汪春明 ，張洋 ，王姝葦 ，施鵬斐 ，吳迪 ，常利民 ，楊波 ，尹峰

[中檢科（北京）測試技術有限公司，北京 100123； 2.中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心，北京 100123]

茄子起源于亞洲，是我國一種重要的茄果類蔬菜。我國是茄子的第一大生產(chǎn)國，擁有極豐富的地方品種［1］。茄子的營養(yǎng)價值高，食用方式多樣，深受廣大消費者的歡迎［2］，其質量和安全問題也備受關注。我國GB 2763—2019 《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［3］中對果蔬中農(nóng)藥殘留限量做了詳細規(guī)定，以保障消費者的食品安全。曹哲峰［4］等對包含茄子在內的91個茄果類蔬菜樣品中農(nóng)藥的殘留情況進行檢測，結果表明茄果類蔬菜總體農(nóng)藥殘留超標情況比較嚴重。做好農(nóng)藥殘留監(jiān)控工作是保護人民生命安全、提高農(nóng)產(chǎn)品質量和品牌效應、增強農(nóng)產(chǎn)品市場競爭力的強有力保障［5］。

能力驗證是利用實驗室間比對，按照預先制定的準則來評價參加者的能力［6-8］，是實驗室質量保證的重要手段，有助于實驗室評價和證明其測量數(shù)據(jù)可靠性，發(fā)現(xiàn)自身存在的問題，改進實驗室的技術能力和管理水平。英國分析實驗能力驗證公司(Food Analysis Performance Assessment Scheme，F(xiàn)APAS)，是目前國際食品領域中權威的能力驗證提供者，提供全球食品領域中最大、最全面的分析化學水平測試評估計劃［9］。參加FAPAS能力驗證并得到有效滿意的結果，是判斷實驗室驗證或校準該項目能力的標準，也是中國合格評定國家認可委員會（CNAS）判斷實驗室能力的重要技術依據(jù)［10］。實驗室作為參加能力驗證的主體，需基于自身需求和外部對能力驗證的要求，在綜合考慮內部質控水平、人員能力、設備狀況、風險、運行成本等因素的基礎上，合理策劃并積極尋求適當?shù)哪芰︱炞C計劃?；谧陨硇枨?，本實驗室參加FAPAS 19302茄子中農(nóng)藥殘留篩查能力驗證。結合FAPAS 19302能力驗證結果，對本次能力驗證過程中的準備工作、樣品前處理的選擇與優(yōu)化、定量結果的分析討論、分析檢測過程中遇到的問題及解決的思路進行總結，為食品檢測實驗室農(nóng)藥殘留的檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質譜儀：EXionLC-QTRAP 5500型，美國AB SCIEX公司。

氣相色譜-串聯(lián)質譜儀：Agilent 7890-7000型，美國安捷倫科技有限公司。

分 析 天 平：XS105型，d=0.1 mg；PL303型，d=0.001 g，瑞士梅特勒-托利多集團。

旋轉蒸發(fā)儀：N1000型，日本東京理化器械株式會社。

渦旋混勻器：VORTEX GENIE 2，美國Scientific Industries公司。

振蕩器：SR-2DS型，日本TAITEC公司。

超純水系統(tǒng)：Milli-Q型，美國密理博公司。

氮吹儀：EVA50A型，中國普立泰科公司。

能力驗證樣品：FAPAS英國總部提供的茄子測試樣品。

乙腈、甲酸、正己烷、丙酮、乙酸乙酯：色譜純，美國費希爾公司。

氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

分散固相萃取凈化管：Cleanert MAS-Q型，15 mL（300 mg C18、300 mg PSA、900 mg MgSO4），天津博納艾杰爾科技有限公司。

