARG2兩種，在許多腫瘤中，例如乳腺癌，胃癌，前列腺癌，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，腫瘤微環(huán)境中的整體ARG活性增強(qiáng)[8]。ARG1活性增強(qiáng)會導(dǎo)致腫瘤相關(guān)髓細(xì)胞(tumor associated myeloid cells,TAMCs)的擴(kuò)增，TAMCs因響應(yīng)腫瘤衍生物因子和代謝物，包括白介素4(interleukin，IL-4)、IL-13、IL-6、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)、乳酸和環(huán)狀單磷酸腺苷等，以及低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)相關(guān)的分子通路，從而反饋性上調(diào)ARG1[9]。ARG1水解精氨酸得到的產(chǎn)物為腫瘤細(xì)胞提供了多胺合成前體，促進(jìn)腫瘤生長并降低了免疫細(xì)胞對精氨酸的利用率[10]。TAMCs還會觸發(fā)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)將精氨酸氧化生成NO，NO可以抑制主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ,MHC-Ⅱ)表達(dá)，從而抑制T細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，抑制T細(xì)胞功能[11]。因腫瘤微環(huán)境中高水平的ARG1導(dǎo)致的低濃度精氨酸還會促進(jìn)NOS解偶聯(lián)并產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，NO與O2-在病理?xiàng)l件下會結(jié)合并產(chǎn)生各種活性氮(reactive nitrogen species，RNS)，它會破壞微環(huán)境中T細(xì)胞活性[12]。綜上所述，TAMCs在腫瘤微環(huán)境中能夠靶向精氨酸代謝，幫助腫瘤逃避免疫攻擊，從而抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。

雖然針對精氨酸代謝的免疫治療在仍處于起步階段，體外和體內(nèi)的精氨酸代謝研究使得精氨酸剝奪療法發(fā)展迅速。目前靶向精氨酸代謝的藥物有ADI-PEG20[13]，和人精氨酸酶(rhArg1-PEG)，前者已在腫瘤治療中展現(xiàn)出了治療潛力[14]。

1.2 腫瘤微環(huán)境中的色氨酸 色氨酸(tryptophan，Trp)是另一種與免疫耐受調(diào)節(jié)和抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)的氨基酸。它的分解代謝包括兩步。吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(indoleamine 2,3-dioxygenase-1，IDO1)和色氨酸2,3-雙加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase，TDO)催化L-色氨酸分解代謝的第一步，沿著犬尿氨酸途徑，產(chǎn)生一系列分子，統(tǒng)稱為犬尿氨酸(kynurenine,Kyns)。已有研究表明，IDO在多種腫瘤中過表達(dá)[15-16]。IDO包括IDO1和IDO2兩種亞型，IDO2近年才被克隆出來[17]。所以一直以來針對IDO1的研究更為廣泛。

IDO由免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共同表達(dá)。正常情況下，由于色氨酸易穿過質(zhì)膜，表達(dá)IDO的樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)會消耗胞外色氨酸，限制色氨酸對周邊T細(xì)胞的供應(yīng)，從而阻礙T細(xì)胞的活化及增殖[10]，這在自身免疫和抗炎反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；有研究報(bào)道IDO+的DCs可以抑制同種異體抑制排斥反應(yīng)，延長小腸移植小鼠的存活時(shí)間[18]。IDO抑制劑處理的ApoE-/-小鼠血管炎癥增強(qiáng)[19]。而在腫瘤微環(huán)境中，IDO限制了T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的響應(yīng)，Uyttenhove等[20]通過小鼠肥大瘤細(xì)胞P815模型證明，注射IDO陰性P815細(xì)胞的小鼠多數(shù)不會發(fā)生腫瘤，IDO陽性P815組的小鼠則發(fā)展出腫瘤并最終死亡。子宮內(nèi)膜癌組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也表明，高IDO水平與低水平CD3+、CD8+和CD57+免疫細(xì)胞存在顯著相關(guān)性。這些都表明，腫瘤微環(huán)境中的效應(yīng)T細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞更易受到IDO的影響[10]。

