散結(jié)通脈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

孫 堯，王藝璇，劉愛(ài)東，成光宇，張洪銘，解生旭，姜英子*

（1.延邊大學(xué)藥物分析教研室，吉林 延吉 133000；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，長(zhǎng)春 130117；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植化室，長(zhǎng)春 130012）

散結(jié)通脈顆粒為國(guó)家名老中醫(yī)、全國(guó)首屆名中醫(yī)、國(guó)務(wù)院特殊津貼獲得者、長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)終身教授、吉林省著名中醫(yī)心血管專(zhuān)家黃永生教授臨床經(jīng)驗(yàn)方劑制成的中藥復(fù)方制劑，主要用于治療痰瘀互結(jié)型冠心病心絞痛。制劑由丹參、水蛭等14 味藥材組成。方中丹參、水蛭為君藥，其功效是促進(jìn)血液在血管中的流動(dòng)，止血破血雙向調(diào)節(jié)；三七、煅花蕊石助君藥活血化瘀定痛，茵陳、澤瀉、茯苓利濕化痰、透熱瀉濁，以上五味藥共為臣藥；砂仁與檀香有理氣散寒止痛開(kāi)胃之功，僵蠶和蟬蛻可防止瘀久成毒化熱生風(fēng)，四者共為佐藥；枳殼、陳皮行氣消痰，竹茹助枳殼、陳皮以滌痰開(kāi)郁，脘痞自除，三者共為使藥。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用TLC 法對(duì)SJTM顆粒中丹參、水蛭、茯苓、澤瀉、枳殼、陳皮進(jìn)行定性鑒別，應(yīng)用HPLC 法對(duì)丹酚酸 B 的含量進(jìn)行定量測(cè)定，為有效控制制劑質(zhì)量，完善質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)過(guò)程及數(shù)據(jù)結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010C 型高效液相色譜儀（日本島津公司）、KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）、電子天平（上海越平科學(xué)儀器制造有限公司）、GOODLOOK-1 000 型薄層色譜成像系統(tǒng)（上海科哲生化科技有限公司）、Milli-Q（MERCK MILLIPORE）。

1.2 試藥 丹酚酸B（批號(hào)：111562-201716，94.1%）、2，3-乙酰澤瀉醇B（批號(hào)：111846-201705，99.7%）柚皮苷（批號(hào)：110722-201714，93.4%、110721-201617，96.1%）新橙皮苷（批號(hào)：111857-201703，99.2%）均購(gòu)置于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

散結(jié)通脈顆粒（批號(hào)：20190401、20190402、20190403）由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院的制劑室提供；水、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 丹參 取SJTM 顆粒5 g 研磨，加0.5%的鹽酸溶液20 mL，超聲30 min，除去沉淀，取澄清液體，液體用乙酸乙酯萃?。? 次，每次20 mL），將2 次萃取得到的上層溶液混合，蒸發(fā)至無(wú)溶劑，以蒸干物制成1 mL 的無(wú)水乙醇溶液為供試品溶液。取對(duì)照藥材（丹參）2 g，與供試品溶液相同方法制得的無(wú)水乙醇溶液作為對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液。以每毫升含0.6 mg的丹酚酸B 甲醇溶液作為該藥材的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，在同一張硅膠G 板上對(duì)所制得的三種溶液進(jìn)行各7 μL 的點(diǎn)樣，在乙酸乙酯-甲苯-三氯甲烷-甲醇-甲酸（4:2:3:0.5:2）中進(jìn)行展開(kāi)，取出，揮干展開(kāi)劑后均勻噴灑2%三氯化鐵乙醇溶液作為顯色劑，晾干，在105 ℃條件下加熱至顯色斑點(diǎn)逐漸清楚，在太陽(yáng)光下觀察[2]。被測(cè)顆粒的色譜圖中，在與對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液和對(duì)照品溶液的色譜圖對(duì)應(yīng)的位置上，均存在顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖 1 。

圖1 散結(jié)通脈顆粒丹參薄層鑒別

2.1.2 水蛭 取10 g SJTM 顆粒研磨，加乙醇60 mL，超聲15 min，除去沉淀，取澄清液體將溶劑蒸干，以蒸干物制成的5 mL 的乙醇溶液，作為供試品溶液。另取對(duì)照藥材（水蛭）1 g，向其中加入乙醇20 mL，與供試品溶液使用相同方法配置得到的乙醇溶液作為對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液。照 薄層色譜法[1]試驗(yàn)，在同一張硅膠G 板上對(duì)所制得的兩種溶液進(jìn)行各8 μL 的點(diǎn)樣，在乙酸乙酯-環(huán)己烷（1:4）中展開(kāi)，取出，均勻噴灑10%的硫酸乙醇作為顯色劑，晾干，105℃下加熱至顯色斑點(diǎn)逐漸清楚，在太陽(yáng)光下觀察[6]。被測(cè)顆粒的色譜圖中，在與對(duì)照藥材 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖對(duì)應(yīng)位置上，均存在顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2 。

