管 婉 陳業(yè)橋 唐利華 李福后
(1江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇連云港222005;2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海奉賢201403;3宿遷華珍生物有限公司,江蘇宿遷223800)
食用菌是一種口感鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富的絕佳食材,富含多種人體所需的營養(yǎng)物質(zhì),并含多糖、低聚糖、腺苷等多種活性成分。食用菌備受關(guān)注的藥用價(jià)值極大程度地帶動了食用菌行業(yè)及其下游產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。隨著食用菌價(jià)值理念的深入人心及其產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展,如今的食用菌產(chǎn)業(yè)已是我國創(chuàng)新性農(nóng)業(yè)快速發(fā)展至關(guān)重要的一環(huán),是解決我國“三農(nóng)”問題的重要抓手。
高質(zhì)量食用菌生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一在于掌握食用菌液體菌種技術(shù)。液體菌種生產(chǎn)效率高、純度高,接種后發(fā)菌污染率低,子實(shí)體質(zhì)量、產(chǎn)量明顯優(yōu)于傳統(tǒng)固體菌種。采用液體菌種栽培金針菇、杏鮑菇、香菇、平菇等食用菌,有效地解決傳統(tǒng)食用菌行業(yè)勞動密集型生產(chǎn)問題[2]。液體菌種相比傳統(tǒng)固體菌種優(yōu)勢明顯,應(yīng)用前景廣闊[3]。筆者多方面闡述我國食用菌液體菌種的制備技術(shù)及生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀,為液體菌種生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。
不同種類的食用菌液體菌種培養(yǎng)需要不同培養(yǎng)基。金針菇液體菌種培養(yǎng)基的搖瓶配方:黃豆粉5%,KH2PO40.05%,可溶性 淀粉4%,維生 素B20.0075%[4]。杏鮑菇液體菌種培養(yǎng)基的搖瓶配方:黃豆餅粉60 g/L,葡萄糖10 g/L,蛋白胨5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO40.5 g/L,維生素B10.01 g/L[5]。海鮮菇液體菌種培養(yǎng)基的搖瓶配方(加水至200 mL):土豆淀粉4.8 g,玉米淀粉0.6 g,麩皮12 g,蛋白胨3 g,葡萄糖12 g,KH2PO41.2 g,F(xiàn)eSO40.6 g,維生素B11片,另加一滴消泡劑。海鮮菇液體菌種培養(yǎng)基的發(fā)酵罐配方(700 L發(fā)酵罐用量):豆粕粉2 500 g,酵母 膏1 500 g,白 糖10 000 g,KH2PO4500 g,MgSO4250 g,檸檬酸150 g,加水?dāng)嚢钑r(shí)添加消泡劑58 mL??梢?,不同食用菌的液體菌種培養(yǎng)基配方有明顯差異。
1.2.1 搖瓶振蕩培養(yǎng)
液體菌種培養(yǎng)基配制后及時(shí)裝入三角瓶內(nèi),同時(shí)加入0~10粒小鋼珠,緊密包扎封口后滅菌20 min,取出冷卻至室溫后再接入斜面菌種。不同的搖床設(shè)備所設(shè)置的溫度、頻率等有差異。往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)菌種時(shí),振蕩頻率為80~100次/min,振幅為6~10 cm,溫度為23~25℃較為合適。旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)菌種時(shí),溫度為24~25℃,旋轉(zhuǎn)頻率為200~220 r/min,培養(yǎng)時(shí)間視食用菌種類而定,一般為7 d左右。一般瓶內(nèi)培養(yǎng)基通透并含有較多菌絲球,同時(shí)散發(fā)出該菌類獨(dú)特的氣味時(shí),搖瓶液體菌種培養(yǎng)結(jié)束。
1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)
發(fā)酵罐培養(yǎng)液體菌種的過程為:配制培養(yǎng)基—滅菌—冷卻—接種—發(fā)酵罐培養(yǎng)—接種栽培袋[6]。發(fā)酵罐培養(yǎng)液體菌種要求有整套的發(fā)酵設(shè)備,如發(fā)酵罐、鍋爐、空氣壓縮機(jī)、凈化裝備等。
