炎癥小體在重癥急性胰腺炎中的研究現(xiàn)狀

杜祖超 李鑫健 張占田 白凱淞 白雪巍

1哈爾濱醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胰膽外科，哈爾濱 150081；2哈爾濱醫(yī)科大學肝脾外科教育部重點實驗室，哈爾濱 150081

【提要】 炎癥小體是多蛋白組成的胞質(zhì)復合體，通過調(diào)控caspase-1介導的促炎因子激活來增強對病原體或應激原的免疫應答，其激活失控可導致系統(tǒng)性炎癥反應。目前胰腺損傷與炎癥級聯(lián)反應啟動的耦聯(lián)機制仍不明確，而炎癥小體的發(fā)現(xiàn)為SAP病因研究提供了一個新視角。本文就炎癥小體激活在SAP病程中發(fā)揮的作用及其潛在治療策略進行綜述。

SAP是由外分泌胰腺損傷誘發(fā)的局部和系統(tǒng)性炎癥反應，目前仍缺乏特異性的抗炎治療。近年來由感染或應激因素導致的促炎程序性細胞死亡機制逐漸被闡明[1]，如壞死性凋亡(pyronecrosis)和焦亡(pyroptosis)[2]，這類受調(diào)控的死亡方式可能既是免疫細胞控制局部感染的防御途徑，也是SAP早期炎癥反應擴散的原因[3]。其中由炎癥小體激活半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)是介導細胞焦亡的主要途徑，caspase-1作為炎癥小體經(jīng)典途徑招募的效應蛋白[4]，通過裂解膜穿孔蛋白gasdermin D形成氨基端(N端)和羧基端(C端)結(jié)構域，隨后其N端結(jié)構域在細胞膜形成10～20 nm的孔隙[5]，誘導細胞焦亡并釋放IL-1β、IL-18等炎癥遞質(zhì)，調(diào)節(jié)機體免疫應答。以往研究發(fā)現(xiàn)caspase-1主要在巨噬細胞和樹突狀細胞激活[6]，但近期研究提示腺泡細胞[7]和胰島細胞[8]也可能存在炎癥小體激活過程和焦亡現(xiàn)象，電鏡下觀察腺泡細胞焦亡的形態(tài)特點包括胞質(zhì)腫脹、胞核固縮，最終導致胞膜破裂，大量胞質(zhì)內(nèi)容物溢出[9]。因此，深入探討SAP病程中炎癥小體激活途徑以及由其介導的腺泡損傷和免疫反應失衡機制，有助于找到遏制炎癥級聯(lián)反應的潛在靶點。

一、SAP病程中炎癥小體的激活

炎癥小體是一組調(diào)節(jié)炎癥遞質(zhì)激活的胞質(zhì)蛋白復合體，參與其組裝的模式識別受體包括含核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構域(nucleotide-binding oligomerization, NACHT)樣受體(NLRs)、黑色素瘤缺失-2(absent-in-melanoma-2, AIM2)樣受體(ALRs)和維甲酸誘導基因-I(retinoic acid-inducible gene-I, RIG-I)樣受體(RLRs)等[10]。其中NLRs家族的熱蛋白結(jié)構域3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing 3, NLRP3)炎癥小體在胰腺急、慢性炎癥以及腸黏膜屏障功能的調(diào)節(jié)中均發(fā)揮重要作用[11]，而NLRP6炎癥小體主要參與黏膜免疫，維持腸道微生態(tài)的穩(wěn)定性[12]。盡管功能有所不同，NLRs家族卻有著類似的結(jié)構，包括C端的富亮氨酸重復序列(leucine-rich repeat domain, LRR)結(jié)構域、中心的NACHT結(jié)構域以及N端招募caspase的結(jié)構域。LRR主要負責感知上游信號，激活后的NLRP通過NACHT結(jié)構域進行寡聚并通過N端熱蛋白結(jié)構域(pyrin domain, PYD)招募接頭蛋白即凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain, ASC)，隨后ASC的caspase激活與募集結(jié)構域?qū)ro-caspase-1募集在復合體內(nèi)，形成完整的炎癥小體[13]。NLRP-ASC-caspase-1復合體中3種蛋白成分相互調(diào)控，在合適的狀態(tài)下激活免疫反應。AIM2炎癥小體最近也被證實與SAP的無菌性炎癥反應和病情嚴重程度相關[14]。AIM2炎癥小體主要由N端PYD和C端具有200個氨基酸重復序列的造血干擾素誘導核抗原結(jié)構域(hematopoietic interferon-inducible nuclear antigens with 200 amino acid repeats, HIN200)組成，HIN200識別胞質(zhì)雙鏈DNA后由PYD募集ASC介導下游反應[15]。