在腫瘤微環(huán)境中，由IDO導(dǎo)致的低濃度色氨酸具有抑制mTOR(mammalian target of rapamycin)激酶途徑和激活GCN2(general control nonderepressible 2)激酶途徑的雙重作用[21]。GCN2會影響IDO+細(xì)胞和其鄰近T細(xì)胞的基因表達(dá)[22-23]。色氨酸剝奪還會下調(diào)T細(xì)胞受體復(fù)合物ζ鏈和c-Myc的表達(dá)水平，從而抑制T細(xì)胞的增殖[24]。除了這種直接的T細(xì)胞抑制方式，IDO還可以通過激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell，Treg)產(chǎn)生有效的間接免疫抑制。暴露于IDO的幼稚型CD4+T細(xì)胞傾向于成為Foxp3+誘導(dǎo)的Tregs[25]。IDO還可以直接激活成熟的、預(yù)先存在的Tregs，顯著增強(qiáng)抑制功能[26]。IDO和TDO產(chǎn)生的Kyns是芳烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)的內(nèi)源性激動劑，AhR是T細(xì)胞和DCs中一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。Kyns誘導(dǎo)的AhR激活促進(jìn)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Tregs，并上調(diào)DCs中IDO1的表達(dá)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用并阻斷抗腫瘤免疫[27]。

目前，IDO抑制劑已廣泛應(yīng)用于臨床前和臨床試驗(yàn)。目前靶向色氨酸的藥物包括：IDO抑制劑D1-甲基-色氨酸(D-1-methyl-tryptophan,D-1MT)和TDO抑制劑(E)-6-氟-3[2-(1H-四唑-5-基)乙烯基]-1H-吲哚(LM10)。此外還有聯(lián)合用藥靶向IDO的治療方法[28]。

1.3 TGF-β、精氨酸與色氨酸——免疫抑制三聯(lián)體 如前所述，IDO由DCs和腫瘤細(xì)胞共表達(dá)。在人體中，ARG1主要表達(dá)于肝臟、紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞三級顆粒中，其在細(xì)胞外釋放后具有酶活性[29]。在小鼠中，ARG1也存在于其他免疫細(xì)胞中，如小鼠巨噬細(xì)胞和DCs[30]。盡管ARG1和IDO1在髓細(xì)胞中的主要誘導(dǎo)物不同，分別是IL-4和IFN-γ，此外TGF-β也可以影響二者的活性。TGF-β在DCs中同時(shí)誘導(dǎo)ARG1和IDO1，而ARG1上調(diào)速度比IDO1快。ARG1的代謝產(chǎn)物L(fēng)-鳥氨酸是鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)產(chǎn)生多胺的底物，多胺在腫瘤中可通過激活MAPK和Src激酶促進(jìn)酶的磷酸化和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。故ARG1升高導(dǎo)致的L-鳥氨酸水平升高有利于IDO磷酸化及長期的免疫調(diào)節(jié)信號的激活[8]。由此可見TGF-β與ARG1和IDO1建立的免疫抑制網(wǎng)絡(luò)在腫瘤免疫方面非常重要，同時(shí)抑制ARG1和IDO1活性或TGF-β信號傳導(dǎo)可能是腫瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

2 谷氨酰胺代謝與腫瘤的免疫逃逸

谷氨酰胺(glutamine，Gln)是腫瘤細(xì)胞消耗最多的氨基酸[31]。谷氨酰胺是一種非必需氨基酸，但增殖細(xì)胞對谷氨酰胺具有成癮性，這表明谷氨酰胺是增殖細(xì)胞的條件必需氨基酸。谷氨酰胺可以用于核苷酸和脂質(zhì)生物合成，也可以用于合成谷氨酸，谷氨酸可以轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸的中間代謝物，將谷胱甘肽還原為還原形式，抑制氧化應(yīng)激，并維持線粒體膜完整性，從而有助于增殖細(xì)胞的存活。有研究表明谷氨酰胺分解代謝在腫瘤細(xì)胞中是增加的[32]。

Fu等[33]評估了細(xì)胞外谷氨酰胺耗竭對免疫微環(huán)境的影響。高谷氨酰胺水平腫瘤的CD8+T細(xì)胞中的干擾素γ(interferon-γ，IFNγ)、人顆粒酶B(human granzyme B，GZMB)、穿孔蛋白(perforin，PRF1)表達(dá)較低。使用敲低膜定位的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)載體家族1成員5(solute carrier family 1 member 5，SLC1A5)或者谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺的限速酶谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)的腎癌細(xì)胞建立小鼠腎癌模型，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺，谷氨酸和α-酮戊二酸的濃度降低，表明腫瘤細(xì)胞中的谷氨酰胺分解減少。同時(shí)，SLC1A5和GLS的敲低都增強(qiáng)了腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞毒性；這些結(jié)果證實(shí)腫瘤細(xì)胞固有的谷氨酰胺代謝抑制了腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。而產(chǎn)生這種細(xì)胞毒性抑制的機(jī)制是高谷氨酰胺代謝的腫瘤細(xì)胞具有更高水平的Treg，GLS和SLC1A5的下調(diào)使谷氨酰胺減少，導(dǎo)致Treg增殖減少及活性下降。