培養(yǎng)液體菌種,操作自動化,工序簡單明了(相對于固體菌種,極大簡化了制種工藝)。液體菌種培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富,接種后菌絲能快速萌發(fā)(占據(jù)生長優(yōu)勢),從而降低污染率,縮短菌種的培養(yǎng)周期;同時(shí),液體菌種生產(chǎn)成本優(yōu)勢明顯。液體菌種的應(yīng)用對國內(nèi)食用菌產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化、工廠化、規(guī)?;l(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。
1.4.1 對生產(chǎn)環(huán)境要求高
與固體菌種相比,液體菌種制備對菌絲生長環(huán)境控制要求非常高,稍有不慎就極可能引起雜菌污染,導(dǎo)致制種失敗[7]。
1.4.2 貯藏運(yùn)輸困難
自然條件下,大部分食用菌的液體菌種僅能保存1~2 d,如果經(jīng)過降溫保壓處理,可適當(dāng)延長儲藏期2~3 d,但具體要視品種和培養(yǎng)基營養(yǎng)成分而定[8]。液體菌種若在規(guī)定時(shí)間內(nèi)未用完,菌絲球就會出現(xiàn)自溶現(xiàn)象,而自溶的菌種不能再應(yīng)用于生產(chǎn)。
1.4.3 抗逆能力弱
在不利生長環(huán)境中,液體菌種的生長存活能力不及固體菌種,抗逆能力較弱。配方不合理、接種操作不規(guī)范、培養(yǎng)條件不適宜等原因都有可能造成液體菌種大批量污染??梢?,制備液體菌種時(shí),需要精準(zhǔn)掌握每個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)[9]。
1.4.4 發(fā)酵罐難清洗
合適的生物發(fā)酵罐是液體菌種培養(yǎng)的必備設(shè)備[10]。殘留發(fā)酵液為發(fā)酵罐內(nèi)主要污染源之一,如何清洗是一大難題。
近些年,雖然黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,但仍沒有實(shí)現(xiàn)真正意義上的工廠化栽培黑木耳,原因與沒有成熟的黑木耳液體菌種培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)。因此,黑木耳工廠化栽培需要借鑒金針菇、杏鮑菇工廠化生產(chǎn)成功經(jīng)驗(yàn),積極探索黑木耳液體菌種工廠化生產(chǎn)技術(shù)。車星星等[11]研究黑木耳液體菌種生產(chǎn)技術(shù),篩選出最佳黑木耳液體菌種培養(yǎng)基配方,最適pH為7.0,最佳培養(yǎng)溫度為25℃。張介馳等[12]創(chuàng)建了針對黑木耳液體菌種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測評價(jià)方法。王晨等[13]通過ARTP誘變技術(shù)及液體發(fā)酵試驗(yàn)對比篩選出黑木耳優(yōu)良液體發(fā)酵菌株Aa66,其總多糖含量可達(dá)28.67 g/L。碳源和氮源是食用菌液體菌種培養(yǎng)基的重要組成成分,顯著影響著食用菌菌絲體的生長發(fā)育。李超等[14]試驗(yàn)表明,黑木耳液體培養(yǎng)基的碳源對黑木耳菌絲生長量影響最大,菌絲對有機(jī)氮源利用效果最佳。
黑木耳液體菌種老化問題一直被研究者關(guān)注。為提高黑木耳液體菌種質(zhì)量,許修宏等[15]研究不同添加物對黑木耳菌絲生長的影響,結(jié)果表明,向黑木耳液體培養(yǎng)基中添加KH2PO4及維生素B1可有效延緩菌絲老化。隨著現(xiàn)今黑木耳液體菌種培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn),深入研究黑木耳菌絲老化機(jī)制對解決黑木耳液體菌種保藏問題尤為關(guān)鍵。
蛹蟲草又名北蟲草,作為冬蟲夏草的理想替代品,頗受國內(nèi)外市場青睞。方華舟等[16]試驗(yàn)得出蛹蟲草液體菌種培養(yǎng)工藝參數(shù):裝液量小于培養(yǎng)容器1/2,接種量為0.5%,振蕩頻率為120 r/min。左雪枝等[17]探討光照對蛹蟲草液體菌種生長的影響,結(jié)果表明,蛹蟲草在不同生長階段采用不同光照強(qiáng)度有利于提高其產(chǎn)量。蘇丹等[18]對蛹蟲草液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,最終篩選出最佳培養(yǎng)基配方:蔗糖30 g/L,蛋白胨2.5 g/L,K2HPO41 g/L,MgSO40.1 g/L。液體培養(yǎng)基對蛹蟲草菌絲生長、子實(shí)體生長都有顯著影響,徐方旭等[19]的試驗(yàn)結(jié)果表明,碳源和氮源是蛹蟲草液體培養(yǎng)基中影響蛹蟲草菌絲生長的最重要因素。