氮氣：體積分數(shù)為99.999%，北京東方醫(yī)用氣體有限公司。

氦氣：體積分數(shù)為99.999%，霸州市安興氣體有限公司。

霜霉威（質量分數(shù)為97.1%）、嘧菌酯（質量分數(shù)為98.7%）、溴氰菊酯（質量分數(shù)為99.7%）、二苯胺（質量分數(shù)為99.56%）、特丁硫磷亞砜（質量分數(shù)為96.3%）：英國政府化學家實驗室。

克百威（1 000 μg／mL）、胺菊酯（質量分數(shù)為99.5%）：北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

胺菊酯、二苯胺和溴氰菊酯混合標準中間溶液：以丙酮為溶劑，配制成胺菊酯、二苯胺和溴氰菊酯質量濃度均為10 μg／mL和1.0 μg／mL的兩種混合標準中間溶液。

嘧菌酯、克百威、霜霉威和特丁硫磷亞砜混合標準中間溶液：以乙腈為溶劑，配制成嘧菌酯、克百威、霜霉威和特丁硫磷亞砜質量濃度均為10 μg／mL和1.0 μg／mL兩種混合標準中間溶液。

選擇S／N＜3，且不含目標農(nóng)藥的樣品作為空白，按照1.2.2節(jié)進行前處理制得空白樣品基質溶液。

LC-MS／MS用系列標準工作溶液：分別移取1.0 μg／mL嘧菌酯、克百威、霜霉威和特丁硫磷亞砜混合標準中間溶液 10、20、50、100、200、300、400、500 μL于8只10 mL容量瓶，用乙腈定容至標線；將8份2 mL空白基質溶液氮氣吹干，分別加入1 mL上述工作溶液復溶，即得到嘧菌酯、克百威、霜霉威和特丁硫磷亞砜質量濃度均分別為1、2、5、10、20、30、40、50 ng／mL 系列基質匹配標準工作溶液。

GC-MS／MS用系列標準工作溶液：分別移取1.0 μg／mL胺菊酯、二苯胺和溴氰菊酯混合標準中間溶液 50、100、200、500 μL 和 10 μg／mL 的混合標準中間溶液 100、150、200、300 μL 于 8 只 10 mL容量瓶中，由丙酮-正己烷（體積比為1∶1，下同）定容至標線；將8份10 mL空白基質溶液氮氣吹干，分別加入1 mL上述工作溶液復溶，即得到胺菊酯、二苯胺和溴氰菊酯質量濃度均分別為5、10、20、50、100、150、200、300 ng／mL 系列基質匹配標準工作溶液。

1.2.2 樣品制備

（1）樣品粉碎。按照 GB 2763［3］的相關規(guī)定抽取有代表性的空白樣品，用高速勻漿機粉碎后裝入自封袋中備用。能力驗證樣品為FAPAS英國總部提供的茄子測試樣品，冷凍（藏）包裝，樣品編號19032，運輸?shù)竭_實驗室時，包裝完好，樣品已解凍（FAPAS作業(yè)指導書表示不影響檢測）。

（2）提取。稱取粉碎后的樣品5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管，加入20 mL酸化乙腈（乙酸體積分數(shù)為 0.5%），2.0 g NaCl，振蕩 20 min，以5 000 r／min轉速離心3 min，上清液轉入雞心瓶中，樣品再次用20 mL酸化乙腈按上述步驟提取，合并兩次上清液，于40 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮至近干，用乙腈定容至50 mL容量瓶中。

（3）濃縮、換相。LC-MS／MS：取2 mL提取液到接收管中，用40 ℃氮氣濃縮至近干，用1 mL乙腈-水（3∶7）復溶，渦旋30 s，超聲20 s，過0.2 μm尼龍膜，裝瓶，待LC-MS／MS測定。

GC-MS／MS：取10 mL提取液到接收管中，用40 ℃氮氣濃縮至近干，用1 mL丙酮-正己烷（1∶1）復溶，渦旋 30 s，超聲 20 s，裝入 2 mL 離心管中于 12 000 r／min 離心 3 min，裝瓶，待 GC-MS／MS測定。