圖2 散結(jié)通脈顆粒水蛭薄層鑒別

2.1.3 茯苓 取SJTM 顆粒10 g，研成細(xì)粉，加入50 mL的石油醚（60℃～90℃），超聲30 min，去除沉淀，取澄清液體，蒸發(fā)至無(wú)溶劑，以蒸干物制成的1 mL 甲醇溶液，作為供試品溶液。另取對(duì)照藥材（茯苓）2 g，加20 mL 石油醚（60℃～90℃），與供試品溶液使用相同方法配置得到的甲醇溶液作為對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，在同一張硅膠G 板上對(duì)所制得的兩種溶液進(jìn)行各10 μL 的點(diǎn)樣，在石油醚（60 ℃～90 ℃ ）-甲酸-甲酸乙酯（15:1:5）中展開(kāi)，取出，揮干展開(kāi)劑，在紫外光燈（365 nm）條件下觀察。被測(cè)顆粒色譜圖中，在與對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中對(duì)應(yīng)位置上，均存在相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

圖3 散結(jié)通脈顆粒茯苓薄層鑒別

2.1.4 澤瀉 取SJTM 顆粒5 g，研磨成細(xì)粉，加入乙酸乙酯20 mL 作為溶劑，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，去除沉淀，取澄清液體，使用氧化鋁柱（200～300 目，5 g，內(nèi)徑為1 cm，干法裝柱）進(jìn)行吸附過(guò)濾，用10 mL 的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，蒸干其溶劑，以殘?jiān)瞥? mL 的乙酸乙酯溶液作為供試品溶液。另取對(duì)照藥材（澤瀉）2 g，加入20 mL 甲醇作為溶劑，超聲30 min，去除沉淀，濾液置水浴蒸干甲醇，蒸干物制成1 mL 甲醇溶液，作為對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液。取對(duì)照品（2，3-乙酰澤瀉醇B），制成2 mg/mL 的乙酸乙酯溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[1]，在同一塊硅膠G 板上對(duì)對(duì)照品及對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 μL、供試品溶液16 μL 進(jìn)行點(diǎn)樣，于乙酸乙酯:環(huán)己烷（1:1）中展開(kāi)，夾出，揮干展開(kāi)劑，均勻噴灑10%硫酸乙醇溶液，在 105℃加熱至斑點(diǎn)顯色逐漸清楚，在自然光下觀察。被測(cè)顆粒色譜圖中，在與對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液和對(duì)照品溶液的色譜圖中對(duì)應(yīng)位置上，均存在顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖4。

圖4 散結(jié)通脈顆粒澤瀉薄層鑒別

2.1.5 枳殼 取SJTM 顆粒6 g，研磨成細(xì)粉，加30 mL甲醇作為溶劑，超聲30 min，去除沉淀，取澄清液體將溶劑蒸干，將制成蒸干物制成甲醇溶液，作為供試品溶液。以0.5 mg/mL的柚皮苷、新橙皮苷的甲醇溶液，作為對(duì)照品溶液。取對(duì)照藥材（枳殼）2 g，與供試品溶液使用相同方法配置得到的甲醇溶液，作為對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，在同一張硅膠G板上對(duì)所制得的三種溶液進(jìn)行各1 μL 的點(diǎn)樣，在水-甲醇-氯仿（2:6:13）下層溶液中展開(kāi)，夾出，揮干展開(kāi)劑，均勻噴灑3%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃加熱1min，在波長(zhǎng)為365nm的紫外光燈的條件下觀察。被測(cè)顆粒色譜圖中，在與對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液和對(duì)照品溶液的色譜圖對(duì)應(yīng)位置上，均存在相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖5。

圖5 散結(jié)通脈顆粒枳殼薄層鑒別

2.1.6 陳皮 取本品粉末8 g，加30 mL 甲醇作為溶劑，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，取15 mL 上層清液，濃縮到1 mL，作為供試品溶液。另取對(duì)照藥材（陳皮）2 g，加10 mL 甲醇作為溶劑，超聲30 min，取上清液5 mL，濃縮到1 mL，為對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液。在甲醇中加入橙皮苷至不溶解，以上清液作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，在同一張硅膠G 板上對(duì)所制得的三種溶液進(jìn)行各2 μL 的點(diǎn)樣，在水-乙酸乙酯-甲醇（13:100:17）的條件下展開(kāi)到約3 cm，再在甲苯-水-乙酸乙酯-甲酸（20:1:10:1）的上層溶液進(jìn)行展開(kāi)，展至約8 cm，取出，揮干展開(kāi)劑，均勻噴灑3%三氯化鋁試液作為顯色劑，在紫外光燈（365 nm）的條件下觀察。被測(cè)顆粒色譜圖中，在與對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液和對(duì)照品溶液色譜圖對(duì)應(yīng)位置上，均存在顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖6。