目前研究表明NLRP3炎癥小體激活過程包括合成及效應階段，除了病原相關分子模式以外，胞膜通透性改變和離子流動(如Ca2+內(nèi)流、K+外流)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、溶酶體破裂、線粒體損傷、自噬缺陷等細胞事件以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)、硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)、游離脂肪酸、尿酸等代謝物堆積均與其激活相關，并且它們之間存在復雜的交互作用[10]。Hoque等[3]依次敲除小鼠炎癥小體成分caspase-1、ASC、NLRP3以及Toll樣受體TLR9/TLR3、嘌呤受體P2X7，通過與雨蛙素誘導的野生型小鼠對比，證明SAP早期炎癥反應產(chǎn)生及發(fā)展需要NLRP3炎癥小體參與，其中胰腺損傷所釋放的核酸(胞核或線粒體DNA)及ATP作為損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMP)分別作用于巨噬細胞的TLR9受體和P2X7受體，參與NLRP3炎癥小體的激活。TLR9激活可作為炎癥小體合成的啟動信號，受到配體刺激的TLR通過MyD88-IRAK-TRAF6通路激活IκB激酶(IκB kinase, IKK)復合體，進而導致IκBα磷酸化解離或降解，胞質(zhì)的NF-κB得以解除抑制向細胞核轉(zhuǎn)移，促進NLRP3和白介素前體合成[16]。炎癥小體組裝及發(fā)揮效應所需第二信號尚無定論，有假說認為眾多刺激信號并未直接與NLRP3結(jié)合，而是通過膜通透性改變介導的跨膜離子流參與其激活過程，其中K+外流作為炎癥小體激活的獨立觸發(fā)因素近年來逐漸受到重視[17]。Di等[18]證明P2X7在感受DAMP刺激后作為非選擇性陽離子通道介導Ca2+、Na+等內(nèi)流，內(nèi)向電流產(chǎn)生的膜電位差在雙孔結(jié)構域內(nèi)向整流鉀通道(TWIK2通道)協(xié)同作用下介導K+外流，胞質(zhì)離子分布改變激活了NLRP3炎癥小體，并且阻斷TWIK2通道，可顯著減輕小鼠巨噬細胞介導的肺損傷。Vyleta等[19]提出應激信號誘導的線粒體ROS產(chǎn)生和K+外流等可能通過促進翻譯起始2α或延長因子2的磷酸化，抑制核糖體功能，進而激活NLRP3炎癥小體。目前多數(shù)激活途徑是依據(jù)感染性動物模型提出的，而SAP早期以無菌性炎癥為主，因此炎癥小體在不同病因SAP中的激活過程仍需要進一步深入研究。此外，腸道微生物相關分子模式在炎癥小體激活過程中的作用也是近年來的研究熱點。Li等[20]的實驗證明急性壞死性胰腺炎小鼠的腸道菌群與NLRP3炎癥小體存在交互調(diào)控，AP期間條件致病菌(埃希-志賀菌屬及腸球菌屬等)豐度增加導致NLRP3炎癥小體激活，而NLRP3激活又加重了腸道菌群紊亂和腸黏膜屏障損傷，敲除NLRP3的小鼠菌群失調(diào)及炎癥反應明顯減輕。該研究結(jié)果提示腸黏膜NLRP6炎癥小體在SAP腸源性感染中是發(fā)揮協(xié)同還是拮抗作用有待進一步研究。