1.2.3 液相色譜-串聯(lián)質譜條件

(1)液相色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司）；柱溫：40 ℃；進樣體積：3.0 μL；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，流量為0.3 mL／min；梯度洗脫程序：0～1.0 min為10%B，1.0～2.8 min為10%～90%B，2.8～4.8 min 為 90%B，4.8～5.3 min 為90%～10%B，5.3～6.8 min為10%B。

(2)質譜條件。電噴霧正離子模式（ESI+）；多反應監(jiān)測（MRM）；氣簾氣：氮氣，壓力為0.207 MPa；碰撞氣：氮氣，壓力為Medium；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；噴霧器壓力：0.345 MPa；輔助加熱器壓力：0.345 MPa；駐留時：間60 ms；入口電壓：10 V；各化合物監(jiān)測離子對、碰撞能量見表1。

表1 種農(nóng)藥監(jiān)測離子對及碰撞能量

1.2.4 氣相色譜-串聯(lián)質譜條件

（1）氣相色譜條件。色譜柱：HP-5MS UI色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司）；進樣口溫度：280 ℃；進樣體積：1.0 μL ；載氣：氦氣；質譜傳輸線溫度：280 ℃；程序升溫：60 ℃，保持1 min，以40 ℃／min升至170 ℃，再以10 ℃／min升至310 ℃，保持6 min。

（2）質譜條件。離子源為電子轟擊源（EI+）；多反應監(jiān)測（MRM）模式；碰撞氣：氮氣；離子源溫度：300 ℃；各化合物監(jiān)測離子對、碰撞能量見表2。

表2 種農(nóng)藥監(jiān)測離子對及碰撞能量

2 結果與討論

2.1 能力驗證實施步驟

接收樣品時需首先對樣品狀態(tài)進行確認，包括樣品的內外包裝是否完好，運輸時是否符合樣品的運輸條件。根據(jù)作業(yè)指導書，確認樣品標簽與指導書編號是否相對應，樣品所需的儲存條件、此次能力驗證的分析項及殘留標示物或代謝物、推薦的檢測方法、最小取樣量、樣品復原的方法，以及上報時的結果表示、材料要求、上報方式與時間等。

樣品確認無誤后進行預實驗。在配制標準溶液時應雙人配制，一人配制，一人監(jiān)督。新配制的標準溶液可與現(xiàn)有的舊標準溶液在儀器上進行對比，以保證標準品濃度的準確性。選擇干凈無污染的實驗器具，稱取1份考核樣品，按最低取樣量取樣進行實驗。在前處理時可通過不同的提取、凈化、濃縮方法以及不同的實驗人員進行比對，通過做試劑空白、基質空白、添加定量限水平的標準品測定回收率等方法監(jiān)控實驗的可行性。通過在不同類型的儀器上，以及在同一類型的不同儀器上進行對比測定，保證儀器的穩(wěn)定性和精密度。通過不同的定量方式，如外標法、內標法等，保證檢測數(shù)據(jù)的準確性。實驗過程中每一步都需有詳細的實驗記錄。

在確定實驗方法和考核樣品中分析項目的濃度范圍后，進行正式實驗。正式實驗需稱取4份考核樣品，其中3份為平行實驗，1份為樣品加標，加標量應為樣品中分析項目濃度的1～1.5倍；稱取3份空白樣品，其中1份為基質空白，2份為空白加標，加標量與樣品加標的加標量相同。如樣品量充足，可重復實驗2～3次，以保證實驗結果的準確。實驗過程也需有完整的原始記錄。

整理所有的實驗數(shù)據(jù)，確定上報的結果，并根據(jù)作業(yè)指導書的要求確認結果的表示與計算方法、采用的單位以及有效數(shù)字的保留位數(shù)。做好相關的記錄，包括填寫測試結果質量控制記錄、實驗記錄和保存原始譜圖等。