T淋巴細(xì)胞需要中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(sodium-coupled neutral amino acid transporter2，SNAT2)攝取谷氨酰胺，SNAT2缺乏則T淋巴細(xì)胞無法分化為輔助性T淋巴細(xì)胞1(T helper 1,Th1)和輔助性T淋巴細(xì)胞17(T helper 17,Th17)[34]。當(dāng)缺乏谷氨酰胺時(shí),有利于T淋巴細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化的微環(huán)境不能使CD4+T分化為Th1細(xì)胞，而是分化為Foxp3+Treg細(xì)胞。加入α-酮戊二酸或使用特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet進(jìn)行誘導(dǎo)，則可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象[35]。

6-重氮5-氧代-1-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-l-norleucine，DON)是一種谷氨酰胺拮抗劑，能夠全面抑制谷氨酰胺代謝，之前已在多種腫瘤類型中開展臨床試驗(yàn)評估其有效性，但由于其嚴(yán)重的藥物毒性而被放棄[36]。Robert等[37]設(shè)計(jì)了一系列包括JHU083在內(nèi)DON的前藥小分子來探究腫瘤中谷氨酰胺代謝是否可以成為免疫檢查點(diǎn)。通過13C-葡萄糖示蹤技術(shù)，他們發(fā)現(xiàn)阻斷谷氨酰胺代謝后葡萄糖代謝受到抑制，同時(shí)可以改善腫瘤微環(huán)境缺氧的狀況。這表明阻斷谷氨酰胺代謝可以嚴(yán)重破壞腫瘤細(xì)胞的整體代謝，并對腫瘤微環(huán)境內(nèi)的營養(yǎng)環(huán)境產(chǎn)生顯著影響。在采用過繼性T細(xì)胞療法(adoptive T-cell therapy,ACT)之前使用JHU083對B16黑色素瘤(B16OVA)小鼠進(jìn)行代謝治療，處理過的小鼠顯示出腫瘤控制和存活率的改善，這表明谷氨酰胺阻斷可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以增強(qiáng)T細(xì)胞療法的療效。對小鼠腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，在JHU083處理的小鼠中CD8+TILs對腫瘤內(nèi)細(xì)胞死亡的敏感性較低，之前有研究猜想，CD8+T細(xì)胞功能障礙和腫瘤免疫逃逸的機(jī)制是腫瘤微環(huán)境中腫瘤特異性T細(xì)胞的凋亡[38]，上述結(jié)果與此猜想一致。以上研究結(jié)果表明阻斷谷氨酰胺可以誘導(dǎo)不同的代謝程序從而改善腫瘤的免疫逃逸，谷氨酰胺代謝是腫瘤免疫治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

3 新興氨基酸代謝與腫瘤免疫的研究

3.1 半胱氨酸——T細(xì)胞增殖的必需氨基酸 哺乳動物細(xì)胞可以合成蛋白質(zhì)需要半胱氨酸(cysteine，Cys)，大多數(shù)細(xì)胞可通過半胱氨酸酶將胞內(nèi)蛋氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，或者通過半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體Xc-將胞外的胱氨酸運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞，再將胱氨酸還原為半胱氨酸。由于T細(xì)胞缺乏半胱氨酸酶，其Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體缺乏XCT鏈，T細(xì)胞只能依賴于其他細(xì)胞產(chǎn)生的半胱氨酸。半胱氨酸由巨噬細(xì)胞和DCs等抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APCs)APCs提供，由T細(xì)胞的質(zhì)膜ASC中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)輸至胞內(nèi)，并參與T細(xì)胞完成抗原遞呈和活化的過程。有研究表明，由于MDSCs表達(dá)Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)體，但不表達(dá)ASC中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，因此它們能夠從環(huán)境中獲得胱氨酸，但不能輸出半胱氨酸，通過限制細(xì)胞外半胱氨酸，腫瘤特異性T細(xì)胞不被激活，因此抗腫瘤免疫被抑制[39-40]。然而仍需更多研究進(jìn)一步闡明胱氨酸缺乏在免疫抑制中的作用。