圖6 散結(jié)通脈顆粒陳皮薄層鑒別

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：SHIMADZU VP-ODS 柱（250 mm×4.60 mm，5μm）；流動(dòng)相：以乙腈-0.1%磷酸溶液（22:78）；柱溫：20℃；流速：1.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取丹酚酸B 對(duì)照品適量，精準(zhǔn)稱(chēng)取，制成34 μg/mL 的甲醇-水（8:2）的溶液，得到。

2.2.3 供試品溶液的制備 取SJTM 顆粒適量，研磨成細(xì)粉，精密稱(chēng)定，放入帶有玻璃塞的錐形瓶中，準(zhǔn)確量取甲醇-水（8:2）混合溶液50 mL 加入，加塞密封，稱(chēng)定重量，超聲30 min，放涼至室溫，再稱(chēng)定重量，用原溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，將續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取不含丹參的一日處方量，按方法（2.2.3 項(xiàng)下）制成陰性樣品溶液。

2.2.5 專(zhuān)屬性考察 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按方法（2.2.1 項(xiàng)下）測(cè)定，得到對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照各自的色譜圖，見(jiàn)圖7。在本條件下，樣品色譜中丹酚酸B 的峰前后沒(méi)有雜峰干擾，分離效果較好。

圖7 散結(jié)通脈顆粒高效液相色譜圖

2.2.6 方法學(xué)考察

2.2.6.1 線(xiàn)性關(guān)系的考察 取對(duì)照品溶液（2.2.2 項(xiàng)下），精密吸取1μL、2μL、4μL、8μL、16μL，注入液相色譜儀，按方法（2.2.1項(xiàng)下）測(cè)定。以對(duì)照品的量（X）為水平坐標(biāo)，對(duì)照品的峰面積（Y）為垂直坐標(biāo)，得丹酚酸B的回歸方程為Y=847486.3615X-2168.1250，r=0.9999。結(jié)果顯示，丹酚酸B在0.034～0.544μg范圍中對(duì)照品含量與峰面積呈較好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.6.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液（2.2.2 項(xiàng)下），精密吸取10 μL，按“2.2.1 項(xiàng)下”色譜條件連續(xù)測(cè)定5次，結(jié)果丹酚酸B 的RSD 為0.60%，顯示該儀器精密度較好。

2.2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（2.2.3 項(xiàng)下），準(zhǔn)確吸取10 μL，按“2.2.1 項(xiàng)下”色譜條件在0、2、4、8、24 h 分別進(jìn)樣進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果丹酚酸B峰面積的RSD 為0.50%，顯示供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次SJTM 顆粒適量，按方法（2.2.3 項(xiàng)下）平行制備供試品溶液5 份，分別精密吸取10 μL，按“2.2.1 項(xiàng)下”色譜條件測(cè)定，結(jié)果丹酚酸B含量的RSD為0.14%，顯示該方法重復(fù)性較好。

2.2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量SJTM 顆粒5 份（丹酚酸B 含量2.310 5 mg/g），分別精密加入丹酚酸B 對(duì)照品（1.25 mg/mL）1 mL，按“2.2.1 項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。計(jì)算回收率，丹酚酸B 平均回收率為 98.24%，RSD=1.95%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.3 樣品含量測(cè)定 依上述含量測(cè)定項(xiàng)下方法，對(duì)3批樣品中丹酚酸B 含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

3 討論

丹參薄層鑒別[2-4]曾以丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 混合溶液為對(duì)照，在三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（6:4:8:1:4）及藥典法中乙酸乙酯-石油醚（60℃～90℃）（1:4）的條件下分別展開(kāi)過(guò)，但在陰性樣品中丹參酮ⅡA 處存在干擾，所以只以丹酚酸B為指標(biāo)，在甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:3:4:0.5:2）條件下展開(kāi)；同時(shí)水蛭[5-6]、茯苓[7-8]、澤瀉[9-10]、枳殼[11-12]、陳皮[13-14]均經(jīng)過(guò)薄層方法學(xué)考察。

丹酚酸B 曾考察了不同的色譜柱、流速、柱溫、流動(dòng)相，不同的提取方法、溶劑種類(lèi)、溶劑用量和提取時(shí)間，最終確定了準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定可行的方法，為后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了較好的基礎(chǔ)。