數(shù)據(jù)上報后等待結果的反饋。若反饋結果為滿意，分析實驗過程中的收獲與不足，為下一次能力驗證提供經(jīng)驗。若反饋結果為不合格，則需要通過翻看實驗記錄、原始譜圖等進行全流程的原因查找，分析實驗過程中存在的問題，并填寫不符合工作記錄、糾正措施實施計劃及跟蹤報告和整改報告，為下一次能力驗證提供參考。

2.2 樣品處理條件優(yōu)化

2.2.1 檢測項目盲篩

（1）農(nóng)藥篩選。這次FAPAS測試樣品涉及到290種農(nóng)藥及其代謝物。本實驗室現(xiàn)有標準品296種，但是并未完全覆蓋這次FAPAS樣品所涉及的290種農(nóng)藥及其代謝物，鑒于此，筆者只用自身現(xiàn)有的標準品進行篩選。

（2）樣品前處理方法。

稱取3.00 g樣品（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管，加入20 mL乙腈，2.0 g NaCl，振蕩20 min，5 000 r／min轉速離心 3 min，上清液轉入雞心瓶中，樣品再次用20 mL乙腈按上述步驟提取，合并兩次上清液，將上清液于40 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮至近干，用乙腈定容至10 mL容量瓶中。

取2 mL提取液到接收管中，于40 ℃氮氣濃縮至近干，用1 mL乙腈-水（3∶7）復溶，渦旋30 s，超聲20 s，過0.2 μm尼龍膜裝瓶，待LC-MS／MS測定篩選。

取4 mL提取液到接收管中，于40 ℃氮氣濃縮至近干，用1 mL丙酮-正己烷（1∶1）復溶，渦旋30 s，超聲 20 s，以 12 000 r／min 轉速離心 3 min，裝瓶，待GC-MS／MS測定篩選。

（3）目標農(nóng)藥確定。在1.2.3和1.2.4儀器工作條件下進行測定，最終確定此次的目標農(nóng)藥有7種，分別是霜霉威、克百威、特丁硫磷亞砜、嘧菌酯、溴氰菊酯、二苯胺、胺菊酯。

2.2.2 提取溶劑的優(yōu)化

農(nóng)殘檢測常用的提取溶劑有酸化乙腈［11-15］、乙腈［16-25］、乙酸乙酯［26］、正己烷［27-28］、丙酮［26］及其它不同比例混合提取液［29-31］。正己烷在提取非極性農(nóng)藥、基質簡單樣品時提取效率較高，本實驗為茄子中多種農(nóng)藥殘留篩查，故而排除正己烷。以空白茄子為基質，按0.1 mg／kg添加篩查出的7種混合標準溶液，比較酸化乙腈（含0.5%乙酸，體積分數(shù)）、乙腈、丙酮-正己烷（1∶1）、乙酸乙酯、丙酮5種提取溶劑對回收率的影響。

分別稱取15份各5.0 g茄子于50 mL具塞離心管，分別加入20 mL 5種不同的提取溶劑（酸化乙腈（含0.5%乙酸，體積分數(shù)）、乙腈、丙酮-正己烷（1∶1）、乙酸乙酯、丙酮，每種提取溶劑作3個平行樣，一共15份），分別加入2.0 g NaCl，振蕩20 min，以5 000 r／min離心3 min，上清液轉入雞心瓶中，樣品再次用20 mL乙腈按上述步驟提取，合并兩次上清液，將上清液于40 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮至近干，分別用對應的5種提取溶劑定容至50 mL容量瓶。然后按1.2.2（3）進行操作。

其中以丙酮作為提取溶劑，合并兩次上清液后不能旋蒸至干，筆者認為足量的丙酮能使茄子中蛋白、脂質類成分溶解出來，而這些成分又不易揮發(fā)，干擾后期檢測，故而舍棄丙酮作為提取溶劑。其余4種提取溶劑的回收率見圖1。