二、炎癥小體對SAP局部和全身炎癥反應的調(diào)控

Hoque等[3]研究表明，SAP中NLRP3炎癥小體激活是多條通路協(xié)同作用的結(jié)果，被配體激活的TLR4、TLR9通過NF-κB通路誘導NLRP3表達并同時促進巨噬細胞誘導IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎癥因子前體蛋白的合成[16]，在各種應激原作用下NLRP3寡聚并進入效應階段，即募集活化caspase-1并促進IL-1β、IL-18、高遷移率族蛋白1 (high-mobility group box-1, HMGB1) 前體的成熟和釋放[21]。在細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等誘導下，由caspase-11介導的非經(jīng)典途徑也參與炎癥小體激活和IL前體活化，但在人體并未得到證實[22]。生理狀況下的NLRP3炎癥小體激活可促進損傷組織的清除及修復，維持機體穩(wěn)態(tài)，但其功能失調(diào)卻與許多炎癥和代謝性疾病相關。激活的caspase-1、caspase-11可通過切割活化gasdermin D誘導細胞焦亡，同時促進炎癥因子釋放到胞外[5]，并且焦亡細胞的胞質(zhì)內(nèi)容物作為DAMP繼續(xù)激活免疫系統(tǒng)，導致炎癥反應級聯(lián)放大。此外，有研究表明焦亡的單核巨噬細胞以微泡形式釋放組織因子[23]，觸發(fā)全身凝血功能異常。

Sendler等[24]通過對急性壞死性胰腺炎小鼠脾、系膜淋巴結(jié)的淋巴細胞和體外骨髓來源巨噬細胞(與雨蛙素刺激腺泡共培養(yǎng))進行流式細胞及轉(zhuǎn)錄組分析，證實NLRP3炎癥小體在調(diào)控機體促炎和抗炎反應中發(fā)揮關鍵作用。由此可見，早期胰腺損傷激活的免疫反應受到自身限制，M1巨噬細胞清除壞死腺泡細胞的同時激活NLRP3炎癥小體，從而促使炎癥因子成熟和釋放。分泌到胞外的IL-1β促進IL-6、TNF-α的促炎作用，而IL-18介導中性粒細胞成熟和局部浸潤，同時誘導適應性免疫向Th2/Treg方向轉(zhuǎn)化(缺乏由LPS誘導的IL-12情況下)。Th2細胞分泌的IL-4、IL-13進而誘導巨噬細胞向M2方向分化，促使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗炎反應及組織纖維化。Schmidt等[25]解釋了SAP急性期的SIRS導致器官功能衰竭，而代償性抗炎反應則導致壞死組織感染和膿毒癥，二者可能是平行進展的過程，炎癥小體介導的促炎和抗炎反應失衡可能與臨床SAP患者兩個死亡高峰期相關。但以上結(jié)果是基于SAP提出的，輕癥和中度重癥AP的免疫反應譜還需進一步闡明，以揭示病程由輕癥向重癥轉(zhuǎn)化的機制。

三、基于炎癥小體的治療策略

1．炎癥小體抑制劑：NLRP3復合體的直接抑制劑包括MCC950、OLT1177、曲尼斯特以及CY-09等[11]，其中以MCC950研究最廣泛，它通過抑制ASC寡聚及復合體ATP酶活性進而阻斷caspase-1活化，抑制IL-1β、IL-18激活，從而減輕對急性壞死性胰腺炎小鼠的促炎及抗炎反應[24]。冬凌草甲素是從中藥冬凌草提取的貝殼杉烯二萜類化合物，通過作用于NLRP3炎癥小體的NACHT結(jié)構域阻斷其激活，同時抑制上游NF-κB通路，在多種炎癥性疾病中顯示出良好效果，是較有潛力的候選藥物[26]。炎癥小體間接抑制劑包括格列本脲、16673-34-0、JC124等，下游caspase-1抑制劑包括小白菊內(nèi)酯、VX-740和VX-765等，針對底物IL-1β、IL-18的單抗已經(jīng)應用于相關自身免疫疾病治療，其在SAP中的療效有待進一步驗證[11]。此外，Guarda等[27]的實驗表明Ⅰ型干擾素(type I interferons, IFN-I)通過STAT1轉(zhuǎn)錄因子抑制NLRP3激活，并通過STAT3抑制IL-1前體合成，這為IFN-I應用于炎癥小體相關疾病提供了理論基礎。