3.2 苯丙氨酸代謝引起的免疫抑制 苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)代謝也可參與免疫應(yīng)答。白細(xì)胞介素4誘導(dǎo)基因1(interleukin four induced gene1，IL-4I1)最早是在小鼠中發(fā)現(xiàn)的，后期在人類B細(xì)胞中也被鑒定出來。它是一種分泌型l-苯丙氨酸氧化酶，通過苯丙氨酸的氧化脫氨作用產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)和苯丙酮酸。目前，B細(xì)胞中唯一已知可誘導(dǎo)IL-4I1的細(xì)胞因子是IL-4；IL-4通過刺激IL-4/IL-13受體進(jìn)而使轉(zhuǎn)錄因子STAT6磷酸化而發(fā)揮作用[41]。人、小鼠IL-4I1可通過APCs和小鼠MDSCs表達(dá)，IL-4I1在各種類型腫瘤中的巨噬細(xì)胞中都能被檢測到[42]。有研究表明，IL-4I1在腫瘤誘導(dǎo)的小鼠MDSCs中的mRNA表達(dá)增加，表明IL-4I1可能參與選擇性激活異源髓細(xì)胞對T細(xì)胞活化的負(fù)反饋調(diào)節(jié)過程[41]。Boulland等[43]還提出IL-4I1可通過H2O2的產(chǎn)生，抑制CD3ζ鏈的表達(dá)和T細(xì)胞的增殖，從而作為免疫調(diào)節(jié)因子。這些研究表明，IL-4I1和苯丙氨酸代謝可能是MDSCs的重要抑制機(jī)制。

3.3 亮氨酸通過mTOR通路對腫瘤免疫的影響 支鏈氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)包括亮氨酸(leucine，Leu)，異亮氨酸和纈氨酸，約占健康個(gè)體必需氨基酸的40%。其中，亮氨酸不僅是生物合成必需的組分之一，還是調(diào)節(jié)mTOR途徑的信號[44]，是公認(rèn)的mTOR信號激活劑[45]。mTOR通路在許多類型的腫瘤中均被上調(diào)，并且以mTOR為靶點(diǎn)的腫瘤治療已成為臨床研究的一部分[46]。免疫細(xì)胞對mTOR的調(diào)節(jié)特別敏感，因?yàn)閙TOR途徑會影響免疫細(xì)胞的分化和功能，在沒有mTOR信號的情況下，CD4+T細(xì)胞則無法分化為效應(yīng)細(xì)胞。抑制T細(xì)胞中的mTOR通路會促進(jìn)T細(xì)胞耐受，而維持耐受的機(jī)制之一是當(dāng)亮氨酸抑制劑存在，T細(xì)胞無法上調(diào)mTOR活性[47]。由此可見，亮氨酸作為一種重要的調(diào)節(jié)信號，通過mTOR通路對免疫細(xì)胞的增殖和活化都產(chǎn)生著一定的影響，但mTOR信號通路與腫瘤微環(huán)境中亮氨酸代謝的直接聯(lián)系仍需進(jìn)一步探索。

4 結(jié)語

近年來的研究已經(jīng)證明了氨基酸在腫瘤代謝中的重要作用，氨基酸為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)并參與腫瘤免疫調(diào)控，但靶向氨基酸的抗腫瘤藥物研發(fā)仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先由于氨基酸代謝的靈活性、復(fù)雜性以及腫瘤研究模型的局限性，離體和在體模型之間轉(zhuǎn)換時(shí),代謝表型會發(fā)生改變。其次，腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞對氨基酸及氨基酸代謝酶有著相似需求，并經(jīng)常在微環(huán)境中競爭相同的氨基酸，所以需要明確腫瘤細(xì)胞特有的代謝通路而盡可能減少對機(jī)體的毒性反應(yīng)。另外，氨基酸代謝表型會因?yàn)槟[瘤類型的不同而存在差異。目前，體外針對氨基酸代謝的靶向小分子抑制劑研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展[10]，但在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)腫瘤干預(yù)仍面臨諸多問題，因此，必須謹(jǐn)慎地探索腫瘤微環(huán)境中的治療性干預(yù)措施，以消除對抗腫瘤免疫力的潛在負(fù)面影響。由于大多數(shù)代謝抑制劑無法作為單一有效的治療藥物，因此聯(lián)合治療可能是較為合理的策略，如PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑派姆單抗(pembrolizumab)與IDO1抑制劑聯(lián)用[48]。相信對氨基酸代謝與腫瘤免疫機(jī)制了解的深入，可以為調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)提供新的思路。