圖1 不同提取溶劑下目標農(nóng)藥的回收率

由圖1可知，當用正己烷-丙酮、乙酸乙酯作為提取溶劑時，霜霉威的回收率只有5.4%和9.8%；當用乙酸乙酯提取時，溴氰菊酯的回收率為145%，回收率偏高；以乙腈和酸化乙腈作為提取溶劑時，回收率都能滿足方法驗證學要求。綜合考慮，選擇酸化乙腈作為提取溶劑。

2.2.3 基質效應

基體通常會對目標物的分析產(chǎn)生較為明顯的干擾，并影響分析結果的準確性，這些干擾或影響被稱為基質效應［32］?；|效應的強弱與被研究基體種類有關，不同農(nóng)藥在不同基質中，產(chǎn)生的基質效應不同；基質效應還與被分析物本身的結構、濃度等理化性質相關；外部環(huán)境如分析過程中使用的緩沖溶液、試劑、前處理方法等也會對基質效應產(chǎn)生影響［33］。因此有必要對基質效應進行評價。分別繪制溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線，用以評價方法的基質效應，基質效應系數(shù)η=（基質匹配標準曲線的斜率-溶劑標準曲線的斜率）／溶劑標準曲線的斜率。當|η|＜10%時，表明無明顯的基質效應；反之，則具有明顯的基質增強或減弱效應［34］。分別按1.2.3和1.2.4儀器條件測定1.2.1配制的系列標準工作溶液，得到的擬合線性方程見表3。

表3 線性方程與基質效應

由表3可知，胺菊酯、溴氰菊酯、克百威的基質效應系數(shù)分別為55.9%、59.9%、-34.5%，有明顯的基質效應，因此采用基質匹配線性方程對胺菊酯、溴氰菊酯、克百威進行定量分析。

2.2.4 凈化方式

基于QuEChERS原則［35］的經(jīng)典樣品處理方法，已被廣泛應用于農(nóng)藥多殘留、獸藥多殘留、生物毒素、非法添加及其它有毒有害污染物檢測。結合待研究基質簡單的特點，本研究對基于QuEChERS原則的樣品處理方法進行考察，常用的凈化填料有硅膠鍵和碳十八（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（GCB）、NaCl鹽析、無水MgSO4除水。其中C18去除脂肪和脂類等非極性干擾物；PSA主要用來凈化各種有機酸、金屬離子、色素以及一些糖類、酚類和脂肪酸；GCB去除色素、甾醇類非極性干擾物。GCB本身獨特的平面結構可與色素發(fā)生不可逆吸附，與此同時GCB會對某些平面結構的農(nóng)藥像嘧菌環(huán)胺、多菌靈、吡嗪酮、噻菌靈、百菌清和蠅毒磷造成25%左右的損失。由于茄子樣品色素含量較少，故排除GCB。

樣品按1.2.2（2）提取，取12 mL提取液至15 mL Cleanert MAS-Q凈化管中，振蕩5 min使凈化完全，以5 000 r／min離心 5 min，之后按1.2.2（3）進行處理，然后按1.2.3、1.2.4測定，結果見表4。

Cleanert MAS-Q凈化管只含有300 mg PSA、300 mg C18和 900 mg MgSO4。MgSO4只除水分，對目標化合物的影響不大，故再考察PSA和C18對7種目標化合物的影響。分別用PSA和C18進行凈化后測定，結果見表4。

表4 不同凈化方式和凈化填料對回收率的影響（n=3）

由表4可知，經(jīng)過QuEChERS填料凈化之后，霜霉威回收率為37.3%，二苯胺回收率為78.1%；在沒有基質干擾的情況下，經(jīng)過PSA凈化的目標化合物回收率為67.6%～94.9%；經(jīng)過C18凈化的回收率為31.9%～99.7%，其中霜霉威、溴氰菊酯、胺菊酯的回收分別為31.9%、41.1%和43.7%，無法滿足方法驗證學要求。