傳統(tǒng)的家庭式栽培香菇模式逐步減少,而以液體菌種為創(chuàng)新技術(shù)的工廠化栽培香菇必將成為新的模式。為滿足制備香菇液體菌種的高技術(shù)要求,唐業(yè)剛等[20]對香菇搖瓶培養(yǎng)基的碳源、無機(jī)鹽配比、氮源進(jìn)行優(yōu)化,并探討硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)在富鐵培養(yǎng)基中的最適添加量,以及黃豆粉在富鐵培養(yǎng)基中的最佳添加量,結(jié)果優(yōu)化后的培養(yǎng)基(馬鈴薯20%,可溶性淀粉2%,酵母膏1.5%,蛋白胨0.2%,KH2PO41.0%,MgSO40.05%)培養(yǎng)的香菇菌絲球得率為0.932 g/100 mL;當(dāng)培養(yǎng)基中硫酸亞鐵含量為0.336 mg/100 mL(最佳硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為6 mL)時(shí),香菇菌絲球得率最高,為1.274 g/100 mL,菌絲球最高總富鐵量為0.1 008 mg/100 mL;當(dāng)黃豆粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí),菌絲球得率最高為1.4 260 g/100 mL,菌絲球總富鐵量最高為0.1 547 mg/100 mL。
陳文杰[21]試驗(yàn)篩選出高實(shí)用性的香菇液體菌種培養(yǎng)基配方:玉米粉2 g,馬鈴薯淀粉2 g,葡萄糖20 g,酵母膏2 g,KH2PO41 g,MgSO41 g,加水1 000 mL;該配方的搖瓶菌種接種木屑培養(yǎng)基后菌絲生長速度最快,對香菇液體菌種生產(chǎn)及應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院多年來一直進(jìn)行工廠化生產(chǎn)香菇的液體菌株選育以及培養(yǎng)工藝研究。周峰等[22]以日產(chǎn)4萬袋香菇為例,多因素對比分析得出,使用液體菌種相較于固體菌種,每年可節(jié)約菌種費(fèi)用至少100萬元以上,且能縮短發(fā)菌周期,降低能耗,提高庫房使用率,提高產(chǎn)品質(zhì)量。由此可知,香菇液體菌種有望被企業(yè)廣泛使用。
羊肚菌是一種極其珍貴的野生菌,主要產(chǎn)于我國新疆、云南、西藏等?。▍^(qū)),因其營養(yǎng)價(jià)值高且風(fēng)味獨(dú)特而備受關(guān)注。目前,野生羊肚菌已不能滿足市場需求,因此人工栽培羊肚菌發(fā)展迅速,其液體菌種的研究也備受關(guān)注。劉衛(wèi)紅[23]試驗(yàn)結(jié)果,用玉米粉4.0%,葡萄糖1.0%,黃豆粉2.0%,酵母0.3%,KH2PO40.2%,MgSO40.1%,CaSO40.1%培養(yǎng)的液體菌種,發(fā)菌快,菌齡一致,能夠快速規(guī)?;a(chǎn)。
許瀛引等[24]研究得出羊肚菌液體菌種最佳培養(yǎng)溫度為25℃,培養(yǎng)時(shí)間為1~3 d。鄭旋等[25]通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn),分別研究平板培養(yǎng)、靜置天數(shù)、裝液量、玻璃珠、增稠劑等對液體培養(yǎng)的六妹羊肚菌菌絲形態(tài)、菌絲生物量、菌絲球數(shù)量的影響。結(jié)果表明,在500 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加含0.9%羧甲基纖維素鈉的液體培養(yǎng)基300 mL,25℃黑暗條件下,先靜置培養(yǎng)1 d后,150 r/min培養(yǎng)4 d,培養(yǎng)菌絲球均勻,數(shù)量為3.55×103個(gè)/mL,菌絲體生物量最高為8.17 mg/mL。此方法有利于羊肚菌菌絲球的形成,且菌球數(shù)量多,生物量高,對羊肚菌液體菌種培養(yǎng)具有重要參考價(jià)值。
目前,我國大多數(shù)食用菌生產(chǎn)仍以小規(guī)模家庭作坊式的生產(chǎn)模式為主,既無投資液體菌種設(shè)備,也無這方面技術(shù)人員。因此,相關(guān)研究機(jī)構(gòu)應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際,研發(fā)出各種需求的液體菌種設(shè)備;同時(shí),加大技術(shù)人才的培養(yǎng)力度,同時(shí)制定液體菌種標(biāo)準(zhǔn)化接種操作規(guī)程,從而實(shí)現(xiàn)食用菌液體菌種制備技術(shù)的推廣和發(fā)展。
液體菌種技術(shù)作為一項(xiàng)新技術(shù),未來在食用菌生產(chǎn)中應(yīng)用必將越來越廣泛[26],對其研究須更深入。