2．炎癥小體上游信號阻斷劑：炎癥小體的上游包括轉(zhuǎn)錄合成所需的第一信號和組裝活化所需的第二信號[28]。Greten等[29]通過抑制或敲除IKKβ阻止NF-κB激活，實驗小鼠由內(nèi)毒素介導的炎癥反而加重，這可能來源于其他通路對IL-1β的合成代償性增加，提示長時間抑制NF-κB通路可能會使IL-1β的激活不依賴于炎癥小體途徑。阻斷NLRP3激活第二信號的阻斷劑很多，主要包括(1)自噬參與溶酶體對損傷細胞器和大分子物質(zhì)的分解代謝，白藜蘆醇能夠通過誘導細胞保護性自噬和維持線粒體穩(wěn)定性來抑制NLRP3激活，并促進炎癥小體及其下游蛋白降解[30]。(2)TWIK2通道介導的K+外流是NLRP3激活的獨立因素，奎寧可特異性阻斷TWIK2通道并減輕巨噬細胞誘導的炎性損傷[18]；β-羥基丁酸是酮體代謝產(chǎn)物，能通過抑制K+外流及ASC寡聚阻斷NLRP3激活[31]。(3)和厚樸新酚是來源于厚樸的雙酚化合物，其通過抑制線粒體ROS阻斷炎癥小體激活[32]。此外，直接拮抗Toll樣受體也可明顯抑制NLRP3激活，如TLR9拮抗劑IRS954可顯著減輕AP小鼠的胰腺壞死和肺部炎癥[3]，乳酸鹽(如乳酸鈉林格等)可通過乳酸受體GPR81(G-protein-coupled receptor 81)抑制TLR4、TLR9介導的NLRP3激活和炎癥因子釋放[33]。

3．非編碼RNA對炎癥小體的表達調(diào)控：微小RNA(microRNA，miRNA)通過靶向信使RNA抑制特定基因表達。研究表明miR-20b-3p的水平升高能夠抑制TXNIP介導的NLRP3炎癥小體激活過程，減輕炎癥反應[34]。此外，miR-223可直接結(jié)合NLRP3轉(zhuǎn)錄本3′UTR保守位點抑制其表達，miR-223缺失的小鼠對內(nèi)毒素的易感性顯著提高[35]。miR-133a-1則通過抑制線粒體解耦聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2, UCP2)表達進而促進炎癥小體效應蛋白caspase-1及IL-1β激活[36]。因此，對miRNA的調(diào)控可能有助于阻止SAP早期的炎癥級聯(lián)反應。

綜上所述，炎癥小體被損傷腺泡細胞所釋放的DAMP激活，通過促進巨噬細胞分泌IL-1、IL-18以及HMGB1參與固有免疫反應，并調(diào)節(jié)適應性免疫向Th2/Treg方向轉(zhuǎn)化。抑制NLRP3炎癥小體激活可有效減輕SAP期間的炎癥反應，但過度抑制固有免疫可能會導致后期感染并發(fā)癥增加。因此，對于炎癥小體的調(diào)控，應避免過猶不及，抑制強烈促炎反應帶來的SIRS的同時，應避免代償性抗炎反應造成的壞死組織感染，以重新建立免疫系統(tǒng)平衡狀態(tài)為治療目標。同時應充分發(fā)揮我國傳統(tǒng)中醫(yī)學優(yōu)勢，為遏止輕中癥AP向重癥轉(zhuǎn)化提供可行方案。進一步開發(fā)安全有效的靶向NLRP3抗炎藥物不僅能為SAP患者帶來獲益，也能為炎性腸病等其他免疫相關疾病長期緩解帶來新希望。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突