樣品經(jīng)過凈化，影響了目標化合物的回收，綜合以上實驗結果和茄子基質較為簡單的特點，故本實驗采用直接提取、不凈化的方式。

2.3 樣品測定結果

按1.2.2、1.2.3和1.2.4節(jié)進行樣品前處理和儀器測定，一共測定3次，每次3個平行，得到的數(shù)據(jù)見表5。

由表5可知：（1）腈嘧菌酯（嘧菌酯）、克百威、霜霉威和特丁硫磷亞砜3次測定結果較為接近，且每次測定結果的相對標準偏差小于5.2%，結果穩(wěn)定可靠。通過3次測定結果與3次測定結果的平均值對比發(fā)現(xiàn)，第3次的測定結果更加接近3次測定結果的平均值，故選擇第3次作為上報數(shù)值。

表5 能力驗證樣品測定結果

（2）胺菊酯、二苯胺和溴氰菊酯3次測定結果相差較大，且相對標準偏差在6.9%～29.5%之間。結合GC-MS／MS一批序列中同一樣品測定結果越來越低的異常現(xiàn)象，決定不予上報。另外，讓人費解的現(xiàn)象是兩臺GC-MS／MS多次運行同一樣品，得到的結果都呈下降的趨勢。由此帶來兩個問題：（1）平行測定數(shù)據(jù)相差大，筆者分取15份5 mL空白樣品，分別加入50 μL 1.0 μg／mL混合標準溶液，在40 ℃下氮氣吹至近干，分別由1 mL正己烷（3份）、丙酮（3份）、乙腈（3份）、正己烷-丙酮（1∶1）（3份）、乙酸乙酯（3份）復溶，用GC-MS／MS測定并計算回收率。由結果可知，不同復溶溶劑對平行測定數(shù)值的影響不大，其中乙腈復溶的回收率及平行性略好于其它復溶溶劑，乙腈歸為極性溶劑，對本次所用的非極性色譜柱不友好。（2）儀器測定數(shù)值下降，儀器粗略可分為進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、質譜部分。儀器自動調諧，調諧參數(shù)顯示儀器正常；更換全新色譜柱，下降現(xiàn)象依然存在；清洗進樣口，更換襯管，平行測定數(shù)據(jù)趨于穩(wěn)定。后期進一步實驗、分析，認為不管是每次的平行之間，還是這3次測定結果之間，測定結果相差較大的原因是“襯管”沒有達到質量要求。

2.4 數(shù)值對比

根據(jù)FAPAS公布的此次能力驗證的結果顯示，樣品19032茄子中多種農(nóng)藥殘留篩查中，腈嘧菌酯(嘧菌酯)、克百威、霜霉威和特丁硫磷亞砜的通過率分別為98%、95%、85%和83%，筆者上報數(shù)值與FAPAS賦值基本接近，見表6，Z值在0.3～0.6之間，本次比對結果為“滿意”。

表6 FAPAS賦值、上報值及能力驗證結果（Z值）

3 結論

此次FAPAS能力驗證的難點在于農(nóng)藥涵蓋的范圍廣、數(shù)量多，一般實驗室難以具備如此數(shù)量的標準品儲備。好在FAPAS不強制性要求參試機構把所有的農(nóng)藥項目都一一檢測出來，并準確賦值。參試實驗室只需檢測自身能力范圍內、FAPAS供試樣品所含農(nóng)藥，且上報數(shù)值位于整體上報數(shù)值的合理范圍內，即可以通過此次能力驗證。

茄子中的農(nóng)藥經(jīng)過0.5%乙酸乙腈提取，分取提取液后濃縮，換相，上機檢測，結果的Z值在0.3～0.6之間，評價結果為“滿意”。

通過參加FAPAS茄子中多種農(nóng)藥殘留篩查能力驗證所做的準備工作、基本分析流程和關鍵操作方法技巧，分析檢測過程中遇到的問題及解決問題的思路，為其它實驗室參加諸如FAPAS農(nóng)藥殘留能力驗證工作提供經(jīng)驗參考。